人体外周血染色体G显带制备的影响因素

人体外周血染色体G显带制备的影响因素

【摘要】染色体G显带技术是研究染色体数目和结构畸变的基础，整个制片过程繁琐，接种、收获、制片、显带等因素都可影响染色体标本的最终效果。

【Abstract】Chromosome G banding technique is the study of chromosome number and structural abnormalities of the base, The entire production procedure,includinginoculation, harvesting, production, banding and other factors can affect the chromosome specimen of the final results.

【Key words】Chromosome G banding；Factors；Remedial measures

1染色体G显带玻片的制作

1.1取血与接种时间一次性真空采血肝素抗凝管(3 ml规格)，常规消毒肘部皮肤及抗凝管的进针处，抽取静脉血2～3 ml，轻轻摇匀，防止凝固，待接种培养。当天不能培养的标本应及时置于4℃冰箱存放以免影响细胞的活力，一般在采血后1～3 d内可进行培养。在4℃冰箱保存6 d的标本我们也曾培养，且染色体质量也不错。由于存放时间长，有活性的淋巴细胞少，此时应1000 r/min离心10 min后取白细胞层接种。

1.2细胞培养基与接种全血量人体血液中的淋巴细胞是一种分化细胞,它的细胞质很少,RNA 和蛋白质的6合成速度也很慢，淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(phytohemagglutininPHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂，进入淋巴细胞生长周期。细胞经过68～76 h的培养，处于分裂期的细胞可达20%以上(我们曾做过此类的实验)，此时加入秋水仙素便可获得大量的中期分裂相细胞。培养基为培养的细胞提供营养，培养基成份中小牛血清和植物血凝素的含量，PH值情况，均可影响染色体分裂指数。我们使用杭州四季青胎牛血清15%，HYCLONE1640液体培养基85%，广州市医药工业研究所PHA 150 ug/ml，严格按无菌操作配制培养基。

接种前，将5 ml的培养液置室温融化。将超净工作台用紫外灯消毒30 min 后，在超净台内用加样枪吸取410ul左右的外周血接种到每瓶培养基内、摇匀，淋巴细胞的接种密度应控制是在400～600个/ml。接种两瓶。置37℃恒温培养箱培养68～76 h；如果接种时发现外周血有小凝块，则捣碎凝块，加大接种血量如600ul，亦可获得成功。新生儿的标本由于血浆中含有较高的胆红素［1］及淋巴细胞含量高，应减少接种量如300ul，或者1000r/min离心10 min后取白细胞层150ul接种。

1.3秋水仙素秋水仙素在细胞培养分裂中所起作用是与微管形成或解聚密切相关的。秋水仙素一方面能阻滞微管(纺锤丝)形成，或使已形成的微管解聚；另一方面，秋水仙素的作用又能促使DNA的复制和有关蛋白质合成［2］。可见秋

水仙素可抑制微管的合成使细胞处于分裂中期，又有生物毒性，影响细胞生长。因此，在血细胞培养时，秋水仙素加入的剂量及处理时间与中期分裂相的多少和染色体长短有密切的关系。在秋水仙素浓度对染色体有丝分裂阻断率的影响方面，陈德清教授等进行了大量的工作［3］。若秋水仙素浓度大，则处理时间短，如浓度小，则处理时间长。但若秋水仙素加入过量，或处理时间过长，染色体凝集和收缩变小，或发生异常分裂现象，甚至染色体破碎，不宜用于观察染色体的形态及计数；若秋水仙素加人太少，或处理时间偏短，染色体形态偏长或无中期分裂相，也不易进行染色体观察。故秋水仙素浓度及处理时间要准确把握。一般在血细胞培养68 h(即收获细胞前2 h)，用微量加样枪在各培养瓶内加入30～40 uL秋水仙素，使最终浓度为0.04～0.08 ug/ml，置37℃温箱继续培养2 h后收集细胞、制片，就能够收集到分裂相非常好的染色体。但有时因时间关系，我们在血细胞培养68至76 h内的各个时间点内，在各培养瓶内加入浓度30～40uL秋水仙素，使最终浓度为0.04～0.08 ug/ml，置37℃温箱继续培养2 h后收集细胞、制片，亦能够收集到分裂相非常好的染色体。甚至在终止培养前30 min加人150 uL秋水仙素使细胞生长停止在中期，也能收集到足够数量及分裂相好的染色体核型。

1.4制片

1.4.1收集细胞从培养箱中取出培养瓶，用小吸管将培养物吹打均匀，移入10 ml刻度玻璃离心管内，以1000 r/min离心10 min，吸去上清液，保留底物。在吸去上清液时，要避免与上清液接触处的淋巴细胞层被吸弃，造成人为的大量中期分裂相细胞丢失。一般要求每次吸取上清液时都要在玻璃管的底部留上大约

0.5 ml的上清液，以确保培养细胞不丢失。

1.4.2低渗低渗是制片好坏的关键环节。实验室一般多用37℃预温的0.075 mol/L的kcl低渗液，利用细胞内K+浓度远比细胞外K+浓度高这一特点，使淋巴细胞吸水膨胀和中期染色体分散铺展，而非红细胞解体，国内许多学者认为低渗使红细胞解体。为了达到淋巴细胞吸水膨胀但不自行破裂这一平衡点，低渗时间和低渗温度一定要掌握好。低渗时间不充分，染色体分散不好，呈团状；低渗过长，可引起细胞在滴片前破碎，染色体丢失，甚至由于染色体胀的太大而使之出现微毛和形态结构模糊不清，变得难以染色；低渗温度不够或预温温度不够可出现胞浆背景等现象，造成制片时分裂相不分散。所以，低渗处理适当，所得染色体轮廓清楚，可染色性强，在显带染色时能很好地显示带型特征。我们一般加入提前37℃预温的0.075 mol/L的kcl低渗液至8 ml刻度处，再用吸管快速吹打均匀，然后再置于37℃的水浴箱中，温育25 min，便可得到理想的效果。

1.4.3固定在染色体制片过程中需加入甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液，主要目的是维持染色体的固有形态及细胞膜；抽提白细胞内的细胞质成份，从而有利于染色体分散；破坏红细胞。固定液可使细胞脱水，蛋白变性而使染色体变的粗大而适中。固定液需现配现用。低渗后的预固定很重要，固定液量不要多，一般是加入新配固定液1.5 ml进行预固定，加入固定液后用吸管轻轻吹打均匀，以后的每个步骤都要轻柔。在室温下静置5 min，然后离心1000 r/min、10 min，吸去上清液(同样注意不要将淋巴细胞层吸弃)，保留沉淀进行第一次固定；第一次固定时