发酵豆粕中抗原蛋白和不良寡糖的检测

发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测
——SDS-PAGE法
1．适用范围
本标准适用于测定发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测。

2．仪器设备
2.1蛋白电泳仪：
2.1.1 电泳仪；（建议使用：北京六一仪器DYY-2C型）
2.1.2 电泳槽；（建议使用：美国伯乐公司的mini型）
2.2 25μl微量进样器；
2.3 制胶装置；（与电泳槽配套出售，包括玻璃板(厚度分别为1.0 mm和 1.5mm各一套)，梳子，拨胶板）
2.4 移液枪(1000μl,200μl,10μl)以及其配套枪头；（属于常规实验耗材）
3．试剂
3.1 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED；（建议购至上海申能博彩，Chemisonic 进口分装，必须要进口的产品！国产做出来的结果很差）；分析纯；
3.2 无水酒精，分析纯；
3.3 甘氨酸，分析纯；
3.4 Tris，分析纯；
3.5 考马斯亮兰R250，分析纯；
3.6甲醇，分析纯；
3.7 冰醋酸，分析纯；
3.8 甘油（丙三醇），分析纯；
3.9 β-巯基乙醇，分析纯；
3.10 溴酚蓝，分析纯；
3.11 HCl，分析纯；
4.试剂的配置
4.1 SDS-PAGE溶液的配制：
30%丙烯酰胺的配制：丙烯酰胺 30.0g
N’N-甲叉双丙烯酰胺 0.8g
去离子水定容至100ml
4.2 10%过硫酸铵：将1g过硫酸铵溶于10.00ml去离子水中。

2.00mol/L Tris-HCl(pH=8.8)：称取Tris 121.14g溶于500mL蒸馏水中，用浓盐酸
调节pH至8.8(要求准确)。

1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8)：称取Tris 60.57g溶于500mL蒸馏水中，用浓盐酸
调节pH至6.8(要求准确)。

10%SDS：称取5gSDS溶于50ml蒸馏水中。

1.0% 溴酚兰：称取0.05g溴酚兰溶于5ml蒸馏水中。

4.3 染色液：考马斯亮兰R250 0.25g
甲醇 45.40ml
冰醋酸 9.20ml
水 45.40ml
4.4 脱色液：甲醇 456.0ml
冰醋酸 72.0ml
水 472.0ml
4.5 4×分离胶缓冲液：2.00mol/L Tris-HCl(pH=8.8) 75ml
10%SDS 4ml
蒸馏水 21ml
10%过硫酸铵 5ml
4.6 4×堆积胶缓冲液：1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8) 50ml
10%SDS 4ml
蒸馏水 46ml
10%过硫酸铵 5ml
4.7 电泳缓冲液： Tris 3.0g
甘氨酸 14.4g
SDS 1.0g
定容至1L，用HCl调节pH为8.3。

4.8 5×样品缓冲液（5×Loading buffer 蓝色）：
1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8) 0.6ml
50%甘油 5.0ml
10% SDS 2.0ml
β-巯基乙醇 0.5ml
1.0% 溴酚兰 1.0ml
蒸馏水 0.9ml
4.9 5%浓缩胶的配制：（总4ml）
4.10 12%分离胶的配制：（总10ml）
4.11 0.03 mol/L的Tris-HCl样品浸提液
Tris 3.63g
β-巯基乙醇 0.7ml
定容至1L，用HCl调节pH为8.0
5. 聚丙烯酰胺凝胶的制备
将洁净的玻璃片置于制胶支架上（缺口朝里），放平、齐，压紧，将配好的16%分离胶，用1ml枪头从矮口的一侧缓慢加入，操作的过程中，禁止有气泡的生成，离矮面玻璃边缘2cm处，用医用注射器吸取1ml无水酒精，缓慢注入分离胶上，此时可以明显看出分离胶与无水乙醇的分层线，切不可过分晃动胶板，防止乙醇进入分离胶内部，阻碍其凝结。

待分离胶凝固后，倒出乙醇，并用滤纸轻轻吸干乙醇，用同样的方法继续注入5%浓缩胶，注满后插入进样梳，待其完全凝结，后拔掉进样梳，备用。

注意：温度的升高可加速胶的凝结速度，但是过高的温度会造成胶的皱缩，一般控制其凝结温度为30℃左右。

6．样品的制备及电泳
取发酵豆粕1.0g，加入20.00ml 0.03 mol/L的Tris-HCl(pH=8.0)(包括0.01 mol/L 的β-巯基乙醇)在室温下浸泡1小时后（每10分钟搅拌一次），10000rpm下离心20分钟，取上清液80μl，加入20μl 5×样品缓冲液（5×loading buffer 蓝色），沸水浴3分钟后，进行SDS-PAGE电泳：取各样品溶液10μl分别加入到凝胶槽中，开启稳压电源开关，设置电压180v进行电泳，当样品缓冲液的蓝色条带迁移到凝胶底部时结束电泳，将凝胶用拨胶版小心剥下，放入装有染色液的容器中，染色10min后将染色液倒掉，加入脱色液进行脱色，直到凝胶的背影颜色为初始的白色且条带清晰可见为止。

7 结果判定
对比豆粕的抗原条带上，直接判读发酵豆粕中抗原蛋白的降解情况。

结果判定方法如下：完全降解：-，基本降解：++，降解不完全：+++，没有降解：++++
发酵豆粕中不良寡糖的定性检测
——薄板层析法（TLC）
1 适用范围
本标准适用于测定发酵豆粕中的寡糖的定性检测
2 原理
利用不同大小的糖分子在硅胶薄板上的扩散速度的大小不同，将发酵豆粕中的寡糖分开。

3 仪器设备
3.1 硅胶板：10＊10 cm（建议购至青岛海洋化工）
3.2 层析缸（可供放置硅胶板）与硅胶板配套
3.3 烘箱（控制温度70℃和140℃）
3.4 移液枪(10μl)以及其配套枪头；（建议使用金花牌）
3.5 高速离心机；
3.6 250ml具塞锥形瓶
4 试剂
4.1乙醇，分析纯；
4.2正丙醇，分析纯；
4.3乙酸，分析纯；
4.4 1-萘酚，分析纯；
4.5 正磷酸，分析纯；
5 试剂的配制
5.1 展开液：正丙醇：乙酸：水＝1:1:0.1(V/V/V)
5.2 显色液： 1-萘酚 1g
磷酸 100ml
乙醇 900ml
共 1000ml
6 试样的选取与制备
6.1 选取具有代表性的饲料样品；
6.2 利用四分法将原始样品缩至30g；
7 测定步骤
7.1 寡糖（水苏糖和棉籽糖）标样（均购至sigma公司，也可用豆粕按6.2提取糖代替）分别称取寡糖0.01g溶于80%的乙醇溶液中，4℃保藏备用。

7.2 样品的预处理：
准确称取发酵豆粕样品5.0g于250mL三角瓶中，加入50.0mL 80％的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h。

取2mL浸提液，10000rpm离心10min，4℃保藏备用。

7.3 样品的测定：
在预制硅胶板上点样，点样量为5μL，点样干燥后在展开液中展开，展开至离硅胶板前沿约2cm处。

自然晾干后，喷淋显色液，在140℃下烘至显色（约2-3分钟）。

8 结果判定
对比硅胶层析板上，样品和标样的条带，直接判读发酵豆粕中寡糖的降解情况。

结果判定方法如下：完全降解：-，基本降解：++，降解不完全：+++，没有降解：++++
M：标样；1-8：不同厂家的发酵豆粕样品；。