国内外食品微生物检测方法

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避免“公说公有理, 婆说婆有理”;避免 “仁者见仁,智者见 智” 2020/3/25
内容
第一部分 国内外食品微生物标准检验体系 第二部分 微生物检验快速检测系统 第三部分 方法的选择 第四部分 微生物检验方法的编写 第五部分 食品微生物检验方法的验证和确认
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第一部分 国内外的食品微生物标准检验体系
SN/T1632.2:2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 第2部分:PCR方法》SN/T1632.3: 2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 第3部分:荧光PCR方法》
PCR检测食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特
氏菌20、20/产3/2志5 贺氏毒素大肠杆菌等致病菌的SN均在报批中,即将发布。
二、以分子生物学为基础的检验法
DIN 10135:1999《沙门氏菌聚合酶连锁反应(PCR)检验方法》、 ISO/TS 20863:2005 《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应 (PCR) 检测食源病原体—热循环器的性能试验》、ISO/TS 22174:2005《食品和动物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR) 检 测食源病原体—通用要求和定义》、ISO 20837:2006《食品和动 物饲料微生物学—聚合酶链反应(PCR) 检测食源病原体—定性检 测用样品的制备》、ISO/TS20838:2006《食品和动物饲料微生 物学—聚合酶链反应(PCR) 检测食源病原体—定性方法的扩增和 检测条件》、Health Canada MFLP-72、USA FDA BAM 第9章 和USA APHA第40章规定可用PCR检测食品中的致病弧菌(如霍 乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌等)、Health Canada MFLP24和USA FDA BAM 第24章和USA APHA第35章规定可用PCR检 测食品中产志贺氏毒素的致病大肠杆菌和霍乱弧菌。
如 霍乱弧菌、O157、单核 细胞增生李斯特氏菌等
Many microbes are potentially pathogenic 如肠球菌、蜡样芽孢杆 菌、白色念珠菌、枯草
芽孢杆菌等
Most microbes are n如ev乳er 酸pa杆th菌og、en双ic
歧杆菌等
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食品微生物检测方法
带*者通常被列
为食品卫生指示菌
定量方法
方 法
定性方法
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直接计数方法
细菌总数*、大肠菌群* 、大肠杆菌* 、肠球菌* 、金 黄色葡萄球菌* 、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、单核 增生李斯特氏菌、沙门氏菌、弯曲菌属、肠杆菌科* 、 副溶血性弧菌、亚硫酸盐还原梭菌、李斯特氏菌属、霉 菌和酵母菌数*、嗜冷菌* 、乳酸菌、双歧杆菌等
间接计数法(MPN法)
大肠菌群* 、粪大肠菌群* 、大肠杆菌* 、肠球菌 * 、金黄色葡萄球菌* 、蜡样芽孢杆菌、单核增生 李斯特氏菌、肠杆菌科* 、 副溶血性弧菌、亚硫 酸盐还原梭菌等
致病菌:单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、
空肠弯曲菌、O157、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、 溶藻弧菌、创伤弧菌、肉毒梭菌、小肠结肠炎耶 尔森氏菌、产毒霉菌等
快速检验方法的评估结果表明,其对于某类食品的性能 优于其它食品,很大程度上是由于食品成分干扰所致,有些 食品成分对于快速方法中所应用的技术是比较麻烦的。例如, 每一食品成分可能抑制DNA杂交或Taq聚合酶,但对抗原-抗 体相互作用没有影响,反之亦然。既然方法的灵敏度、特异 性和精确性依赖于待验食品,那么进行比较研究以确保某一 特殊检验方法能有效分析此类食品是明智的。
第一节 主要微生物检验快速检测系统
一、以免疫学为基础的检验法
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免疫磁珠 检验法的 优点:
特异性 好
灵敏度 高 ≤1CFU
所捕获
的菌是活 菌
快速、
操作步骤 简便
可快速
处2理020较/3/25大 量样品
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商业化免疫磁 珠有: 沙门氏菌 O157:H7 单核细胞增生 李斯特氏菌 VTEC O145 VTEC O111 VTEC O103 VTEC O26 等 等
传统 平板倾注法
直接
计数

平板涂布法
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间接计数法——最大可能数量(MPN)
MPN法适用于污染程度低,含有
受到损伤的加工食品,目标微生
物数量低,否则,应用直接计 数方法
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三、区分几个关系
1、国家标准与行业标准的关系? 食品微生物检验的国家标准是GB/T 4789,其为基础标准,
特异序列,每个序列长度为25-75 mer。并设计五条阴性序列(这些序
列不代表任何一个待分析的微生物)。
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2、合成上述特异序列(探针)。探针将不是传统的cDNA形式,而是 oligo寡聚核酸,这样将大大提高检测灵敏度。
食源
性致 3、利用基因芯片点样系统将探针点样到载体上。同一种微生物的特异性
探针点样到芯片的一个区域。
国家标准(GB) 检验检疫行业标准(SN)

卫生行标(WS) 农业行标(NY)

方 国外主要食品微生物检测体系


国际标准化组织(ISO)
生 物
美国食品药品监督局(FDA)(online) 美国官方分析化学师协会(AOAC) 美国农业部(USDA) (online)
检 测
加拿大健康署(HPB) (online)
根据ISO/IEC 17025的规定,如果进口国要求使用他国国家 标准/行业标准,原则上要满足客户的要求,否则,需与客户协 商。即使国内国家标准/行业标准与他国国家标准/行业标准等 效或等同,也必须与客户协商和沟通,只有做客户统一的情况 下方可使用。
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第二部分 微生物快速检测系统
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部分协会标准;
部分地方标准等。
食品中常规指示菌和致病菌的关系
好氧菌总数
单增李斯 特氏菌
芽孢杆菌
肠杆菌科 大肠ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ群
粪链球菌
金黄色 葡萄球菌
沙门氏菌 弧菌科
粪大肠菌群 大肠杆菌
志贺氏菌
厌氧 梭菌
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致泻性大肠杆菌
O157
弯曲菌
常规指示菌和致病菌的“危害分类”
Very few microbes are always pathogenic
SN2/T02*0*/3*/2-*5*** 进出口食品中产志贺氏毒素大肠杆菌的检验方法
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Mini-VIDAS自動微生物筛选儀
可筛选沙门氏菌、 肠出血性大肠杆 菌O157、 李斯特氏菌、空肠弯曲 菌、单核细胞增生李斯 特氏菌、葡萄球菌肠毒 素;
可免疫浓缩沙门氏菌、 免疫浓缩肠出血性大肠 杆 菌O157
一、术语和定义 1、标准方法:指国际、区域、国家发布的经 过严格确认的以及公认的方法。标准方法包括参考 方法和公定方法。 (1)参考方法:指适用于特殊待验目标的经过 国际或国家公认的检验方法。对于食品微生物检验 而言,典型的传统的参考方法是培养法。 (2)公定方法:指知名的技术组织或机构(如 AOAC)公布的检测方法。 2、非标准方法:标准方法中未包含的需要确 认后才能采用的方法。
行业标准方法原则上应与其一致,至少不能与国家标准相矛盾。 进口产品用GB???出口产品用SN??????
2、国家标准与国际标准的关系? 为了公平贸易,国家标准应与国际标准接轨。应考虑优先使
用国际标准。
现状。实例:2004年USDA来青进行等效性评估。
3、 [国内]国家标准/行业标准与[他国]国家标准/行业标准的使 用?
核酸杂交分析(分子生物学)方法
剂盒 免疫学分析方法
其它商品化快速检测方法和培养基
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二、AOAC、NMKL、AFNOR、 NORDVAL、MICROVAL的认可情况
病菌 4、寻找适当的方法,提取微生物的基因组核酸。
5、加入相应的引物、荧光染料或用分子信标的方法,通过PCR 扩增特异
性片段。
基因
芯片 6、将带有荧光染料标记的核酸与基因芯片杂交。
7、杂交结果由基因芯片扫描仪进行扫描判读,对于管帽芯片也可用荧光
显微镜进行观察。 8、结果分析,针对杂交阳性位点,找出对应的阳性样品。
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基于DNA检验方法的特异性通过短的探针来显示,因 此用特殊探针或引物检测毒素基因,阳性结果仅仅表明 某细菌具有该基因序列,以及某细菌可能是产毒的,不 能从客观上说明该基因得以表达,并产生毒素,例如在 梭菌和葡萄球菌中毒病例中,DNA杂交和PCR仅能检测 到基因的存在,但不能用来检测预先形成的毒素是否存 在。
可替代方法:指用来检验某一特定产品中某种目标微生物的与相应参 考方法等效的方法(ISO 16140:2003),如快速检测试剂盒和自动化系 2统020。/3/值25 得说明的是,并非所有的可替代方法都是标准方法。
二、国内外食品微生物检测体系 http://www. foodmate. net


国内主要食品微生物检测体系
BD PHOENIX™ 全自动微生物鉴定系统
炭疽杆菌(G+)
双歧杆菌( G+ )
乳酸菌( G+ )
四、根据酶触反应及代谢产物快速检测细菌
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五、其他部分自动化系统
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BIOLOG自动微生物鉴定系统
BIOLOG
OmniLog
MicroLog
美国公共卫生协会(APHA) 北欧食品分析委员会(NMKL)
方 法
非 标 准
法国标准协会(AFNOR)标准、英国国家标准 (BS)、日本国家标准(JIS)、韩国国家标准(KS)等
科学书籍和期刊公布的方法; 实验室研发的未出版的方法;
标准方法未 包含的方法
方 法
部分由设备制造商指定的方法; 扩充和修改过的标准方法; 企业标准;
国内外食品微生物检测方法
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微生物检验标准方法的必要性和重要性
食品安全食品政治
对食品中的致病微生
物进行监测是国家意
志的体现
有法可依 国
执 行
有法必依 家
部 门
执法必严
违法必究
有法可依 有章可循 有据可查 有错必纠 有洞必补
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准确、可靠的检验结果是正确评价和保 证食品安全性的先决条件,也是国际贸易上 公平交易的有力科学依据。在食品微生物检 验领域中,检验规程规范化和分析方法标准 化是检验结果可信性的重要保证。
AOAC & OMA
NMKL
AOAC指南
AOAC研究所
美国管理者 (US regulators)
非美国管理者, 如NATA
ISO 16140
NordVal
MicroVal
AFNOR
鉴定
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方法
三、生化鉴定系统
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大肠杆菌(G-)
沙门氏菌(G-)
志贺氏菌(G-)
弯曲杆菌(G-)
弧菌(G- ) 小肠结肠炎耶尔森氏菌(G- )
VITEK 2 COMPACT
金黄葡萄球菌(G+)
李斯特氏菌(G+)***
产气甲膜梭菌(G+)
肉毒梭菌(G+) 链球菌(G+)
OmniLog & OmniLog Plus
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MicroLog 1 MicroLog 2 MicroLog 3(MicroStation)
第二节 微生物快速检测系统的局限性
大部分快速方法适用于检测单一微生物,适用于质量控 制程序中快速筛选大量食品样品中所存在的特殊病原体或毒 素。然而,快速检验方法所得阳性者,仅仅是可疑,必须用 标准参考方法予以证实,虽然证实试验需要几天,但不能予 以限制。
随着某一快速方法更加频繁的使用,其好处和局限 性同时变得更加明显。使用者在选择和彻底评估这些快 速方法时,必须保持谨慎。
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第三节 微生物快速检测系统的认可
FDA认
一、USDA FDA 认可情况
可使 检测和鉴定食源性病原菌的微量生 用的 化复合试剂盒
检测 微生物自动鉴定系统
系统 和试
PCR技术将是众多食品微生物快速检测中被 认可的一枝独秀的快速检测技术之一。
但须注意:如何减少培养基成分的干扰?死 菌的干扰和风险?等等
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基因芯 片-DNA 点样仪
SN/T 基因芯片的基本技术路线
1、采用数据库中各种微生物的全基因组序列资料或部分基因组序列资料,
1543: 通过生物信息学方法找出各种微生物的特异序列,每个检测目标找3-5个
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