外周血染色体标本制作

二、实验原理
因此，可采取少量外周静脉血，做短期培 养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时 加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止 在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、 固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。 上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、 Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着 色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体 的特征。
• 最后，理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色 效果，即能增强染色体的嗜碱性。例如，甲醛虽具 有优良固定剂的其它所有特性，但却会降低染色体 的嗜碱性，所以不能单独用作染色体的固定剂。 • 显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些 条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来， 使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如 此，那怕是最佳固定剂仍难免有不足之处。首先， 细胞被杀死后发生的基本变化很难予以避免；其次， 可能会抽提出一些弥散成分；最后即使操作十分谨 慎，仍难以保持酶活性不变；此外，某些化学物还 会导致细胞的皱缩。
3.2固定液的种类
• 醋酸 • 作为混合固定液的一种成分，醋酸的优点在于： （1）可以与已知的任何一种固定剂同时使用，并 且可以和任意比例的水、乙醇或甲醇混合；（2） 浓度可以很低（1%）也可以很高（99%）；（3） 具有很强的穿透性能，比乙醇的穿透性还高。 • 醋酸能使核酸沉淀使组蛋白溶解，但却不能固定细 胞质蛋白。在染色体结构的研究中，醋酸的主要用 途是阻止染色体收缩，使染色体的结构免于被破坏。 经醋酸固定的物质还能抵销乙醇的硬化作用。
细胞的膨胀和染色体的皱缩是决定固定剂质量 的两个重要因素。以往曾认为渗透压是促使细胞内 结构膨胀或破坏的决定性因索，为此选用等渗液作 为固定剂，其实这种看法是不正确的。事实证明， 稀释的醋酸具有20个大气压，照常可使细胞和组织 膨胀，而只有2.5个大气压的苦味酸却可使组织大大 地收缩。这提示一种固定剂的效果如何与渗透压的 关系很小。另一方面，苦味酸使蛋白质沉淀的作用 很强而醋酸却没有这一作用。可见，使蛋白质沉淀 这一特性在导致染色体收缩方面可能起重要作用。 因此，在选用哪些化学物作为固定剂时，需要权衡 以上这些因素。
人类体细胞染色体标本制备与核型分析 Metaphase Chromosome Preparation
and Analysis of Karyotype
一、实验目的 1.熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染 色体标本的制备方法。 2.熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。
二、实验原理
染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程 中出现的结构。因此，必须获得染色体标本才 能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周 血淋巴细胞进行核型分析。正常情况下，人体 外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素 （PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴 母细胞，使其恢复增殖能力。
2.低渗溶液
经过秋水仙素处理后，细胞内的染色体比较适
合于观察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞
加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求 标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平 面上。这些均有赖于低渗处理。
的染色体数目多，形状小，最大的染色体约 7-8微米，
2.1基本原理和机制
1965年，徐道觉发现未作低渗处理时，伴随染 色体的一些零乱的物质类似于核糖核蛋白体的颗粒， 显然是有丝分裂中核仁崩溃时的残存物。而低渗处 理后，这些物质就消失了。可见，低渗处理不只是 凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，而且还可 使粘附于染色体的核仁物质散开，这样就能看清楚 每一个扭曲的染色体。现在知道，覆盖在染色体上 的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散。
固定剂的另一重要特性是能迅速地穿透组织或
细胞，并在一瞬间内杀死它们，这样方能使正在分
裂的细胞立即阻留在各自的时相上。瞬间杀死是很 重要的，否则核分裂仍可继续下去并到达所谓的 “休止相”或“代谢相”，那就无从研究染色体了。
可是，随着细胞的死亡而出现的另一些变化(特 别是蛋白质的自溶作用)，往往会破坏染色体的原来 结构。在正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合 成，而当细胞死亡时，由于介质变为酸性，这些酶 便在相反方向起作用，即使复合蛋白质裂解为简单 的氨基酸。因为多肽是染色体的主要成分之一，所 以这种变性效应最终将引起染色体结构的破坏。因 此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。 此外，在细胞致死的同时，细菌的活动致使细胞内 成分的分解。因此一种好的固定剂应当既能起到防 腐作用，又能阻止细菌的分解作用。
• 用作固定剂的化学物有非金属和金属两类。前者 如乙醇，甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯 仿等。后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝 酸铀等。其中有几种化学物还可作为蒸气固定剂， 也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转 变为不溶性物质，这样就可在原位制作标本。 • 在细胞化学研究上，大多数非金属固定剂(除甲醛 外)比之于金属固定剂有一优点是，在固定之后无 需在水中冲洗标本。
• 与其它预处理化学物相比较秋水仙素的另一个优 点是，在广泛的温度范围内都是有活性的。在热 带地区的夏季，那怕气温高达43.3℃，对秋水仙素 的活性也无显著影响，有人将秋水仙素加入保存 在8-9℃的组织中，发现中期细胞的数目比保存在 室温但未加秋水仙素的组织要多得多，而且染色 体的结构也很清楚。 • 乙酰甲基秋水仙碱是人工合成的秋水仙素的衍生 物。它的功能跟秋水仙素一样但对细胞的毒害作 用只有秋水仙素的1/30一1/40。4-6×10-6的浓度即 可得到所希望的效应。 • 除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤 体抑制剂。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长 春花碱等，它们在人体细胞均可产生良好效果。
1.纺锤体抑制剂
故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形 成和终止细胞分裂的作用。以秋水仙素为代表的纺 锤体抑制剂能引起有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑 制纺锤体的形成，但不影响染色体的复制和着丝粒 的分裂使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量 分裂相供分析之用。秋水仙素积累分裂中期的作用， 几乎对所有植物器官和许多动物的器官都是十分有 效的。
1.纺锤体抑制剂
细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管管壁 由13条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋 白，而微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种。α微 管蛋白和β微管蛋白组成的异二聚体构成微管亚单位， 若干个异二聚体相接连成原丝。α微管蛋白与β微管 蛋白在化学结构上极为相似，两者42%序列相同。 其中β微管蛋白肽链中第201位为半胱氨酸，为秋水 仙素结合部位。如果结合的部位被其结合，微管不 仅不能继续聚合，而且会引起原有微管解聚。
2.4影响低渗效果的因素 影响低渗处理的效果是以下三个因素：低渗 溶液的化学组成、低渗的强度和处理的时间。处 理时间太短则染色体铺展不好，处理时间过长会 引起细胞破裂甚至由于染色体胀得太大而致形态 结构模糊。因此，在实际操作中，对某一种组织 究竟应选用哪一种低渗溶液，需事先进行预试验。
3.固定
固定是组织、细胞或其成分选择性地固定于 某一特定阶段的过程。其目的是杀死细胞但又要 避免所研究的成分受到破坏。 不同物种对固定剂的反应是不一的，哺乳类 动物染色体的固定尤其需要特定的方法，这是因 为每种生物的细胞质成分彼此各异的缘故。生物 类型本身的复杂性及多细胞生物中细胞内的变化 较大，以致很难在细胞水平上分析固定的效应。
3.1基本原理与机制 • 用于固定的化学物对细胞都具有杀死作用，这类化 学物可分成二大类：一类能使染色体固缩，或使核 酸和蛋白质纤丝相脱离，另一类则可维持染色体结 构的完整性。 • 为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及 嗜碱性，就需要使染色质物质沉淀。在活体条件下， 细胞内不同成分之间的相差并不足以使它们成为一 种明显的单位。可是随着蛋白质的凝结和沉淀，染 色体的折射系数将发生很大的变化从而使它们在细 胞内成为明显的小体。正因为如此，迄今所用的固 定剂都具有交链蛋白质的特性，都能使染色质沉淀。 尽管常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合 物，但其中至少有一种化学物必须具备这一特性。
1.纺锤体抑制剂
1.2主要的纺锤体抑制剂及其作用特点 • 秋水仙素 • 秋水仙素（colchicine）是一种生物碱，因最初从 百合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）中提 取出来，故名。分子式C22H25O6N。纯秋水仙素 呈黄色针状结晶，熔点157℃。易溶于水、乙醇和 氯仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水 仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停 滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分 裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。在这 样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分 裂，不能形成两个子细胞，因而使染色体加倍。
1.3处理过程 培养终止前在培养基中加入浓度为 20μg/ml的秋水仙素0.05~0.1ml（1ml注射器 滴垂直3-5滴）使其最终浓度为0.4~0.8μg/ml， 置5%CO2、37º C±0意的是经秋水仙素处理后的细胞虽可用 各种不同的固定液(金属固定液或非金属固定液)予 以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织 或细胞上冲洗掉，否则沉积在细胞表面的秋水仙 素不仅会影响染色体的形态，而且还会阻碍固定 液的穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早地加 快速穿透液，如甲醇-冰醋酸固定液。要不然在固 定的时候，细胞核仍可能进入代谢期。
秋水仙素的作用与其浓度和作用时间相关，在高 浓度时可以延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺 锤体的形成。 在秋水仙素作用下，染色单体缩短， 着色变深以致外形清晰。但不同染色体缩短的程度不 一，长的染色体比短的染色体浓缩得更明显些。 从能收集到足够的中期细胞考虑，秋水仙素处理 的时间宜长些，所用的浓度宜高些；但从能得到较为 细长的染色体考虑，处理的时间宜短，所用的浓度宜 低。因而秋水仙素处理的方法应同时兼顾这二个方面。 如果处理的时间太短则标本中的分裂细胞就少；与此 相反，如果处理的时间太长分裂细胞虽多，但染色体 缩得太短，以致形态模糊，就难以获得优良的显带标 本。
2.2主要的低渗液 • 低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。 可以是水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾 (0.65mol/L)、氯化钾(0.075mol/L)、稀释的平衡盐溶 液或培养基。处理时间一般为8-40分钟，处理时的温 度为23-37℃。 • 在早期的一些研究中，大多用柠檬酸钠或柠檬酸钾 作为低渗液。也有些学者主张用稀释的人血清，认 为这样可使染色体的形态特征更为清晰。自1965年 后，人们改用KCl为低渗掖。其优点是染色体的轮廓 清楚，可染色性增强，染色时间短。在相差显微镜 下观察．KCl低渗处理标本的效果比其它低渗液更好 些，也适合于显微分光光度分析，当用显带染色时 能充分显示带型的特点。KCl的浓度以0.075mol／L 为宜，但不同组织所需的处理时间未必相同。