第十章双水相萃取PPT课件
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《双水相萃取技术》课件
影响因素
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
双水相萃取ppt
双水相萃取原理
• 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间 的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后, 由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在 双水相体系中分配系数K可用下式表示：K= C上/ C下 • InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc 式中，Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献； Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献； Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献； Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献； Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献； Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。
双水相萃取技术
及其在生物医药上的应用ห้องสมุดไป่ตู้
双水相萃取技术
• • • • 双水相体系的概念与形成 双水相萃取原理 双水相萃取的技术特征 双水相萃取的工艺流程
双水相体系的概念与形成
• 传统的双水相体系是指双高聚物双水相 体系，其成相机理是由于高聚物分子的 空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形 成均一相，从而具有分离倾向，在一定 条件下即可分为二相。一般认为只要两 聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混 合时就可发生相分离，且憎水程度相差 越大，相分离的倾向也就越大。
双水相萃取原则流程
连续双水相萃取
双水相萃取技术在生物医药上的应用
1.基因工程药物的分离与提取 2.酶工程药物的分离与提取 3.抗生素的分离与提取
4.天然植物药用有效成分的分离与提取
基因工程药物的分离与提取
目的的产物在转化液中的浓度很低 ,且对温度、 酸、碱和有机溶剂较敏感 ,容易失活和变性 ,若 以常规分离手段处理 ,产品的收率较低且纯度不 高 ,而双水相萃取技术可以保证产物在温和的条 件下得以分离和纯化。其中有代表性的工作是用 PEG4000/ 磷酸盐从重组大肠杆菌(E. Coli) 碎 片中提取人生长激素(hGH) ,采用三级错流连续 萃取 ,处理是为 15L/ h ,收率达 80 %。同样 , 用 PEG8000/ Na2SO4双水相系统从重组大肠杆菌 中分离 IGF - I,收率 90 %。
生物分工程双水相萃取 66页PPT文档
(3) 回收率高 提纯倍数可达2-20倍, 如体系选择适当,回 收率可达80%-90%以上,且分离速度快。
三、双水相体系的应用
应用：在生物化学、细胞生 物学、生物化工等有机物分 离提纯方面得到了较为广泛 的应用，如：分离提纯蛋白 质、生物酶、菌体、细胞、 氨基酸、抗生素以及亲水性 生物大分子等。
KS
Y2,3-BD(% ) Yacetoin(% ) Rglucose(% ) Rcells(% ) R protein(% )
1 9.88 10.19 0.031 318.7 93.0
93.5
94.9
99.6
85.5
2 9.65 10.06 0.030 321.7 93.0
93.5
94.8
99.5
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
8.3和91.4%
乙醇/硫酸铵APTE放大实验
表2.3 体系放大过程中2,3-丁二醇分配的变化
分配系数(K)
4）外加电场的影响
当在两相分界的垂直方面上加上电场时由于 电位差增加而使分配系数发生改变 如用PEG8000 /DextranＴ 500体系分离肌红蛋白,在外加48.1 Ｖ/cm的电场强度40 min后,分配系数Ｋ从0.81变 为38.7,上相回收率从44.7%增高到98.0% 。
5) 温度的影响
ln m H(H F F H S )F F S Z
RT
影响分配平衡的因素
1）成相聚合物
成相聚合物的相对分子量降低、浓度升高 有利于增大溶质的分配系数。
三、双水相体系的应用
应用：在生物化学、细胞生 物学、生物化工等有机物分 离提纯方面得到了较为广泛 的应用，如：分离提纯蛋白 质、生物酶、菌体、细胞、 氨基酸、抗生素以及亲水性 生物大分子等。
KS
Y2,3-BD(% ) Yacetoin(% ) Rglucose(% ) Rcells(% ) R protein(% )
1 9.88 10.19 0.031 318.7 93.0
93.5
94.9
99.6
85.5
2 9.65 10.06 0.030 321.7 93.0
93.5
94.8
99.5
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
8.3和91.4%
乙醇/硫酸铵APTE放大实验
表2.3 体系放大过程中2,3-丁二醇分配的变化
分配系数(K)
4）外加电场的影响
当在两相分界的垂直方面上加上电场时由于 电位差增加而使分配系数发生改变 如用PEG8000 /DextranＴ 500体系分离肌红蛋白,在外加48.1 Ｖ/cm的电场强度40 min后,分配系数Ｋ从0.81变 为38.7,上相回收率从44.7%增高到98.0% 。
5) 温度的影响
ln m H(H F F H S )F F S Z
RT
影响分配平衡的因素
1）成相聚合物
成相聚合物的相对分子量降低、浓度升高 有利于增大溶质的分配系数。
南农 生物分离工程 双水相萃取课件
双水相萃取的原理
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间 的各种相互作用，主要有 静电作用 疏水作用 生物亲和作用 分配系数是各种相互作用的和:
lnm=lnme+lnmh+lnml
me，mh，ml
分别为静电作用、疏水作用和生物亲 和作用对溶质分配系数的贡献。
1．静电作用 非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响， BrΦnsted方程推导下述分配系数表达式：
2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素 钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液 层。
葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
双水相的形成
聚合物的不相溶性(incompatibility)： 当两种高分子聚合物之间存在相互排斥 作用时，当达到平衡时，即形成分别富 含不同聚合物的两相。 除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的 混合溶液也可形成双水相，
双水相的形成
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol)
Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖(dextran)
Phase 1: 4% polyethylene glycol in water Phase 2 : 4% dextran in water
Dr = 0.2 g / cc s = 1.2 dyne / cm PEG Dextran
1 双水相中聚合物及其分子量的影响 降低聚合物的分子量，则蛋白质易分配于富含 该聚合物的相中 聚合物的疏水性按下列次序递增:
葡萄糖硫酸盐< 甲基葡萄糖< 葡萄糖<羟丙基葡聚糖 < 甲基纤维素< 聚乙烯醇<聚乙二醇< 聚丙三醇
同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加
酶双水相萃取.pptx
形
互不相容的两相，两种聚合物分别溶于两
成
相中，即构成双水相系统。这主要是由于 聚合物分子的空间位阻作用，相互间无法
过
渗透，而且有强烈的相分离倾向，在一定
程
条件下即可分为两相。一般认为，聚合物
水溶液的疏水性差异是产生相分离的主要
推动力，且蔬水性差异越大，相分离倾向
也越大。
第3页/共21页
1.2、双水相系统中作用力的表现
substrate第15页/共21页
product
Enzymetic reaction with ATPS
enzyme enzyme
第16页/共21页
enzyme
5.1、蛋白质双水相萃取的优点
两相含水量均很
高，与蛋白质有
可用于蛋白质的
很好的相容性， 且不易使蛋白质
1
精制，经过几次
4 连续的双水相萃
作用力 为斥力
形成双水相系统
双水相
作用力 形成两相，一相为两 为引力 高聚物，一相为水相 均一相
作用力无 强烈引力
完全互溶，形成均一相
和斥力
两相
第4页/共21页
1.3、几种常见的双水相体系
类型
非离子型聚合物/ 非离子 型聚合物
高分子电解质/非离子型聚 合物 高分子电解质/高分子电解 质 聚合物/ 低分子量化合物
失活。
取，得到更高纯
度的蛋白质。
所需设备简 单，且处理 容量大，利 于大规模生 产。
2
3
分离纯化后
的蛋白质产
物纯度很高，
有很大使用
价值。
第17页/共21页
5.2、蛋白质双水相萃取的缺点
系统中水的含量 高，分离后的蛋 白质液浓度低， 需要浓缩以提高 产物的浓度。
双水相萃取(精选双水相萃取PPT,超级有用)概论
双水相萃取原理示意图
基本原理
双水相萃取与一般的水—有机物萃取的原理相似, 都 是依据物质在两相间的选择性分配。
当萃取体系的性质不同, 物质进入双水相体系后, 由于 分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与 分子之间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的浓度不 同, 从而达到分离的目的。
溶质(包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以 及贵金属的络合物、中草药成分等)在双水相体系 中服从Nernst分配定律:
[3]Kula M R, Krone K H, Hustedt H. Advances in biochemical Engineering, edited by Fiechte A, Berlin, Heideberg, New York 1982,24:73~118 [4] Hustedt H, Krone K H, Menge U, et al. Protein recovery using aqueous twophasw system[J]. Trends in Biotechnol, 1985,31(6):139
在水溶液中，聚合物的长链分子通过氢键同周 围的水分子发生强烈地相互作用，每一个氧原子 结合两个水分子，使溶液中的PEG分子被一层高 度有序的水合作用层所包围。葡聚糖虽无与PEG 类似的结构，但同样，分子中的羟基通过氢键作 用在分子周围形成水分子层。
基本原理
某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合， 两者浓度达到一定值时，也会分为两相，形 成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一 种解释为‘盐析’作用。
[12] Silva L H M dMeirelles A J .Protein Partitioning[J].J.Chem.Eng.Data,2001,46(2):251-255. [13] Salabat A,Abnosi M H,Motahari A.Investigation of Amino Acid Partitioning in Aqueous TwoPhase Systems Containing Polyethylene Glycol and Inorganic Salts[J].J.Chem.Eng.Data,2008,53(9):2018—2021.
双水相萃取ppt
4.2、蛋白质双水相萃取与酶促反应
Enzymetic reaction
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme
substrate
product
双水相萃取技术的发展趋势
解决易乳化、相分 离时间长、成相聚 合物的成本较高、 水溶性高聚物粘度 较大且不易定量控 制等问题
1
4
与其它技术结合 的多元化利用
3.1、 蛋白质双水相萃取体系常用聚合物
聚乙二醇 -葡聚糖
聚乙二醇 -磷酸盐
无毒原则
3.2、影响蛋白质分配系数的因素
两相的 两相溶 组成
液的比 例
聚合物的分子 质量、浓度、 极性及离子的 种类、浓度、 电荷等
温度、 蛋白质的 pH值 分子质量、等 电荷、极 性
在很大的浓度范围内，被 分离蛋白质的分配系数与 浓度无关，而与被分离蛋 白质的性质及选定的双水 相系统的性质有关
3 ）无机盐的循环
一种方法是将含磷酸钠的盐相冷却到6 ℃， 使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一 种 是用电 渗析法 、膜分 离法回 收盐类 或除 去 PEG 相的盐。双水相萃取所用的设备一般都是 其他两相体系如水-有机溶剂体系所通用的设备， 商业化的混合器-沉淀器系统以及离心分离机已 成功应用于双水相萃取。用磁性分离等新技术 也可提高两相分离。尽管刚开始应用时，大多 数双水相萃取是间歇式的，但此技术更适合于 错流萃取的连续生产，这样可有效利用空间和 时间，尤其是在与其他分离技术如凝胶过滤、 膜分离等相结合使用时。
LOGO
双水相萃取技术的应用概 况及进展
姓名：白玮丽 学号：s1210002 专业：生物化工
Contents
生物工艺下游技术双水相萃取课件PPT
利用上式可确定不同ATPS的HF值.如 在pH = pI的ATPS中, pro的m0与HF值之 间呈线性关系, 则直线的斜率定义为该蛋 白质的HFS
图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。 图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增 大而增大。将盐对pro的HF影响上式得：
其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。 因此，m的一般形式
系线： HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:
双节线上两点的直线。
双节线 均相区
临界点
两相区 系线
系线反映的信息
A 杠杆规则：系线上各点均 为分成组成相同，而体积 不同的两相。两相体积近 似服从杠杆规则
两水相萃取
杠杆定律 图中W0与NaCl浓度关系为:
这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,但对于可溶性蛋白质.
RH-aa相对疏水性 是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别 确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=0.所 以,上式中的B为:
mGAly 为TPGSl中y 分的配分系配系数数. 与所其以R, Hp值H=呈p线L 时性a关a系在, 直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图 为测定实例.
Pro表面疏水性(HFS,
因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模 生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。
其中双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术是近年来 出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。
双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可 以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5 倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率 上还是成本上都要优越得多。
19.4 影响蛋白质m的综合因素
图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。 图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增 大而增大。将盐对pro的HF影响上式得：
其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。 因此，m的一般形式
系线： HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:
双节线上两点的直线。
双节线 均相区
临界点
两相区 系线
系线反映的信息
A 杠杆规则：系线上各点均 为分成组成相同，而体积 不同的两相。两相体积近 似服从杠杆规则
两水相萃取
杠杆定律 图中W0与NaCl浓度关系为:
这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,但对于可溶性蛋白质.
RH-aa相对疏水性 是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别 确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=0.所 以,上式中的B为:
mGAly 为TPGSl中y 分的配分系配系数数. 与所其以R, Hp值H=呈p线L 时性a关a系在, 直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图 为测定实例.
Pro表面疏水性(HFS,
因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模 生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。
其中双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术是近年来 出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。
双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可 以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5 倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率 上还是成本上都要优越得多。
19.4 影响蛋白质m的综合因素
《两水相萃取法》PPT课件
精选ppt
17
当系线向下移动时，长度逐渐减小，这说明两相的差别 减小，当达到K点时，系线的长度为0，两相间差别消失， 点K称为临界点或褶点。
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18
双节线的位置形状与聚合物的分子量有关。分子量越高， 相分离所需的浓度越低；两种聚合物的分子量相差越大，双 节线的形状越不对称。
精选ppt
19
三、分配理论
精选ppt
46
如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流 过程操作方法下，用超滤或渗析的膜过滤回收。
膜分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物 的最佳方法。
精选ppt
47
如果蛋白质积聚在聚乙二醇中，可以通过加入盐来精 制，加入的盐导致蛋白质在盐相中重新分配。
PEG的分离同样可以用膜分离来实现，即用选择性孔 径较大的半透膜来截留蛋白质，同时排除PEG进行回收。
精选ppt
30
如上所述，影响分配系数的因素很多，而且这些 因素相互间又有影响，因此，目前尚不可能定量地关 联分配系数与能独立测定的蛋白质的一些分子性质之 间的关系。适宜的操作条件，只能通过实验得到。
实验可很方便地在10 ml有刻度的离心试管中进 行。如检定工作跟得上，则在几天内就可求得所需的 萃取条件。但有时液体粘度比较大，用吸管操作时容 易引起误差，需要注意。
精选ppt
43
（五）、温度
温度影响相图，特别在临界点附近，尤为显著，因而 也影响分配系数。但是在离临界点较远时，这种影响较小。
大生产中，总采用常温，可节约冷冻费用，这是由于 聚合物对蛋白质有稳定作用，不会引起损失。同时，温度 高时，粘度较低，有利于相的分离操作。
精选ppt
44
（六）、荷电PEG作为成相聚合物
双水相萃取详细资料(ppt 44页)
双水相萃取
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
➢大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 ➢蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 ➢有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
使蛋白质易分配于富含该PEG的相中，使分配系数 增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降 低，这是一条普遍规律
这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲 水性物质的分配产生较大的影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增大而 增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓 度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏 水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含 PEG相中聚集，而转向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易分配 于富含PEG的相了
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
➢大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 ➢蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 ➢有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
使蛋白质易分配于富含该PEG的相中，使分配系数 增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降 低，这是一条普遍规律
这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲 水性物质的分配产生较大的影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增大而 增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓 度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏 水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含 PEG相中聚集，而转向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易分配 于富含PEG的相了
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
(生化工程课件)两水相萃取
双水相萃取应用得最多的是胞内酶的提取。 这种温和的萃取不仅有利于保护目的物的生物活 性，而且目的蛋白得率高，纯度高，但目的物还含 有少量的核酸和多糖，进一步提高目的蛋白的纯度， 可从双水相体系和萃取操作方式两方面进行改进。 PEG衍生物：在PEG上引入亲和基团或离子基团； 采用多级萃取。
在两水相系统中进行转化翻译功能，如 酶促反应，可以把产物移入另一相中， 消除产物抑制，因而提高了产率。这实 际上是一种反应和分离耦合的过程，有 时也称为萃取生物转化；如果发生的是 一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因 而此时也可以把两水相系统称为两水相 反应器。
相 图
相图
双结线， 上相（T，轻相） 下相（B，重相） 结点 临界点 系线
杠杆定律
19.3 双水相萃取过程的理论基础
表面自由能的影响 表面电荷的影响
表面积
电荷
3、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。
CT K= ——
CB Ct、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响； (2)体系中无机盐离子的影响； (3)体系PH的影响； (4)体系温度的影响； (5)体系中微生物的影响。
四、双水相萃取的应用
1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取。 目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。 原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞 破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞 碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离 的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以 及酶的进一步精制。
在两水相系统中进行转化翻译功能，如 酶促反应，可以把产物移入另一相中， 消除产物抑制，因而提高了产率。这实 际上是一种反应和分离耦合的过程，有 时也称为萃取生物转化；如果发生的是 一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因 而此时也可以把两水相系统称为两水相 反应器。
相 图
相图
双结线， 上相（T，轻相） 下相（B，重相） 结点 临界点 系线
杠杆定律
19.3 双水相萃取过程的理论基础
表面自由能的影响 表面电荷的影响
表面积
电荷
3、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。
CT K= ——
CB Ct、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响； (2)体系中无机盐离子的影响； (3)体系PH的影响； (4)体系温度的影响； (5)体系中微生物的影响。
四、双水相萃取的应用
1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取。 目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。 原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞 破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞 碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离 的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以 及酶的进一步精制。
双水相萃取与应用课件
• 溶剂对目标组分选择性强，大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程简化，易于工业放大和连续操作。
• 分相时间短，常温常压下自然分相时间一般为5-10min。
• 目标产物的分配系数一般大于3，大部分情况下目标产物的收率较高。
• 聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度，以及体系的pH值等多种因素都可以对被萃取物质在两相的分配产生影响，因此 可以利用多种手段来使反应达到最佳条件。
双节线
葡聚糖（%） PEG/葡聚糖系统相图
相图中TCB连线为一双节线，双节线下方为单相区； 双节线上方为两相区。如果系统组成处于该区，如M点时， 系统分为两相，而上相和下相的组成分别为通过M点与双 节线相交的T和B点相对应的组成。上相主要含有PEG，下 相主要含有葡聚糖或盐。两相平衡时，符合杠杆规则。 当用υ T代表上相体积，υ B代表下相体积时，则
A
聚乙二醇(PEG)
几种典型双水相系统
B C
硫酸葡聚糖酸钠 羧甲基葡聚糖酸钠 羧甲基葡聚糖酸钠
D
聚乙二醇
A, B, C, D, E,
聚乙二醇 葡聚糖 两者均为非离子性聚合物, 一种非离子性聚合物，另一种为带电荷的聚电解质 两者均为聚电解质, 一种聚合物，另一种为盐。 一种聚合物，另一种为有机小分子
E
某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合，两者浓度达到一定值时， 也会分为两相，形成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一种解释为“ 盐析”作用。 无机盐和简单的有机盐均可，其成相相对能力与其盐析能力次序基 本一致。阴离子作用比阳离子重要，多原子离子比单原子离子更有效， 成相浓度低。大而电荷密度低的单原子阴离子容易与PEG分子中 的氧 偶极子发生作用，成相浓度高，无法使用。但它们可以作为中性盐添加 组分加入聚合物/聚合物和聚合物/盐系统中，用于改变分配系数。 对于聚合物/盐系统，因盐比葡聚糖便宜得多，使得聚乙二醇(PEG)/ 盐系统具有工业上应用优势。
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第十章 双水相萃取
双水相萃取（aqueous two-phase extraction）是利用物质 在互不相溶的两水相间分配系数的差异来实现分离的一 新型分离技术。
它具有收率高、成本低、可连续化操作等技术优势，已被 广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域， 进行生物转化，蛋白质、核酸等产品的分离纯化。
系总组成位于双节点曲线上方的区域，体系就会形成两相。上相富集了
高聚物Q，下相富集了高聚物P。用A点代表体系总组成，B点和C点分别 代表互相平衡的上相和下相组成，称为节点。A、B、C三点在一条直线
上，称为系线。
.
12
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
图a和b分别为PEG/Dx和PE. G/KPi系统的典型相图
.
14
10.3双水相中的分配系数及影响分配的因素
与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用
k=c1/c2表示。为简便起见，用c1 和c2分别表示平衡状态下上
相和下相中溶质的总浓度。
溶质在双水相中的分配受表面自由能、表面电荷、疏水作用
及生物亲和作用等因素的影响，其中表面自由能、表面电荷
对分配行为的影响最为重要，因而对这两方面的理论研究也
• 氢键 • 电荷力 • 疏水作用 • 范德华力 • 构象效应
.
8
10.2双水相的形成及制备
聚合物的不相溶性(incompatibility)： 当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分 子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相 比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排 斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的 两相。 这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不 相容性。
.
物质Q的名称
聚乙二醇 聚乙烯醇
葡萄糖（Dex） 羟丙基葡萄糖
聚乙烯醇 葡萄糖 (Dex) 聚乙烯吡咯烷酮
聚丙二醇、聚乙二醇 甲基纤维素
羧甲基纤维素钠盐
磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠 硫酸镁、酒石酸钾钠
11
图中把均相区与两相区分开的曲线，称为双节点曲线。如果体系总组成
位于双节点曲线下方的区域，两高聚物均匀溶于水中而不分相。如果体
• 是否分层或混合成一相，取决于：
▪ 熵增——与分子数目有关 ▪ 分子间作用力——与分子大小有关
▪ 可以构成双水相的体系有：
• 离子型高聚物－非离子型高聚物（分子间斥力） ▪ PEG－DEXTRAN
• 高聚物－相对低分子量化合物（盐析作用）
▪ PEG－硫酸铵
.
7
双水相萃取的原理
▪ 依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相 互作用：
.
1
用此方法提纯的酶已达数十种，其分离也达到 了相当规模。
近年来又进行了双水相萃取氨基酸类和病毒小
分子物质的研究，大大扩展了应用范畴并提
高了选择性，使双水相萃取技术具有更大的
潜力和美好的发展前景。
.
2
▪ 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物 与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之 间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合 物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成 不互溶的两相。
▪ PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生
物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，
下相富含无机盐。
.
10
典型的双水相体系
物质类型
物质P的名称
两种非离子型聚合物
聚丙二醇
聚乙二醇（PEG）
P为带电荷聚电解质
P Q都为聚电解质 P为聚合物 Q为盐类
硫酸葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐 聚乙二醇
比较深入。
溶质分配的理论研究对双水相萃取起到指导作用，使萃取过
程可通过控制相关的影响因素而得到优化。
.
15
影响物质在双水相系统中分配的因素主要有:
双水相系统的聚合物组成(包括聚合物类型、平均分子量);
盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值);
溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点);
体系的温度等;
.
16
▪ 这些参数并不是独立地起作用。要预测溶质在双水 相系统间的分配系数是困难的。
双水相萃取法和传统的分离方法(如盐析或有机溶剂沉淀等)相比 也有很大的优势，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方 法,设备需用量要少3～10倍，因此已被广泛地应用在生物化学、 细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病 毒等产品的分离纯化和分析等。
用ห้องสมุดไป่ตู้法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，
.
9
▪ 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二 醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素 (methylcellulose)/葡聚糖等。
▪ 双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相 的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合 物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。
13
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两
相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，
即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中
的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
.
3
▪ 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这 两相中水分都占很大比例(85％一95％)，活 性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可 以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶 剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶 于有机溶剂的缺点。
.
4
双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可 以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍， 与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是 成本上都要优越得多。
.
5
双水相萃取的优点
▪ 操作条件温和，在常温常压下进行；
▪ 两相的界面张力小，一般在10-4N／cm量级，两相 易分散，
▪ 两相的相比随操作条件而变化；
▪ 上下两相密度差小，一般在10 g/L。因此两相分离 较困难，目前这方面研究较多
▪ 易于连续操作，处理量大，适合工业应用。
.
6
▪ 双水相萃取是利用物质在不相溶的，两水相间分 配系数的差异进行萃取的方法
双水相萃取（aqueous two-phase extraction）是利用物质 在互不相溶的两水相间分配系数的差异来实现分离的一 新型分离技术。
它具有收率高、成本低、可连续化操作等技术优势，已被 广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域， 进行生物转化，蛋白质、核酸等产品的分离纯化。
系总组成位于双节点曲线上方的区域，体系就会形成两相。上相富集了
高聚物Q，下相富集了高聚物P。用A点代表体系总组成，B点和C点分别 代表互相平衡的上相和下相组成，称为节点。A、B、C三点在一条直线
上，称为系线。
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12
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
图a和b分别为PEG/Dx和PE. G/KPi系统的典型相图
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10.3双水相中的分配系数及影响分配的因素
与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用
k=c1/c2表示。为简便起见，用c1 和c2分别表示平衡状态下上
相和下相中溶质的总浓度。
溶质在双水相中的分配受表面自由能、表面电荷、疏水作用
及生物亲和作用等因素的影响，其中表面自由能、表面电荷
对分配行为的影响最为重要，因而对这两方面的理论研究也
• 氢键 • 电荷力 • 疏水作用 • 范德华力 • 构象效应
.
8
10.2双水相的形成及制备
聚合物的不相溶性(incompatibility)： 当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分 子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相 比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排 斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的 两相。 这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不 相容性。
.
物质Q的名称
聚乙二醇 聚乙烯醇
葡萄糖（Dex） 羟丙基葡萄糖
聚乙烯醇 葡萄糖 (Dex) 聚乙烯吡咯烷酮
聚丙二醇、聚乙二醇 甲基纤维素
羧甲基纤维素钠盐
磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠 硫酸镁、酒石酸钾钠
11
图中把均相区与两相区分开的曲线，称为双节点曲线。如果体系总组成
位于双节点曲线下方的区域，两高聚物均匀溶于水中而不分相。如果体
• 是否分层或混合成一相，取决于：
▪ 熵增——与分子数目有关 ▪ 分子间作用力——与分子大小有关
▪ 可以构成双水相的体系有：
• 离子型高聚物－非离子型高聚物（分子间斥力） ▪ PEG－DEXTRAN
• 高聚物－相对低分子量化合物（盐析作用）
▪ PEG－硫酸铵
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7
双水相萃取的原理
▪ 依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相 互作用：
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1
用此方法提纯的酶已达数十种，其分离也达到 了相当规模。
近年来又进行了双水相萃取氨基酸类和病毒小
分子物质的研究，大大扩展了应用范畴并提
高了选择性，使双水相萃取技术具有更大的
潜力和美好的发展前景。
.
2
▪ 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物 与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之 间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合 物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成 不互溶的两相。
▪ PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生
物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，
下相富含无机盐。
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10
典型的双水相体系
物质类型
物质P的名称
两种非离子型聚合物
聚丙二醇
聚乙二醇（PEG）
P为带电荷聚电解质
P Q都为聚电解质 P为聚合物 Q为盐类
硫酸葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐 羧甲基葡聚糖钠盐 聚乙二醇
比较深入。
溶质分配的理论研究对双水相萃取起到指导作用，使萃取过
程可通过控制相关的影响因素而得到优化。
.
15
影响物质在双水相系统中分配的因素主要有:
双水相系统的聚合物组成(包括聚合物类型、平均分子量);
盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值);
溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点);
体系的温度等;
.
16
▪ 这些参数并不是独立地起作用。要预测溶质在双水 相系统间的分配系数是困难的。
双水相萃取法和传统的分离方法(如盐析或有机溶剂沉淀等)相比 也有很大的优势，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方 法,设备需用量要少3～10倍，因此已被广泛地应用在生物化学、 细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病 毒等产品的分离纯化和分析等。
用ห้องสมุดไป่ตู้法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，
.
9
▪ 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二 醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素 (methylcellulose)/葡聚糖等。
▪ 双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相 的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合 物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。
13
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两
相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，
即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中
的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
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▪ 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这 两相中水分都占很大比例(85％一95％)，活 性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可 以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶 剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶 于有机溶剂的缺点。
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双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可 以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍， 与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是 成本上都要优越得多。
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5
双水相萃取的优点
▪ 操作条件温和，在常温常压下进行；
▪ 两相的界面张力小，一般在10-4N／cm量级，两相 易分散，
▪ 两相的相比随操作条件而变化；
▪ 上下两相密度差小，一般在10 g/L。因此两相分离 较困难，目前这方面研究较多
▪ 易于连续操作，处理量大，适合工业应用。
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▪ 双水相萃取是利用物质在不相溶的，两水相间分 配系数的差异进行萃取的方法