双水相萃取实验

一、双水相系统的相图绘制
1.实验目的
了解制作双水相系统的相图的方法，加深对相图的认识。

2.实验原理
相图是研究两水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。

图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。

曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。

结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。

组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。

即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。

又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。

图1 A-B-水双水相体系相图
Figure 1 The phase diagram of the A-B-H2O aqueous two-phase system 3.实验器材和试剂
（1）器材：电子台秤，漩涡混合器，大试管，滴定管，密度计，温度计。

（2）试剂：聚乙二醇，硫酸铵，硫酸镁。

4.操作方法
（1）溶液的配制
配制40%的盐（硫酸铵或硫酸镁）溶液
配制40%的聚乙二醇溶液，液体聚乙二醇可用纯溶液。

（2）相图的制作
精确称取一定质量（0.7000g左右）PEG溶液于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。

记录盐溶液的加量(g)。

然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。

计算每次达到浑浊
时，PEG和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。

表1相图制作表
编
号水/g
(NH4)2SO4溶
液加量/g
纯(NH4)2SO4累
计量/g
溶液累计总量
/g
(NH4)2SO4质量分
数/%
PEG 质量
分数/%
1 0.5 3.1315 0.895 4.3786 20.4 4.79
2 0.
3 2.1792 1.5186 5.9511 21.85 3.02
3 0.3 2.0456 2.1 9.2867 22.65 2.26
4 0.3 3.1372 3.0 12.6738 23.68 1.65
5 0.5 6.0769 4.7 19.327
6 24.52 1.08
6 0.5 6.1909 6.5 26.0138 25.02 0.8
7 0.5 6.8585 8.5 33.4596 25.32 0.62
根据以上数据以(NH4)2SO4质量分数为横坐标，以PEG质量分数为纵坐标即可做出相图。

二、双水相系统比例的选择
根据相图，选择五个成相比例。

三、蛋白酶酶活标准曲线的绘制—— Folin酚法或紫外分光光度法
紫外分光光度法测蛋白酶酶活
1．原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。

根据吸光度计算其酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

2．试剂和溶液
2.1 三氯乙酸c=0.4mol/L：称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L
2.3 盐酸溶液c（HCl）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1mol/L HCl:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

0.1mol/L HCl：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

2.4 缓冲溶液
a.磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）
0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b.乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c.硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶
甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。

上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。

2.5 10g/L酪素溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。

此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

2.6 100ug/mL L-酪氨酸标准溶液
a．称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。

b．吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。

此溶液在冰箱内贮存或立即使用。

3.仪器和设备
3.1 恒温水浴40±0.2℃。

3.2 紫外分光光度计
4 分析步骤
4.1 求K值
按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。

4.2 测定
吸取适量稀释的酶液 2.00mL、酪素 2.00mL、三氯乙酸 4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。

滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。

a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；
b、按下列程序操作：
试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）
加酶液2.00 mL 加酶液2.00 mL
40±0.2℃，2min 40±0.2℃，2min
加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）40±0.2℃，10min（精确计时）40±0.2℃，10min（精确计时）
加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）
继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心
于275nm波长，测上清液吸光值于275nm波长，测上清液吸光值c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4.2。

标准曲线作同样处理。

5 计算
在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。

X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E
式中：X——样品的酶活力，(u/mL)；
A——试样溶液的平均吸光度；
K——吸光常数；
8——反应试剂的总体积，mL；
2——吸取酶液2.00mL；
1/10——反应时间10min，以1min计；
n——稀释倍数
E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77）。

所得结果表示至整数。

6 结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3％。

四、双水相系统在蛋白酶分离中的应用
利用选择的五个成相体系对蛋白酶进行分离纯化，确定一个最佳分离体系。

1.向干燥的离心管中按比例加入一定质量PEG和盐溶液，先用玻璃棒搅匀，再在混合器上混匀，加入2mL的酶液，在混合器上混合，调pH，静置15分钟，离心10分钟(2000r/min)。

2.读取上下相体积及总体积，用1mL注射器分别取上、下相1mL，分别定容至100mL，测其酶活力。

3.测原酶液酶活力：用移液管吸取1mL发酵液，定容至100mL，测其酶活力为原酶液酶活力。