诱导性多能干细胞的研究进展及其在再生医学上的应用

文献综述诱导性多能干细胞的研究进展及其在再生医学上的应用摘要：通过特定转录因子的过表达使体细胞重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells， iPS 细胞），这一成果引起了整个生命科学领域的广泛关注. 由于iPS 细胞不仅具有与人类胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES 细胞）相似的基本特征，而且与 ES 细胞相比，不存在免疫排斥和伦理道德问题，因此，具有重要的临床应用潜能. 目前， iPS 细胞主要用于细胞分化和移植，并可提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法. 从 iPS 细胞的产生、诱导方法、生物学特征和在再生医学中的应用作以研究！关键词：诱导性多能干细胞；胚胎干细胞；重编程；再生医学正文1iPS 细胞的产生主要经历了 3 个大的阶段. 1981 年，小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES 细胞）建系干细胞是近 30 年来生物学发展最快的领域（Evans 和 Kaufman），这些具有全能性的细胞在体外可以诱导分化为不同类型的细胞，为组织修复开辟了新途径. 尽管这些细胞来源于囊胚内细胞团，基本不存在去分化和重编程的问题，但自诞生之日起，就一直深受伦理道德和异体排斥等问题的困扰. 随着克隆羊“多利”的诞生，开创了体细胞在卵母细胞中去分化和重编程的先河. 2000 年，Munsie等从小鼠体细胞核移植囊胚中分离得到了小鼠ES 细胞，从而拉开了治疗性克隆研究的序幕，使利用病人的健康体细胞对自身的病变组织进行修复成为了可能，尽管这一技术可以避免异体移植所造成的排斥反应，但仍然深陷伦理道德争论的漩涡之中.2006 年，Yamanaka 等将 4 个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，进而获得了类似于 ES 细胞的多能性干细胞，即“诱导性多能干细胞”（induced pluripotent stem cells，iPS 细胞）. 2007 年，Yu 等和Takahashi 等又分别采用相同的基因改造的方法将人的体细胞逆转为类ES 细胞，这些划时代的成果不仅解决了利用干细胞进行组织修复所面临的免疫排斥和伦理学问题，在利用病人正常细胞进行组织自我修复方面具有巨大的应用前景，而且是用来研究细胞去分化和基因组重编程的重要途径（不需要胚胎或卵母细胞）. 这个具有里程碑意义的发现揭开了再生医学领域的新篇章.2iPS 细胞的诱导方法迄今为止，短短几年的时间内 iPS 细胞的研究取得了突飞猛进的发展，仅诱导方式而言，从病毒方法如逆转录病毒、慢病毒和腺病毒，到非病毒的转座子载体和蛋白质均能介导外源转录因子诱导产生 iPS 细胞. 利用逆转录病毒和慢病毒载体诱导生成 iPS 细胞时，可能会引起外源基因整合到体细胞基因组，引起插入突变，如果将这些iPS 细胞应用于临床治疗，会存在安全隐患. 因此，Aoi 等利用不与宿主细胞整合的腺病毒、质粒为表达载体瞬时转染靶细胞可以获得iPS 细胞，这对再生医学领域的发展是一个重大进步，但是该方法极低的诱导效率限制了其在实际研究中的应用. 随后，部分研究小组尝试利用Cre/LoxP 系统、oriP/EBNA1 载体及 piggyBac 转座系统等，将外源基因整合到受体细胞中诱导 iPS 细胞，然后再将外源基因从 iPS 细胞的基因组中切除，从而得到不含外源基因整合的iPS 细胞，该系统诱导产生iPS 细胞的效率明显高于腺病毒和质粒载体系统，达到 0.1%～1%. 但是，验证基因组不存在外源插入基因的过程十分繁琐，且在基因剔除后，转座酶识别位点有基因重排现象的发生. 最近，Zhou 等利用融合了 4 种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的蛋白质直接诱导受体细胞为 iPS 细胞. 蛋白直接诱导iPS 细胞在重编程过程中不会涉及任何的遗传修饰，且蛋白容易失活. 从 iPS 细胞临床应用的安全角度来看，它是目前最安全的方法，但是需要进一步提高其诱导效率才有可能被广泛应用.3 iPS 细胞的生物学特征ES 细胞是全能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在体外可以无限增殖. iPS 细胞类似于 ES 细胞，也具有多向分化潜能和发育的全能性，可长期增殖培养并保持高度未分化状态. 在正常培养体系中具有稳定的二倍体核型，Yu 等研究人和鼠 iPS 细胞核型时发现，只在极少数的细胞中出现畸形核，而大多数 iPS 细胞核型正常. 但 Aasen 等发现连续传代培养人 iPS 细胞至第 13 代时畸形核出现的几率显著增加，这与 ES 细胞的生长特性相似. 通过 RT-PCR 和免疫组化发现，iPS 细胞也表达 ES 细胞特异的表面标志，如 SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA-1-81 和 TRA-2-49/6E 等；并且 iPS 细胞具有向 3 个胚层分化的潜能和自我更新能力. 但是，许多研究也发现，iPS 细胞并不等同于 ES 细胞. Takahashi 等［13］通过对人类 iPS 细胞与 ES 细胞的 32 266 个转录产物的全序列基因表达图谱进行分析发现，iPS 细胞的 1 267 个转录产物基因（4%）与 ES 细胞存在 5 倍左右的差异. Niwa 等［14］研究也发现，iPS 细胞中与多能性相关的关键基因（Oct4、Sox2 和 Rex1）的表达水平比人类 ES 细胞系（HSF1 和 H9）低两倍. 下面将从重编程过程中基因表达水平的变化、表观遗传学、发育潜能等方面分析 iPS 细胞的生物学特征.4 iPS发育潜能特性细胞的表观遗传学含有的信息量极大，可能只通过表观遗传学就可鉴定 iPS 细胞. 但是，要了解并选择最严格的检验 iPS 细胞的指标，利用体内实验分析重编程过程、表观遗传学和发育潜能之间的相互作用有重要的意义. 近期，Jaenisch 和 Young 详细地对检验发育潜能的标准及其严格性进行了比较［. 对于iPS 细胞最为严格的检验标准是通过四倍体补偿法形成完全来源于iPS 细胞的成活后代，而体外分化是最不严格的检验指标. 但与 ES 细胞类似，由于伦理道德等问题的限制，这些动物实验只适于对小鼠等动物多能干细胞发育潜能的测定，从而开始检测人类 iPS 细胞发育潜能有效的方法只有体外分化和畸胎瘤的形成.目前，检测iPS 细胞发育潜能较严格的方法主要是由iPS 细胞生成嵌合体动物和畸胎瘤试验. 迄今为止，采用四倍体补偿法来检测 iPS 细胞发育潜能的报道很少. Wernig 等采用四倍体补偿法能使一些iPS 细胞系（包括一个核型异常的细胞系）发育到胚胎阶段，但是其发育程度却不相同，有的能发育到中后期，有的只能发育到胚胎前期，而一些有相似表达图谱、没有任何明显缺陷的iPS细胞系却一直未能生成四倍体胚胎. 至今为止，只有小鼠 iPS 细胞通过与四倍体囊胚嵌合，成功生下具有正常生殖能力的完全由 iPS 细胞发育而来的小鼠，充分说明了 iPS 细胞具有发育为完整个体的能力. 生成四倍体克隆动物效率低的原因可能与一些与重编程无关的原因有关，如：病毒载体漏表达或小的基因片断损伤.5iPS 细胞在再生医学的应用目前，iPS 细胞的生成不再必须通过向细胞基因组内导入外源病毒和基因来实现，其安全性得到了极大提高，并且全能性也得到了不断的验证. 同时，iPS 细胞由患者自身体细胞诱导产生，可以避免伦理、免疫排斥等问题. 因此，iPS 细胞有更广阔的应用前景，在再生医学领域有巨大的应用潜力和优势. 目前，主要用于细胞分化和移植，并可提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法！如下图：（）（）iPS 细胞用于人类疾病的研究4.1在血液疾病方面的研究多项研究在人类血液疾病的小鼠模型中进行了 iPS 细胞应用的尝试，并取得了初步成功. Hanna 等在人源化的镰刀型贫血病小鼠模型上获取成纤维细胞，诱导建立了 iPS 细胞系，然后通过同源重组的方法将病变基因修正，接着把遗传修饰后的 iPS 细胞定向分化为造血祖细胞，导入小鼠体内贫血症状明显改善，这是首次利用在动物疾病模型上的应用逐步开展. Xu 等将由iPS 细胞诱导分化的内皮前体细胞移植到患有血友病小鼠的肝脏中，使病鼠出血不止的症状得到了有效地改善. Raya 等获得了基因修饰后的贫血症患者特异性iPS 细胞，这些iPS 细胞能够分化形成表型正常的髓系和红系的造血祖细胞. 由此可见，iPS 细胞对于治疗一些血液疾病以及为罕见血型患者提供血细胞都具非常有重要的意义.4.2对神经系统疾病的研究iPS 技术在治疗神经系统疾病中显示了很大的用途. Werning 等对已建立的小鼠 iPS 细胞进行体外诱导培养，可以将其诱导分化为神经前体细胞和多巴胺能神经元，并移植到患有帕金森病小鼠体内能减轻其症状. 最近一项研究利用帕金森症患者的皮肤细胞培育出了 iPS 细胞，并能将其分化为多巴胺神经元细胞，这是帕金森症患者大脑中所缺少的一种重要细胞. 因此，其有望成为治疗帕金森症等神经系统疾病的一种方法.4.3在心血管系统疾病的研究Narazaki 等将原始 iPS 细胞诱导出中胚层细胞，并筛选出表达 Flk1（内皮细胞和血细胞最早的分化标志）的干细胞. 之后诱导分化得到了淋巴管内皮细胞以及心肌细胞，并发现由此分化而来的血管内皮细胞能形成类血管，表达几乎所有心肌细胞标志物，如 Nkx2.5、a-MHC、HCN4. 由此证明，利用 iPS 细胞向心血管分化的可行性，也进一步提示 iPS 细胞具有作为细胞移植治疗心血管疾病中种子细胞的潜力. Nelson 等将 Oct4、Sox2、Klf4 与 c-Myc 转入成纤维细胞，使其诱导生成iPS 细胞，接着再将iPS 细胞定向分化为心肌细胞并移植入具有完整免疫系统的成年小鼠梗死心脏内，能够观察到功能性的新生心肌. 因此利用 iPS 细胞有利于修复急性心肌梗塞等疾病. 而 Zhang 等利用 Oct4、Sox2、Nanog 与Lin28 产生的iPS 细胞具有分化为心房、心室和窦房结细胞等的潜能，与 ES 细胞在向心肌分化的潜能方面相似. 目前，虽然还没有 iPS 细胞用于建造心血管疾病模型的报道，但是其应用于建立心血管疾病模型指日可待. 4.4糖尿病Keisuke Tateishi 等利用已建系的iPS 细胞成功地诱导分化出分泌胰岛素的胰岛细胞，并在无血清和正常培养条件下皆可成功地使 iPS 细胞产生胰岛素分泌细胞. 证明 iPS 细胞具有分化成胰岛细胞和胰腺内层的潜能，与 ES 细胞相似. 而René Maehr 等通过对 1 型糖尿病患者的成体成纤维细胞重新编程（Oct4，Sox2，Klf4），也可以得到 iPS 细胞. 最近研究显示，将 iPS 细胞诱导分化为胰岛β细胞（其数量决定糖尿病患者残存胰岛细胞的衰退进程），并注入 1 型糖尿病和2 型糖尿病小鼠体内，通过测定血糖及血红蛋白 A1c 水平显示患病小鼠体内血糖浓度降低并且血糖波动性减轻. 这表明，iPS 技术可能是根治糖尿病非常有效的治疗方式.4.5对其他人类疾病的研究目前，iPS 细胞已广泛应用于心血管疾病、血液系统疾病、中枢神经系统疾病等多种疾病的研究中，且已有多种遗传病患者的特异性 iPS 细胞系被建立. 同时，在不孕不育症以及听力、视力障碍等方面也进行了初步研究. Park 等将人源iPS 细胞经体外分化并分离得到原始生殖细胞（PGCs），其与体内分离的PGCs 在基因表达上极为相似，如果能够进一步将这些 PGCs 分化为精子和卵子，就有望治疗不孕不育症. Nishimura 等将患者自体产生的 iPS 细胞经纠正后，再分化为耳蜗神经元并移植到小鼠体内，1 周后便可观察到一些移植物开始表达谷氨酸标记的神经元. 这些结果表明，iPS 细胞可用来修复和移植受损的耳蜗神经. 最近一项研究表明，由逆转录病毒感染小鼠成纤维细胞产生的 iPS 细胞可分化为视网膜前体细胞，并将其移植到经过免疫抑制处理的视网膜变性的小鼠身上，这些细胞形成了包含所有 3 个胚层组织的畸胎瘤，其中也有神经视网膜. 由此可见，iPS 细胞可能是治疗视网膜病变的一种手段.4.6iPS 细胞作为体外疾病模型目前，iPS 细胞可作为临床药物筛选细胞模型和人类疾病治疗细胞模型. 例如，将来自患者的 iPS 细胞[肌萎缩侧索硬化症（ALS）]分化成特定的细胞（运动神经元）来研究改善疾病症状的药物. 此外，Lee 等以罕见神经系统疾病患者的体细胞建立了 iPS 细胞系，并解析了该种疾病的发病机制，以此来测试若干候选药物的疗效.目前，iPS 细胞广泛地应用于对人类疾病的研究，并建立了多种疾病的动物模型，在不久的将来，有望成为治疗人类疾病的一种手段. 然而，在 iPS 细胞广泛地应用于临床之前，还有许多问题需要解决. 实际上，这些问题不只在 iPS 细胞领域备受关注，在人类 ES 细胞领域也很重视：1）需要进一步验证是否有异源DNA 引入到 iPS 细胞基因组中；2）生成人类 ES 细胞和 iPS 细胞的效率很低；3）虽然人类 ES 细胞 / iPS 细胞能定向分化成一些特定的细胞，但是产生所有需要的特异细胞类型还要付出很大的努力；4）此外，一旦分化成特定的细胞系后需鉴定体外生成的细胞是否与体内相对应细胞相似，并如何纯化细胞. 最近几年，干细胞生物领域和 iPS 细胞在临床应用方面取得了巨大的进步，但是这里提出的问题可能仍要花数年时间才能被圆满解决.5 结语iPS 细胞与再生医学是目前研究的热点，随着 iPS 细胞基础与临床研究的深入，iPS 细胞必将开辟再生医学领域的新纪元. 目前，iPS 细胞不仅为疾病治疗和药物筛选提供了理想的细胞模型，还可用于治疗一些人类疾病，这是在再生医学治疗领域的有益尝试，但还远未成熟，疗效还缺乏长期的实践，其作用机制也存在很多盲点. 这项技术真正用于疾病的治疗还有相当长的路要走，如何高效获得安全的人诱导性多能干细胞，如何定向诱导多能干细胞向某一特定类型的细胞分化并有效地将细胞移植入患者体内实现对疾病的治疗等问题还需要进一步深入的研究. 但其初步显示出的临床效果及安全性，使我们对未来的前景充满期望，随着人类对iPS 细胞不断地深入研究，相信iPS 细胞会成为各种疾病患者的新希望.参考文献（References）：1 MUNSIE M J，MICHALSKA A E，O′ BRIEN C M，et al. 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