发酵豆粕中抗原蛋白和不良寡糖的检测

发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测

——SDS-PAGE法

1．适用范围

本标准适用于测定发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测。

2．仪器设备

2.1蛋白电泳仪：

2.1.1 电泳仪；（建议使用：北京六一仪器DYY-2C型）

2.1.2 电泳槽；（建议使用：美国伯乐公司的mini型）

2.2 25μl微量进样器；

2.3 制胶装置；（与电泳槽配套出售，包括玻璃板(厚度分别为1.0 mm和 1.5mm各一套)，梳子，拨胶板）

2.4 移液枪(1000μl,200μl,10μl)以及其配套枪头；（属于常规实验耗材）

3．试剂

3.1 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED；（建议购至上海申能博彩，Chemisonic 进口分装，必须要进口的产品！国产做出来的结果很差）；分析纯；

3.2 无水酒精，分析纯；

3.3 甘氨酸，分析纯；

3.4 Tris，分析纯；

3.5 考马斯亮兰R250，分析纯；

3.6甲醇，分析纯；

3.7 冰醋酸，分析纯；

3.8 甘油（丙三醇），分析纯；

3.9 β-巯基乙醇，分析纯；

3.10 溴酚蓝，分析纯；

3.11 HCl，分析纯；

4.试剂的配置

4.1 SDS-PAGE溶液的配制：

30%丙烯酰胺的配制：丙烯酰胺 30.0g

N’N-甲叉双丙烯酰胺 0.8g

去离子水定容至100ml

4.2 10%过硫酸铵：将1g过硫酸铵溶于10.00ml去离子水中。

2.00mol/L Tris-HCl(pH=8.8)：称取Tris 121.14g溶于500mL蒸馏水中，用浓盐酸

调节pH至8.8(要求准确)。

1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8)：称取Tris 60.57g溶于500mL蒸馏水中，用浓盐酸

调节pH至6.8(要求准确)。

10%SDS：称取5gSDS溶于50ml蒸馏水中。

1.0% 溴酚兰：称取0.05g溴酚兰溶于5ml蒸馏水中。

4.3 染色液：考马斯亮兰R250 0.25g

甲醇 45.40ml

冰醋酸 9.20ml

水 45.40ml

4.4 脱色液：甲醇 456.0ml

冰醋酸 72.0ml

水 472.0ml

4.5 4×分离胶缓冲液：2.00mol/L Tris-HCl(pH=8.8) 75ml

10%SDS 4ml

蒸馏水 21ml

10%过硫酸铵 5ml

4.6 4×堆积胶缓冲液：1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8) 50ml

10%SDS 4ml

蒸馏水 46ml

10%过硫酸铵 5ml

4.7 电泳缓冲液： Tris 3.0g

甘氨酸 14.4g

SDS 1.0g

定容至1L，用HCl调节pH为8.3。

4.8 5×样品缓冲液（5×Loading buffer 蓝色）：

1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8) 0.6ml

50%甘油 5.0ml

10% SDS 2.0ml

β-巯基乙醇 0.5ml

1.0% 溴酚兰 1.0ml

蒸馏水 0.9ml

4.9 5%浓缩胶的配制：（总4ml）

4.10 12%分离胶的配制：（总10ml）

4.11 0.03 mol/L的Tris-HCl样品浸提液

Tris 3.63g

β-巯基乙醇 0.7ml

定容至1L，用HCl调节pH为8.0

5. 聚丙烯酰胺凝胶的制备

将洁净的玻璃片置于制胶支架上（缺口朝里），放平、齐，压紧，将配好的16%分离胶，用1ml枪头从矮口的一侧缓慢加入，操作的过程中，禁止有气泡的生成，离矮面玻璃边缘2cm处，用医用注射器吸取1ml无水酒精，缓慢注入分离胶上，此时可以明显看出分离胶与无水乙醇的分层线，切不可过分晃动胶板，防止乙醇进入分离胶内部，阻碍其凝结。

待分离胶凝固后，倒出乙醇，并用滤纸轻轻吸干乙醇，用同样的方法继续注入5%浓缩胶，注满后插入进样梳，待其完全凝结，后拔掉进样梳，备用。

注意：温度的升高可加速胶的凝结速度，但是过高的温度会造成胶的皱缩，一般控制其凝结温度为30℃左右。

6．样品的制备及电泳

取发酵豆粕1.0g，加入20.00ml 0.03 mol/L的Tris-HCl(pH=8.0)(包括0.01 mol/L 的β-巯基乙醇)在室温下浸泡1小时后（每10分钟搅拌一次），10000rpm下离心20分钟，取上清液80μl，加入20μl 5×样品缓冲液（5×loading buffer 蓝色），沸水浴3分钟后，进行SDS-PAGE电泳：取各样品溶液10μl分别加入到凝胶槽中，开启稳压电源开关，设置电压180v进行电泳，当样品缓冲液的蓝色条带迁移到凝胶底部时结束电泳，将凝胶用拨胶版小心剥下，放入装有染色液的容器中，染色10min后将染色液倒掉，加入脱色液进行脱色，直到凝胶的背影颜色为初始的白色且条带清晰可见为止。

7 结果判定

对比豆粕的抗原条带上，直接判读发酵豆粕中抗原蛋白的降解情况。结果判定方法如下：完全降解：-，基本降解：++，降解不完全：+++，没有降解：++++

发酵豆粕中不良寡糖的定性检测

——薄板层析法（TLC）

1 适用范围

本标准适用于测定发酵豆粕中的寡糖的定性检测

2 原理

利用不同大小的糖分子在硅胶薄板上的扩散速度的大小不同，将发酵豆粕中的寡糖分开。

3 仪器设备

3.1 硅胶板：10＊10 cm（建议购至青岛海洋化工）

3.2 层析缸（可供放置硅胶板）与硅胶板配套

3.3 烘箱（控制温度70℃和140℃）

3.4 移液枪(10μl)以及其配套枪头；（建议使用金花牌）

3.5 高速离心机；

3.6 250ml具塞锥形瓶

4 试剂

4.1乙醇，分析纯；

4.2正丙醇，分析纯；

4.3乙酸，分析纯；

4.4 1-萘酚，分析纯；

4.5 正磷酸，分析纯；

5 试剂的配制

5.1 展开液：正丙醇：乙酸：水＝1:1:0.1(V/V/V)

5.2 显色液： 1-萘酚 1g

磷酸 100ml

乙醇 900ml

共 1000ml

6 试样的选取与制备

6.1 选取具有代表性的饲料样品；