细胞中各种位置蛋白提取

这个protocol应该可以满足大部分人的需求。

我孤陋寡闻，因需要检测可以溶于两种不同去污剂的蛋白，看到一篇文献里蛋白提取方法，完全被折服了。

太强悍了，蛋白还可以这样提。

我以前一直以为裂解液裂解后，沉淀里面没有蛋白了，现在才发现沉淀里还含有大量不溶于裂解液里去污剂的蛋白。

故将这个protocol发出来供我和一样的新手学习。

我以前是裂解细胞，离心，测浓度，然后直接往整管里加loading buffer，再离心取上清，看过这个步骤之后才知道，加loading buffer后沉淀里的许多蛋白会再次溶解。

同一种蛋白可能存在溶于不同去污剂的成份。

最后我有一个问题，一瓶细胞按下列步骤提取的蛋白后，能否比较该瓶中同一蛋白在含不同去污剂的裂解液中含量的多少？怎样选择内参？
For cell fractionation analysis, a general protocol was used which allowed for separation of cells into cytoplasmatic, nuclear and membrane/cytoskeleton fractions. Briefly, cells were harvested with a rubber policeman in chilled 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, measured pH 7.5, plus inhibitors, and ruptured by repeated passage through a 21-gauge needle. Nuclei were collected by centrifugation at 1000 ×g for 3 min and lysed with 1% SDS-lysis buffer. Centrifugation of supernatants at 21,460 ×g for 1 h at 4 °C gave membrane/cytoskeleton as pellet and the cytosolic fraction as supernatant. Membrane/cytoskeleton pellets were then resuspended as whole, SDS-solubilized membrane/cytoskeleton fraction (Tot) with 1% SDS-lysis buffer. Otherwise, membranes were fractionated into Tx-soluble (Sol) and Tx-insoluble (Insol) phases by treatment with TritonX-100-buffer (100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors). Centrifugation at 21,460 ×g for 60 min gave a supernatant constituted by the Tx-soluble membrane phase and a residue pellet representing the Tx-insoluble, cytoskeleton-linked membrane phase which was resuspended in SDS-buffer.
翻译版本一
细胞分部分离一般的实验设计是将细胞分离为细胞质的、核的、细胞膜/细胞骨架这几个部分。

简单来说就是，
1. 用一端包有橡皮的玻璃棒从冷却的50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, measured pH 7.5, plus inhibitors 中收获细胞，用21号针使传代细胞破裂。

2. 通过离心（1000 ×g for 3 min ）收集细胞核，用1% SDS-lysis buffer溶解。

3. 所得上清液再离心（21,460 ×g for 1 h at 4 °C ）得到的片状沉淀物为细胞膜/细胞骨架，上清中的蛋白为细胞质部分的。

4. 片状的细胞膜/细胞骨架沉淀用1% SDS-lysis buffer全部重悬。

另外，用TritonX-100-buffer (100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors)处理细胞膜，将膜被分为可溶和不可溶两部分，通过离心（21,460 ×g for 60 min ）取沉淀，用SDS-buffer将细胞骨架相连的膜重悬。

翻译版本二
最好全部冰上操作。

1，弃去培养基用PBS洗2次后，加入冷的裂解液，裂解液配方：50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 调整pH至7.5, 根据需要加入蛋白酶抑制剂，有钱可以买pierce的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（英文好像是cocktail）。

2，在裂解液中用细胞刮子收集所有细胞，转移裂解液至EP管，用21号针头反复吹打裂解细胞。

3，1000g*3min离心，将上清转移至另一EP管(A管)，沉淀用适量含1%SDS的裂解液（上述裂解液加入SDS）溶解即可得到核蛋白。

4，将A管上清21460g*1h 4 °C离心，即可得到胞浆蛋白（上清）和胞膜/骨架蛋白（沉淀）。

对于沉淀根据需要有两种处理，
A, 将沉淀用含SDS的裂解液溶解，即可得到溶于SDS的胞膜/骨架蛋白。

B, 将沉淀用含TritonX-100裂解液(100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors)溶解，即可得到溶于Triton X-100（Sol）的胞膜/骨架蛋白，转移上清后剩下沉淀使用含SDS裂解液溶解，即可得到不溶于Triton X-100（Insol）的胞膜/骨架蛋白。

来自文献PTPRK negatively regulates transcriptional activity of wild type and mutated oncogenic beta-catenin and affects membrane distribution of beta-catenin/E-cadherin complexes in cancer cells. Cell Signal. 2008 May;20(5):872-83.
本人只需得到总蛋白中溶于Triton X-100和不溶于Triton X-100的蛋白。

操作如下，
lysis buffer
2*lysis buffer 500ul(150mM NaCl, 2%Troton X100,100mM Tris (pH 7.5))
Inhibitors 40ul
MillQ water 460ul
在六孔板中每孔加入200ul裂解液，置于4 °C摇床30min后（也可置于冰上吹打裂解），4 °C 离心14000g*10min,上清即为溶于Triton X-100（Sol）的蛋白，沉淀使用100ul 1*上样缓冲液(里面含有SDS) 溶解上清，即可得到不溶于Triton X-100（Insol）的蛋白。