乙型肝炎病毒耐药基因及分型检测

乙型肝炎现状如何？乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。

我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。

乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。

通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。

研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。

同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。

乙肝的治疗方式有哪些？HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。

由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。

但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。

乙肝病毒产生耐药的机理是什么？HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。

通常分为以下几种：（1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降；（2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降；（3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。

HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。

HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。

产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。

HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。

在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。

HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。

核苷（酸）类药物主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV 的cccDNA为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。

为了持续抑制HBV的复制，NA抗HBV治疗的疗程往往需要数年。

但在长期应用某一抗病毒药物的情况下，产生选择压力，野生株被抑制。

生存下来的突变株占主导，此种药物便失去了疗效，从而导致耐药的发生。

HBV对NA的耐药分析1.拉米夫定(LAM)LAM属于L-构型核苷，是目前用于临床最广、时间最长的药物，其产生的耐药也是最多的。

在LAM 初次治疗时，1、2、3、4和5年YMDD突变的发生率约为23％、46％、55％、65％和7l％。

LAM主要的耐药突变位点是rt M204V／I(YMDD变异)，rtM204V变异通常与其补偿突变rt L180M联合出现，rtM204V ／I株较野生株复制能力低，而rtL180M的出现使突变株HBV的复制接近野生株的水平圈。

目前报道发现的与LAM相关的主要耐药突变有rt M204V、rt M204I和rt L180M，其他的突变位点有rt L80V／I、rtI169T、rt V173L、rtTI84S和rtQ215S这些突变通常以下面不同的组合方式出：(1)trM204I／V+rtIJ80M；(2)rtM204I：(3)rtM204V+rtL1810M+rtV173L；(4)rtM204I+rtI80I：(5)rtM204I／V4+rtQ215S±rtL180M：(6)rtM204V+rtL180M+rtV173L+rtl169T；(7)rtA181T：(8)rtM204I／V+rtT184S±rtL180M：(9)rtM204S+rtLl80M。

这些HBV耐药突变株常以准种的形式存在，当使用LAM治疗后，突变株便可成为主要病毒侏。

LAM耐药的分子机制目前推断可能是rtM204位点参与形成了LAM与聚合酶的结合部位，rtM204位点发生突变后主要产生了两方面影响：(1)使dNTP结合位点甲基化，从而产生空间位阻降低了LAM与dNTP 底物的亲和力；(2)降低使LAM三磷酸根结合到正在复制的病毒DNA的催化活性，这些原导因致rtM204位点突变株的复制力减低，且与LAM的结合力低于野生侏，从而降低了LAM的抗病毒作用。

2.恩曲他滨（FTC）FTC属低耐药基因屏障药物，在临床应用中应密切关注其耐药情况。

体内与体外研究均表明FTC耐药位点与LAM相同，即rtM204V/I ± rtL180 M变异，FTC治疗1年的基因型耐药发生率为13%～16%，但缺乏长期的耐药数据。

在开始FTC治疗前应充分评估患者的治疗指征，详细了解患者既往治疗史。

免疫耐受期的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者除非需接受免疫抑制剂治疗等特殊情况，一般不建议进行抗病毒治疗。

首次出现ALT升高的CHB患者，应分析其可能的诱因，慎重开始抗病毒治疗。

FTC治疗期间应督促患者规范服药、定期随访，尽可能提高患者依从性。

如随访发现患者病毒学应答不佳或出现病毒学突破，应及时明确患者是否存在依从性问题。

排除依从性问题后，应及时进行HBV基因型耐药检测以明确FTC 耐药情况，相应调整治疗方案。

目前对于FTC耐药挽救治疗证据尚不充分。

参照LAM耐药挽救治疗情况，可考虑加用ADV或TDF 抗病毒治疗，亦可考虑换用TDF抗病毒治疗。

3.阿德福韦酯(ADV)ADV属于无环嘌呤类核苷酸类似物。

与LAM相比，在使用ADV初次治疗时，1～5年基因耐药变异的概率分别为0％、3％、6％、18％、29％，耐药发生的时间和机率都远低于LAM。

然而，在已产生了LAM耐药的患者中，单独改用ADV治疗1年和2年，基因耐药变异率分别升高为6.4％和25.4％，ADV 联合LAM治疗可降低耐药突变发生率，对于产生LAM耐药的患者，加用ADV为首选。

与LAM单点突变不同，ADV相关的耐药突变多为多点突变，目前得到学界公认的主要耐药位点有rt A181T、rt A181V和rt N236T，组合方式主要有四种：(1)rtA181V；(2)rtN236T；(3)rtAl81V+rtN236T；(4)rtA181T+rtN236T。

另外rtA181T突变也在长期使用LAM患者的HBV基因中检测到，但是，该突变并未合并rtM204I／V的突变。

有认为这是因为rtAl81V／T突变能改变rtM204密码子的位置，导致一个间接的催化位点空间位阻，从而使LAM的敏感性下降。

有进一步研究表明A181V／T突变株对LAM、LdT和ETV的敏感性都下降，但对TDF仍然敏感。

4.恩替卡韦(ETV)ETV是一种脱氧嘌呤核苷酸类似物，ETV对初治患者很少发生耐药，1-5年的累积耐药发生率分别为0.2％、0.5％、1.2％、1.2％与1.2％。

但对原有LAM耐药的患者，改用ETV，治疗1-5年后的临床耐药率分别为6％～7％、15％～16％、36％、46％和51％。

因此，ETV在LAM失效患者中的耐药发生率明显增加，产生LAM耐药的患者不推荐首选ETV。

这是因为ETV的耐药变异需要在rtM204+rtL180位突变的基础上，再联合rtT184、rtS202、rtM250和rtI169位点上一个或多个的氨基酸突变。

其耐药变异主要有两种模式：(1)rtM250v+rtIl69T+M204v+L18OM；(2) rtT184G+rtS202I+rtM204V+rtL180M。

有体外试验证实，rtM250位点突变可引起ETV的敏感性下降，单独rtI169位点的突变对ETV只低度耐药，但rtI169联合rtM250位点突变则可阻止DNA链延伸，从而降低ETV敏感性；rtT184和rtS202位点的突变可以改变YMDD附近的核苷酸聚合酶结合袋的几何构像，影响C区的两个催化性天门冬氨酸残基的编码，从而导致对药物的敏感性下降。

ETV需多个位点的突变才能出现耐药，表明它的高基因屏障。

由于ETV抗病毒治疗的有效性及低耐药性，被推荐为乙肝肝硬化失代偿期的一线用药。

5.替比夫定(LdT)LdT与LAM同属于L-构型核苷，与LAM耐药基序相似，都发生在YMDD区，但其耐药发生率低于LAM，对初治患者的第l与第2年累积耐药发生率分别为4％与22％。

而且LdT出现的耐药突变位点仅有rtM204I，尚未发现rtM204V变异。

原因尚不清楚，有研究认为可能与其抗病毒复制的高效能有关。

也有文献报道LdT相关的耐药突变还可发生在rtL80、rtL180、rtL181、rtL229等位点，其意义还有待进一步明确。

6.替诺福韦(TDF)TDF是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，国外已批准该药用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)和成人的慢性乙型肝炎。

在Ⅲ期临床实验中，替诺福韦治疗2年以上还未被证实有基因型耐药发生，但是此临床实验在治疗72周时对血清仍能检测到病毒者都增加使用了恩曲他滨，所以不能确定72周后单一使用替诺福韦治疗的耐药发生率。

有报道称rtA194T变异与TDF耐药相关，能够改变DNA模板与dNTP底物的结合位点，从而影响DNA合成。