发酵豆粕检测方法
发酵豆粕各项指标检测方法与实用实用标准
发酵豆粕各项指标检测方法与标准发酵工艺2010-12-31 15:16:17 阅读86 评论0 字号：大中小订阅1、水份、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰份、钙和磷的分析方法全部采用国标法。
2、总有机酸测定采用氢氧化钠滴定的方法和乳酸测定采用气象色谱。
3、pH的测定采用玻璃电极pHS-3C型pH计测定。
4、可溶蛋白的测定方法5、小肽含量的测定水份的测定水份测定直接参见国标测定完水分后的样品需要测定其中的总有机酸的含量，其数值为A，并计算有机酸的挥发量。
水份含量的计算时应当扣除这部分有机酸的挥发量，否则会出现水分超标现象。
总有机酸检测试剂：NaOH标准溶液（邻苯二甲酸氢钾标定），酚酞指示剂仪器:磁力搅拌器离心机方法：（1）取发酵后鲜样品15g 置于150ml烧杯中加入溶于100ml去离子水，在磁力搅拌器上浸提30min。
（2）取部分浸提样离心10min(3000r/min)。
（3）取上清液15ml, 加30ml去离子水稀释（以消除底色的影响），加酚酞指示剂四滴，用0.1molNaOH 标准溶液滴定，并记录到终点消耗NaOH体积。
（终点到溶液呈现粉红）计算乳酸（％）＝N(NaOH)×V(NaOH) ×0.09008/15×115/15gN(NaOH):NaOH标准溶液的浓度；V(NaOH) ：消耗NaOH标准溶液体积；0.09008：乳酸的毫克当量。
0.1mol氢氧化钠的配制与标定1、配制：称取9.6g氢氧化钠，溶于100ml水中，摇匀，注入聚乙烯容器中，密闭放置至溶液清亮。
用塑料管虹吸5ml的上清液，注入2000ml无二氧化碳水中(将去离子水煮沸5分后冷却)，摇匀。
2、标定称取0.67g于105~110℃烘至恒重的基准的邻苯二甲酸氢钾，准确至0.0001g，溶于50ml的无二氧化碳水中，加4滴酚酞指示剂（0.1％），用配制好的氢氧化钠溶液滴定至溶液呈粉红色，同时作空白试验。
发酵豆粕的检测方法
发酵豆粕的检测方法引言发酵豆粕是一种富含营养的饲料原料，通过发酵过程可以改变其营养成分和口感等特性。
为了确保发酵豆粕的品质和安全性，需要进行一系列的检测方法。
本文将介绍发酵豆粕的检测方法，并重点讨论营养成分、微生物、重金属以及有害物质的检测方法。
营养成分是评价饲料品质的重要指标之一、以下是一些常用的发酵豆粕营养成分的检测方法：1.水分含量检测：采用干燥法测定。
2. 粗蛋白含量检测：采用Kjeldahl法测定。
3. 粗脂肪含量检测：采用Soxhlet萃取法测定。
4. 粗纤维含量检测：采用Weende方法、AOAC方法或Van Soest方法测定。
5.粗灰分含量检测：采用高温炉燃烧法测定。
微生物含量是评估发酵豆粕安全性的重要指标。
以下是一些常用的发酵豆粕微生物检测方法：1.总菌落计数：采用平板计数法或膜过滤法。
2.酵母和霉菌计数：采用平板计数法或膜过滤法。
3.大肠菌群检测：采用MPN法或膜过滤法。
4.乳酸菌计数：采用平板计数法或膜过滤法。
重金属含量是评估发酵豆粕的环境污染程度的重要指标。
以下是一些常用的发酵豆粕重金属检测方法：1.铅和镉的测定：采用火焰原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法。
2.汞的测定：采用氢化物液相色谱法或电感耦合等离子体质谱法。
3.铬、镍、锰和锌的测定：采用火焰原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法。
有害物质的含量是评估发酵豆粕的安全性的重要指标。
以下是一些常用的发酵豆粕有害物质检测方法：1.黄曲霉毒素的测定：采用高效液相色谱法或气相色谱法。
2.农药残留的测定：采用气相色谱法或液相色谱法。
3.病原体的检测：采用PCR法或快速培养法。
结论发酵豆粕的检测方法包括营养成分、微生物、重金属以及有害物质的检测方法。
这些方法可以评估发酵豆粕的品质和安全性，确保其在畜牧养殖中的应用效果。
在实际应用中，还需要根据具体情况选择合适的检测方法，并严格执行相关的检测标准，保证检测结果的准确性和可靠性。
发酵豆粕产品质量的鉴别及评价方法
发酵豆粕产品质量的鉴别及评价方法发酵豆粕是一种由大豆粕经过发酵处理而得到的产品。
它具有高蛋白、低脂肪的营养特点，被广泛应用于家禽饲料、牲畜饲料和水产养殖等领域。
在进行发酵豆粕的质量鉴别和评价时，我们可以从以下几个方面进行考虑：1.总体外观：观察发酵豆粕的外观，应该是均匀、颗粒分散，无结块和异物。
发酵豆粕颜色应均匀，没有明显的色差。
质量好的发酵豆粕应该具有清晰的豆酱香味，而不是有异味或受潮发霉。
2.外观形态：通过观察发酵豆粕的颗粒大小和形态，可以初步判断其品质。
颗粒大小应该均匀一致，不应有过大或过小的颗粒存在。
质量优良的发酵豆粕颗粒表面应该光滑，颜色均匀。
有些发酵豆粕还可能具有丝状外观，这是酵母菌发酵的产物，属于正常现象。
3.中间物含量：发酵豆粕中的中间物含量对于产品品质也有较大影响。
中间物是指在发酵过程中产生的有机物质，如糖、氨基酸等。
这些中间物质的含量可以通过化学分析来确定。
根据不同用途的要求，中间物含量应该控制在一定范围内，以确保产品的营养价值和安全性。
4.蛋白质含量：蛋白质是发酵豆粕的重要指标之一，通常用总氮量或粗蛋白含量来表示。
蛋白质含量可以通过氮的定量分析，再根据其发酵豆粕的氮蛋白质比来计算。
优质的发酵豆粕应具有较高的蛋白质含量，这对于动物的生长和发育至关重要。
5.水分含量：水分含量是发酵豆粕质量的重要指标之一，因为水分过高会导致发酵豆粕容易发霉、变质。
常用的方法来测定水分含量是采用称重法或干燥法。
根据不同用途的要求，水分含量应该控制在一定范围内，以确保产品的贮存稳定性和营养品质。
综上所述，发酵豆粕产品的质量鉴别和评价主要包括外观、外观形态、中间物含量、蛋白质含量和水分含量等指标。
通过对这些指标的检验和分析，可以快速、准确地鉴别和评价发酵豆粕的质量，以帮助用户选择优质的产品。
同时，也可以根据实际需要，进一步完善鉴别评价体系，提高鉴别评价的准确性和全面性。
发酵豆粕各项指标检测方法
发酵豆粕各项指标检测方法发酵豆粕是一种常见的饲料原料，其发酵过程可以提高饲料的消化率和营养价值。
为了确保发酵豆粕质量符合要求，需要进行各项指标的检测。
下面将介绍发酵豆粕各项指标的检测方法。
1.水分水分是判断发酵豆粕是否存在霉变和变质的重要指标。
水分的测定可以通过烘干法和红外干燥法进行。
烘干法是将样品在105℃下加热，然后进行重量测定，计算得到水分含量。
红外干燥法是利用红外辐射对样品进行加热，通过光学传感器测定样品的水分含量。
2.粗蛋白粗蛋白是发酵豆粕中的重要营养成分。
常用的粗蛋白检测方法有凯氏消解法和红外消解法。
凯氏消解法是将样品与酸和碱进行消解，然后利用定量分析方法测定样品中的氮含量，通过乘以样品的氮蛋白转化系数来计算粗蛋白含量。
红外消解法则是通过红外光谱仪测定样品中的氮谱带，然后根据标准曲线计算粗蛋白含量。
3.粗脂肪4.粗纤维粗纤维是发酵豆粕中的非消化性纤维成分。
常用的粗纤维检测方法有酸碱消解法和中性洗涤法。
酸碱消解法是将样品先用酸和碱进行消解，然后进行过滤和洗涤，最后干燥、称重，计算得到粗纤维含量。
中性洗涤法则是将样品浸泡在中性洗涤液中，进行过滤和洗涤，最后干燥、称重，计算得到粗纤维含量。
5.灰分灰分是发酵豆粕中的矿物质成分。
灰分的测定可以通过加热、烘干和称重来进行。
将样品在高温下加热，使有机物燃烧殆尽，然后进行干燥和称重，计算得到灰分含量。
6.外观和色泽外观和色泽是发酵豆粕的质量指标之一，可以通过目测来判断。
良好的发酵豆粕应该具有均匀的颜色和无异物的外观。
综上所述，发酵豆粕各项指标的检测方法主要包括水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分以及外观和色泽的检测。
这些检测方法能够全面评估发酵豆粕的质量，并确保其适合作为优质饲料原料使用。
发酵豆粕各项指标检测方法与标准
发酵豆粕各项指标检测方法与标准发酵豆粕各项指标检测方法与标准1、水份、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰份、钙和磷的分析方法全部采用国标法。
2、总有机酸测定采用氢氧化钠滴定的方法和乳酸测定采用气象色谱。
3、pH的测定采用玻璃电极pHS-3C型pH计测定。
4、可溶蛋白的测定方法5、小肽含量的测定水份的测定水份测定直接参见国标测定完水分后的样品需要测定其中的总有机酸的含量，其数值为A，并计算有机酸的挥发量。
水份含量的计算时应当扣除这部分有机酸的挥发量，否则会出现水分超标现象。
总有机酸检测试剂：NaOH标准溶液（邻苯二甲酸氢钾标定），酚酞指示剂仪器:磁力搅拌器离心机方法：（1）取发酵后鲜样品15g 置于150ml烧杯中加入溶于100ml去离子水，在磁力搅拌器上浸提30min。
（2）取部分浸提样离心10min(3000r/min)。
（3）取上清液15ml, 加30ml去离子水稀释（以消除底色的影响），加酚酞指示剂四滴，用0.1molNaOH标准溶液滴定，并记录到终点消耗NaOH体积。
（终点到溶液呈现粉红）计算乳酸（％）＝N(NaOH)×V(NaOH) ×0.09008/15×115/15gN(NaOH):NaOH标准溶液的浓度；V(NaOH) ：消耗NaOH标准溶液体积；0.09008：乳酸的毫克当量。
0.1mol氢氧化钠的配制与标定1、配制：称取9.6g氢氧化钠，溶于100ml水中，摇匀，注入聚乙烯容器中，密闭放置至溶液清亮。
用塑料管虹吸5ml的上清液，注入2000ml无二氧化碳水中(将去离子水煮沸5分后冷却)，摇匀。
2、标定称取0.67g于105~110℃烘至恒重的基准的邻苯二甲酸氢钾，准确至0.0001g，溶于50ml的无二氧化碳水中，加4滴酚酞指示剂（0.1％），用配制好的氢氧化钠溶液滴定至溶液呈粉红色，同时作空白试验。
3、计算氢氧化钠标准溶液的浓度按下式计算c（NaOH）=m/（V1-V2）×0.2042式中c（NaOH）——氢氧化钠标准溶液之物质的量的浓度，mol/l；V1——滴定用邻苯二甲酸氢钾之用量，ml；V0——空白试验氢氧化钠溶液之用量，ml；m——邻苯二甲氢钾之质量，g；• 0.2042——与1.00ml氢氧化钠标准液[c（NaOH）=1.000mol/l]相当的以克表示的邻苯二甲氢钾之用量。
发酵豆粕品质检测方法适用性
发酵豆粕品质检测方法适用性发酵豆粕是一种用微生物菌种发酵过的豆粕产物。
由于发酵过程中豆粕中的蛋白质、纤维等成分有所改变，以及微生物的介入，因此其品质特征也有所不同。
因此，为了评估和控制发酵豆粕的品质，需要进行相应的检测方法。
1.水分检测：水分是豆粕中的重要指标之一，也是影响其稳定性和保存期限的因素之一、常用的水分检测方法有称重法、烘箱法、红外干燥法等，其中红外干燥法由于其快速、准确、无需前处理等优点，适用于发酵豆粕的水分检测。
2. 蛋白质检测：蛋白质是豆粕的主要成分之一，也是发酵豆粕的重要品质指标。
常用的蛋白质检测方法有Kjeldahl法、紫外光谱法、近红外光谱法等。
其中，Kjeldahl法是目前广泛使用的方法，适用于发酵豆粕蛋白质的检测。
3.纤维检测：纤维是发酵豆粕中的另一个重要成分，对其品质和使用效果有一定影响。
常用的纤维检测方法有酸性洗涤法、中和洗涤法、NDF 含量测定法等。
其中，酸性洗涤法是一种相对简单、准确的方法，适用于发酵豆粕中纤维的检测。
5.氨基酸检测：氨基酸是豆粕中的重要营养成分之一，对动物的生长和发育具有重要影响。
常用的氨基酸检测方法有高效液相色谱法、离子交换色谱法等。
这些方法适用于发酵豆粕中氨基酸的检测。
6.微生物检测：豆粕发酵过程中存在大量的微生物，对产品的品质和安全性有重要影响。
常用的微生物检测方法有菌落计数法、PCR法、气相色谱法等。
这些方法适用于发酵豆粕中微生物的检测。
通过上述方法的组合应用，可以对发酵豆粕的水分、蛋白质、纤维、脂肪、氨基酸等多个指标进行综合评估，从而判断其品质特征和适用性。
在实际应用中，可以根据不同需求和使用目的，灵活选择适合的检测方法，进行品质评估和控制，以确保发酵豆粕的品质和安全性。
需要注意的是，以上只是一些常用的检测方法，随着检测技术的不断发展，可能会出现更加快速、准确的检测方法。
因此，建议在实际应用中关注和引入最新的检测技术和方法，以提高豆粕品质的检测水平和评估精度。
发酵豆粕品质检测方法适用性.pdfx
7S与11S 球蛋白的SDS-PAGE电泳
Ck 为发酵前豆粕中 提取的球蛋白。 M为低分子蛋白质标 准，分子量为14.4KD －97.4KD。 从图中可以看出：CK中存在7S球蛋白的三个亚基
与11S球蛋白两个亚基。
2.1发酵豆粕酸溶性蛋白（小肽）及其在碱性条件下 的变化
氨基酸含量分析： 氨基酸含量通过日立835-50氨基酸自动检测仪来 测定。
氨基酸种类 苏氨酸(Thr) 丝氨酸(Ser) 谷氨酸(Glu) 甘氨酸(Gly) 丙氨酸(Ala) 缬氨酸(Val ) 蛋氨酸(Met) 异亮氨酸(Ile) 发酵前豆粕（％） 发酵后豆粕（％）比值 1.945 2.153 7.231 2.287 2.350 2.522 0.568 2.356 2.237 2.808 9.534 2.702 2.693 3.144 0.670 2.543 1.15 1.30 1.32 1.18 1.15 1.20 1.18 1.08
浓缩胶浓度5%，分离胶浓度15% 7 2 S1 Y2 C A CK
结合上面分析结果，不同产品虽然电 泳结果存在较大差异，但它不能真正说明 谁优谁劣。
综合来看，影响蛋白质肽链空间结 构（或松散或紧密），电荷多少的条件， 如存放时间、干燥温度、干燥时间、盐种 类、盐浓度等都影响电泳结果，且经多重 加工后，碱溶性提取蛋白质不到全部蛋白 质的20%。因此，电泳胶的结果不能科学客 观反映蛋白质降解状况。
4.1大豆多肽分析方法 由于精确分析难度大，一般以三氯 乙酸-可溶性氮指数 (TCA-SNI)和水 解度(DH)表示。 对蛋白质水解由于存在内切酶和外 切酶的差距，上述方法不能完全准 确预示一个混合蛋白质或饲料原料 蛋白质水解状况。
如何评判和检测发酵豆粕的质量-
如何评判和检测发酵豆粕的质量?利用现代生物技术将豆粕转化为优质蛋白质饲料原料，是国际研究开发热点，产品问世不到十年，技术和产业化水平在国际上以丹麦最为突出。
我国在这方面的研究始于上世纪九十年代末，目前国内仍处于大规模产业化的初期，已有近百家企业生产发酵豆粕，但品质参差不齐，加之许多生产厂家片面宣传、有意或无意误导，使该类产品在市场上造成很大的混乱，用户无所适从。
如何评判和检测发酵豆粕的质量成为各饲料厂家，甚至有些发酵豆粕厂家(小厂)的一大难题。
1、豆粕发酵的目的明确豆粕发酵的目的，才能够确定评判发酵豆粕质量的主要指标。
豆粕经过发酵其主要目的有以下四个方面：1.1破坏豆粕中抗营养因子豆粕中含有胰蛋白酶抑制因子、低聚糖、凝集素、植酸、脲酶等抗营养因子，发酵过程中通过微生物、酶及发酵产生的有机酸的作用，使得抗营养因子被降解或者钝化，从而得到破坏。
1.2消除豆粕蛋白的抗原性豆粕中含有的 7S 和 11S 蛋白具有很强的抗原性，幼龄动物对其尤为敏感。
在发酵过程中，主要是通过将其降解而使其失去抗原性。
1.3降解大分子蛋白质豆粕中 11S 和 7S 蛋白分子量分别为 350KD 和180KD，通过发酵酶解，被降解为氨基酸及各种多肽，有利于动物的吸收利用。
1.4形成各种有益发酵产物目前豆粕发酵均采用枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等安全菌株，产品发酵后往往含有较高数量的有益菌和有机酸、蛋白酶等代谢产物。
2、发酵豆粕评判程序对发酵豆粕的评判，可以按四个步骤进行，需要检测的指标如下：2.1感官评判包括色泽、气味、细度。
豆粕经过发酵、干燥后颜色变深，优质的发酵豆粕皆为棕黄色或浅黄褐色。
如果颜色浅而与豆粕一致，有可能发酵程度不够或掺入其他浅色蛋白原料;如果颜色过深(如深褐色)，则表明干燥过度，发生美拉德反应。
发酵豆粕的气味根据菌种和生产工艺的不同，也略有差异，但均应无豆腥味和霉味。
一般为酸香味(较浓郁)，酸味较浓的产品是以乳酸菌发酵为主，该类产品损耗低、成本低、有机酸含量较高、诱食效果较好，可部分降解抗营养因子、粗蛋白一般可提高4-5%、消化吸收率较高。
发酵豆粕的检测方法
2.3 酚酞指示液：取酚酞 1g，加乙醇 100mL 使溶解，即得。
3.仪器、设备
3.1 分析天平，感量 0.001g。 3.2 容量瓶：100、1000mL。 3.3 烧杯：100 mL。 3.4 磁力搅拌器。 3.5 高速离心机。 3.6 离心管：50mL。
称取粉碎试样 3-5g（精确至 0.01g）于 250mL 三角瓶中。吸取 100mL 20℃ 蒸馏水于三角瓶中，振摇使试样不结块，均匀分散。 将三角瓶固定于摇床，温 度控制在(20 士 2)℃.，振荡 60 min。 取下三角瓶，将溶液用中速定性滤纸过 滤。过滤完毕后，取 10mL 上清液，上机蒸馏、滴定；或采用常量直接蒸馏式或 半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置蒸馏、滴定。 4.1.2 计算
游离氨含量（﹪）={[(V-V0)×C×0.017×100]/(m×10)}×100% 式中： V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； C ——盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； m ——试样的质量，单位为克（g）； 0.017——铵根离子的毫克当量数。 4.2 小肽含量的测定 4.2.1 操作步骤 称取发酵豆粕 m 3～5g（准确至 0.0001 g）于 250mL 具塞三角瓶内，准确加 入 100.00mL 150g/L 的三氯乙酸溶液。摇匀后，室温振荡 30min，静置 5min，将 上清液倒入 50mL 离心管内,4800r/min，离心 15min。 取上清液 10.00mL 于消化管内，加入 2g～3g 混合催化剂，12mL 浓硫酸，420℃ 消化 1.5h。冷却后，缓慢向消化管内加入约 10mL 蒸馏水，摇匀，冷却后蒸馏。 2%的硼酸溶液吸收，0.1mol/L 的盐酸溶液滴定，消耗盐酸体积 V。 4.2.2. 计算：
发酵豆粕质量鉴定
发酵豆粕质量鉴定发酵豆粕是一种通过微生物发酵制作的豆粕产品，具有较高的营养价值和生物利用率。
其质量鉴定是生产和销售过程中的关键环节，对于保障产品质量和消费者权益具有重要意义。
发酵豆粕的生产工艺发酵豆粕的生产主要包括原料准备、发酵、压榨和干燥等工艺步骤。
首先将豆类原料进行清洗、脱皮、破碎，然后添加适量水和酵素发酵，控制好温度、酶活性和发酵时间，使豆粕中的蛋白质、脂肪等成分得以有效分解和转化。
最后通过压榨和干燥工艺，制得成品发酵豆粕。
发酵豆粕的质量鉴定指标1.蛋白质含量：蛋白质是豆粕的重要营养成分，蛋白质含量高低直接影响产品的营养价值。
2.氨基酸组成：氨基酸是蛋白质的组成单位，不同种类的氨基酸含量及比例对产品的质量有重要影响。
3.水分含量：水分含量过高容易导致产品变质，影响保存期限和稳定性。
4.纤维素含量：纤维素是发酵豆粕中的一种重要成分，对于动物的消化吸收有一定的益处。
5.微生物含量：发酵过程中的微生物种类和数量应符合规定标准，避免产品受到污染。
6.异物含量：产品中应无异物杂质，确保产品的纯度和安全性。
发酵豆粕质量鉴定方法1.化学分析：通过化学分析仪器对产品样品进行蛋白质含量、氨基酸组成、水分含量等指标的测定。
2.显微镜观察：通过显微镜观察产品样品的外观、颗粒大小等特征，判断产品质量是否符合标准。
3.微生物检测：利用微生物检测技术对产品中的微生物种类和数量进行检测，确保产品的卫生安全性。
4.红外光谱分析：通过红外光谱仪器分析样品的特征频率，了解其大分子结构和成分。
5.密度测定：利用密度计检测产品的密度值，判断产品的致密程度和结晶性。
发酵豆粕质量鉴定的意义通过对发酵豆粕的质量鉴定，可以保障产品的质量稳定性和安全性，提高产品的市场竞争力和消费者信任度。
同时，合理的质量鉴定方法可以帮助生产企业及时发现问题，并进行合理控制和调整，确保产品在生产过程中保持较高水准的质量。
综上所述，发酵豆粕的质量鉴定是生产和销售过程中不可或缺的环节，需要通过科学的方法和严格的标准来进行，以确保产品的质量和安全性，为消费者提供优质的产品。
发酵豆粕中有机酸测定
乳酸的测定——NaOH滴定法1 原理根据酸碱中和反应的实质: H++OH-= H2O，即K·C标·V标= C待·V待。
已知碱的体积,并知道NaOH标准溶液的物质的量浓度,可以计算出发酵豆粕中总酸的含量（由乳酸折算成总酸）。
2 试剂和材料2.1 NaOH标准溶液[C(NaOH)=0.1mol/L]：称取4.000g NaOH溶于1000mL新沸过的冷水中。
标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.6g,精密称定，加新沸过的冷水50mL，振摇，使其尽量溶解，加酚酞指示液2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。
每1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。
2.2 NaOH标准溶液[C(NaOH)=0.02mol/L]：0.1 mol/L NaOH标准溶液加新沸过的冷水稀释制成。
必要时，可用盐酸滴定液（0.02mol/L）标定浓度。
2.3 酚酞指示液：取酚酞1g，加乙醇100mL使溶解，即得。
3.仪器、设备3.1 分析天平，感量0.001g。
3.2 容量瓶：100、1000mL。
3.3 烧杯：100 mL。
3.4 磁力搅拌器。
3.5 高速离心机。
3.6 离心管：50mL。
3.7 碱式滴定管：10或20mL。
3.8 pH计：分度值0.05。
3.9 粉碎机。
4 测定步骤准确称取样品m (一般10.0g)，加到250mL 烧杯中，加蒸馏水100mL （因搅拌时一些粉末会贴壁，需用玻璃棒，可先加90mL ，再用10mL 冲洗玻璃棒），在磁力搅拌器上搅拌30min 后，干过滤于锥形瓶中（或转入50mL 离心管中，4000rpm 离心5min ），准确移取滤液10.00mL ，加入40.00mL 新沸过的冷水后，用0.02M 的标准NaOH 溶液滴定，酚酞为指示剂（2-3滴），至溶液变为粉红色为滴定终点（若样品颜色太深，难以观察终点，以pH =8.15为滴定终点）。
您须知道的发酵豆粕真正品质评判的测定方法说明【五】
您须知道的发酵豆粕真正品质评判的测定方法说明【五】发酵豆粕中的小肽与抗原蛋白是衡量品质优劣的两项重要指标，长期以来国内的发酵豆粕产品主要由乳酸菌通过厌氧发酵生产，而出于便捷考虑，业内通常使用酸溶蛋白法测定小肽含量，使用ELISA法测定抗原蛋白含量，但随着发酵豆粕使用普遍性提高，并且芽孢杆菌通过有氧发酵生产的发酵豆粕在国内市场上渐露锋芒，这两种测定方法是否适用，是否能作为客观反映小肽和抗原蛋白真实含量的指标，引起了关注与讨论。
1 小肽-酸溶蛋白法①不同pH 发酵(或酶解)的豆粕在酸中的溶解度不同微生物发酵过程中对蛋白质的分解，实质上就是微生物产蛋白酶的作用。
但是，不同酸碱性的蛋白酶酶解豆粕所得的小肽在酸中的溶解度不同，其中酸性蛋白酶酶解小肽高达96%可以溶于三氯乙酸，而碱性蛋白酶酶解小肽不到 50%。
因此，酸溶蛋白更适合评估酸性发酵或酶解的豆粕产品，将低估希杰速益肽这类芽孢杆菌发酵的中偏碱性产品的小肽含量(刘慧珍，江南大学硕士论文，2007)。
速益肽 55%CP 产品酸溶蛋白相对低(6-10%)。
②小肽应有明确的分子量定义食品国家标准《大豆肽粉GBT 22492》2008 版将小肽的定义由③酸溶蛋白只体现了速益肽小肽含量的一小部分希杰研究所实验发现，同时测定的发酵豆粕样品整体蛋白分布(红色峰)和三氯乙酸溶解后上清液的蛋白分布结果(蓝色峰)。
三氯乙酸提取的分子量5kDa 以下蛋白质部分，而红色图谱和蓝色图谱之间存在一个灰色的面积区域是三氯乙酸没有办法提取出来的样品中的肽含量的部分，即三氯乙酸并不能完全溶解出样品中的所有的肽，只能溶解出其中的一小部分(如下图)。
2 抗原蛋白-ELISA 法和SDS 法①ELISA 法测定加工豆类产品的缺陷致敏性不确定：目前已有商品化大豆抗原蛋白的检测试剂有大豆球蛋白检测试剂盒和β-伴大豆球蛋白检测试剂盒，但是另两种大豆抗原蛋白 Gly m Bd 30K 和 Gly m Bd 28K 并没有商品化试剂盒。
发酵豆粕中抗原蛋白和不良寡糖的检测
发酵豆粕中抗原蛋白和不良寡糖的检测发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测——SDS-PAGE法1．适用范围本标准适用于测定发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测。
2．仪器设备2.1蛋白电泳仪：2.1.1 电泳仪；（建议使用：北京六一仪器DYY-2C型）2.1.2 电泳槽；（建议使用：美国伯乐公司的mini型）2.2 25μl微量进样器；2.3 制胶装置；（与电泳槽配套出售，包括玻璃板(厚度分别为1.0 mm和 1.5mm各一套)，梳子，拨胶板）2.4 移液枪(1000μl,200μl,10μl)以及其配套枪头；（属于常规实验耗材）3．试剂3.1 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED；（建议购至上海申能博彩，Chemisonic 进口分装，必须要进口的产品！国产做出来的结果很差）；分析纯；3.2 无水酒精，分析纯；3.3 甘氨酸，分析纯；3.4 Tris，分析纯；3.5 考马斯亮兰R250，分析纯；3.6甲醇，分析纯；3.7 冰醋酸，分析纯；3.8 甘油（丙三醇），分析纯；3.9 β-巯基乙醇，分析纯；3.10 溴酚蓝，分析纯；3.11 HCl，分析纯；4.试剂的配置4.1 SDS-PAGE溶液的配制：30%丙烯酰胺的配制：丙烯酰胺 30.0gN’N-甲叉双丙烯酰胺 0.8g去离子水定容至100ml4.2 10%过硫酸铵：将1g过硫酸铵溶于10.00ml去离子水中。
2.00mol/L Tris-HCl(pH=8.8)：称取Tris 121.14g溶于500mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH至8.8(要求准确)。
1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8)：称取Tris 60.57g溶于500mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH至6.8(要求准确)。
10%SDS：称取5gSDS溶于50ml蒸馏水中。
1.0% 溴酚兰：称取0.05g溴酚兰溶于5ml蒸馏水中。
4.3 染色液：考马斯亮兰R250 0.25g甲醇 45.40ml冰醋酸 9.20ml水 45.40ml4.4 脱色液：甲醇 456.0ml冰醋酸 72.0ml水 472.0ml4.5 4×分离胶缓冲液：2.00mol/L Tris-HCl(pH=8.8) 75ml10%SDS 4ml蒸馏水 21ml10%过硫酸铵 5ml4.6 4×堆积胶缓冲液：1.00mol/L Tris-HCl(pH=6.8) 50ml10%SDS 4ml蒸馏水 46ml10%过硫酸铵 5ml4.7 电泳缓冲液： Tris 3.0g甘氨酸 14.4gSDS 1.0g定容至1L，用HCl调节pH为8.3。
发酵豆粕各项指标检测方法
发酵豆粕检测方法一、乳酸的测定1、试剂：NaOH标准溶液（邻苯二甲酸氢钾标定），酚酞指示剂2、仪器：磁力搅拌器离心机3、方法：（1）取发酵豆粕样品10g 置于150ml烧杯中加入溶于90ml蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌30min。
（2）取部分浸提样离心10min(3000r/min)。
（3）取上清液10ml, 加40ml蒸馏水稀释（以消除底色的影响），用0.1molNaOH标准溶液滴定至溶液PH=8.2为滴定终点。
记录消耗的NaOH体积，记录为V（ml）或（加酚酞指示剂四滴，用0.1molNaOH 标准溶液滴定，并记录到终点消耗NaOH体积。
（终点到溶液呈现粉红）4、计算乳酸（％）= C×（V－V0）×0.09008×90+mmC——NaOH标准溶液的浓度；V——样品消耗NaOH标准溶液体积；V0——未发酵豆粕消耗NaOH标准溶液体积；0.09008——乳酸的毫克当量。
m——样品质量二、pH的测定称取样品10g与100ml的烧杯中，移取90ml蒸馏水，搅拌30min后，用pHS-3C型pH计测定溶液的pH值。
三、小肽含量测定方法三氯乙酸（TCA）法1、原理：利用三氯醋酸作蛋白质沉淀剂，将发酵豆粕中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，经过滤、离心、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量，并以其占样品粗蛋白质的百分数来表示含量。
本方法是参照中华人民共和国轻工行业标准大豆肽粉标准(QB/ T 2653 -2004)基础上修订而来。
2、试剂及仪器：1）15％三氯醋酸溶液（TCA溶液）；2）4000 转/ 分钟的离心机。
3、方法：准确称取样品3克于100 ml烧杯中，准确加入15 %三氯乙酸溶液25 毫升，混合均匀，静置5 分钟，以中速定性滤纸干过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管，在4000 转/ 分钟下离心10 分钟，准确移取其上清液10ml于消化管中消化，按粗蛋白质测定方法测定其粗蛋白质含量。
发酵豆粕常见指标检测方法
实用标准文档粗蛋白含量检测(GB/T6432)一、原理：凯氏法测定样中的含氮量、即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。
加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。
二、仪器设备：1.高速粉碎机，粉碎时间1分钟。
2.分样筛； 0.45mm、40目3.分析天平；感量0.0001g4.消化炉5.滴定管；酸式50mL6.锥形瓶；250mL7.定氮仪；以凯氏原理制造的半自动蛋白测定仪三、试剂1.硫酸：含量98%2.氢氧化钠：40%水溶液（m/V）3.硼酸：2%水溶液（m/V）4.混合催化剂：0.4g硫酸铜(5个结晶水)，6g硫酸钾或硫酸钠，磨碎混匀。
5.混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。
6.0.1mol/L盐酸标准溶液：8.3 mL盐酸注入1000 mL蒸馏水中。
标定：减量法称取0.8g左右在270-300℃灼烧2h的无水NaCO3，加水50mL溶解，加10滴混合指示剂，用配好的盐酸滴定成暗红色，煮沸2min，冷却(水中)后再滴至暗红色，同时作空白试验(不加Na2C03)。
计算：m×1000C=(V1-V2)M式中: C——硫代硫酸钠标准溶液之物质的量浓度（mol/L）m ——无水碳酸钠的质量，gV 1 ——盐酸溶液的用量，mLV 2——空白试验盐酸溶液的用量，mLM ——无水碳酸钠的摩尔质量数值，单位为克每摩尔（g/mol ）〔M(1/2NaCO 3)=52.994〕7. 蔗糖8. 硫酸铵：分析纯，干燥四、分析步骤：（国标推荐法）1. 试样的消煮2. 称取试0.5g （含氮量5～80mg ）准确至0.0002g ，放入消化管中，加入6.4g 混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL 硫酸，于420℃消化炉中消化3小时。
冷却后，加入蒸馏水20ml ，待用。
全能生物科技发酵豆粕品控与检测
*异黄酮含量判断 A.发酵状况 B.是否参假
大豆中含量：128mg/100g 12种异构体，其中苷元类的染料木素最为稳定
检测方法：三波长243、263、283检测
异黄酮含量
3.50 3.00 2.50
原料
胰蛋白酶抑制因子
優肽100
Y
J
B
大豆球蛋白 400 300 200 100 0
120 100 80 60 40 20
原料 優肽100 Y J B
伴大豆球蛋白
*單位:mg/g
0
原料
優肽100
Y
J
B
特殊分析
•乳酸(提高适口性,抗菌)
•异黄酮(抗氧化,抗应激)
乳酸分析
•总酸检测
•HPLC检测(液相色谱仪) •分光光度计检测(尚开发中)
一般成分分析
水分, CP, PH,灰分,色泽
2013第一季竞品一般成分分析
项目 原料 优肽 100 Y J(BJ) J(M) 10.59 50.46 6.61 5.44 B 7.49 50.2 4.79 4.79
水份 12.19 5.62 8.01 7.42 CP 45.72 50.77 51.06 50.06 灰分 5.54 6.12 9.74 6.65 PH --- 4.70 5.4 5.96
粉碎处理
优肽-100®
管 制 原 因 检 测 设 备
原料质量 与安全
菌种最适 生长条件
菌种最适 生长条件
减少蛋白变性 提高消化率
减少颗粒 粒径大小
产品质量与 安全
NIR, ELISA
饲料原料 发酵豆粕水苏糖含量、β-伴大豆球蛋白含量测定方法
附录A（规范性附录）发酵豆粕水苏糖含量测定方法A.1方法原理采用高效液相色谱法(HPLC法)测定发酵豆粕中水苏糖含量。
A.2试剂所用的水为GB/T6682中规定的一级水。
A.2.1水苏糖标准品为色谱纯产品。
A.2.2乙腈为色谱纯。
A.3仪器设备A.3.1高效液相色谱仪。
A.3.2探头式超声仪。
A.3.3微膜过滤器（0.22μm）。
A.3.4实验室用粉碎机。
A.3.5样品筛：孔径0.25mm。
A.3.6分析天平：感量0.0001g。
A.3.7离心机：转速为12000r/min。
A.4分析A.4.1标样的制备分别精确称取水苏糖0.5000g，用水溶解并定容至50mL，即为10g/L储备液，经适当稀释后制成水苏糖标准溶液。
标准溶液使用前配制。
A.4.2样品的制备精确称取2.000g经粉碎过筛（孔径0.25mm）的发酵豆粕样品，用20mL水溶解，采用25kHz、探头式超声仪浸提，400W，15min，将浸提液于70℃水浴1h，加入0.5g三氯乙酸，混匀后冰浴2h，在12000r/min条件下离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤后作为样品溶液，取10μL样品液进行HPLC分析，样品制备后立即测定。
A.4.3样品的测定按HPLC法测定处理好的发酵豆粕样品中的水苏糖含量。
重复测定2次。
采用折光率检测器，色谱柱（氨丙基键合固定相柱，柱长250mm，内径4.1mm或其他可分析单糖和低聚糖的性能相当的色谱柱），柱温30℃，流动相乙腈-水(75:25)，流速1.0mL/min，检测波长280nm。
水苏糖的最低检出限为0.25 g/L～0.45g/L。
A.5结果计算以色谱峰面积对标准溶液浓度进行线性回归。
根据样品色谱峰面积对照水苏糖的标准曲线计算样品浓度。
A.6精密度A.6.1重复性在同一实验室，由同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于2%；以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。
A.6.2再现性在不同实验室，由不同操作人员用不同的仪器设备完成的两个测定结果，相对偏差不大于4%。
发酵豆粕质量鉴定
发酵豆粕教槽料是指猪出生5天后开始补料时至断奶后10 天内所使用的饲料。
在这期间乳猪的营养生理特点是：消化系统发育不完善，大部分消化酶的活性低，对植物性蛋白和淀粉的消化率低，主要依靠母乳的营养。
为达到提早...教槽料是指猪出生5 天后开始补料时至断奶后10 天内所使用的饲料。
在这期间乳猪的营养生理特点是：消化系统发育不完善，大部分消化酶的活性低，对植物性蛋白和淀粉的消化率低，主要依靠母乳的营养。
为达到提早乳猪猪诱食的目的，又能够克服乳猪断奶营养应激的效果，营养全面、适口性好、消化利用率高和降低腹泻的高品质的乳猪教槽料一直是科研人员研究的热点。
乳猪出生时胃内仅有凝乳酶，胃蛋白酶很少，由于胃底腺部缺乏游离盐酸，胃蛋白酶没有活性，不能很好地消化蛋白质，特别是植物性蛋白质。
这就要求在蛋白原料选择上，既要考虑原料的营养成分，又要考虑其适口性和乳猪的营养生理特点。
不能仅凭简单的实验室分析和资料的说明，应根据以往的经验和实际生产数据来进行选择。
1 蛋白质原料的选择蛋白质原料的选择应从消化率、氨基酸比例、降解产生小肽的速度、蛋白质含量和成本等多方面考虑。
在乳猪教槽料配方中，常用的蛋白质原料有血浆（球）蛋白粉、高蛋白的乳清粉、鱼粉、膨化大豆（豆粕）、发酵豆粕（大豆）和啤酒（核酸）酵母等等。
植物性蛋白中含有许多抗营养因子。
例如大豆抗原（主要以大豆球蛋白和B -伴大豆球蛋白为主）是一种致敏因子，是导致仔猪营养性腹泻的主要原因。
因此大家一直尽量少用植物蛋白，多选用动物蛋白。
动物性蛋白质也有一定的劣势，价格比较昂贵，一些动物性蛋白加工或储存不当容易携带或滋生病原体，鱼粉容易氧化产生过氧化物、组胺和肌胃糜烂素等，同时还有同源性比较近等生物安全问题。
这些问题常常困扰一些配方师，左右为难，难以取舍。
2 发酵豆粕的特点与优势发酵豆粕是利用现代生物技术将植物蛋白源同微生态技术完美结合在一起，是微生态制剂在饲料中原料化的一个体现。
发酵豆粕采用优质多菌种协同发酵，利用微生物丰富的酶系，将植物大分子蛋白降解为寡肽，并将植物蛋白中的抗营养物质如胰蛋白酶抑制因子、脲酶、血凝素、抗原蛋白等彻底分解，植物细胞壁100%破裂，蛋白质消化率大于95% ，显著改善了适口性和消化率。
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发酵豆粕检测方法（参考）目录1.检测用仪器简介 (2)2.变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳 (3)3.Elisa 大豆球蛋白（酶联免疫法） (6)4.小肽的检测（酸溶蛋白） (10)5.寡糖的检测——薄板层析法（TLC） (11)6.乳酸的检测 (12)7.蛋白溶解度的检测（PS） (13)8.发酵豆粕蛋白溶解度的检测（改良） (14)9.水溶性蛋白的检测 (15)10.挥发性盐基氮（VBN） (17)11.PH 值测定 (19)12.水苏糖含量的测定 (20)13.水分、粗蛋白、粗灰分、粗纤维、尿素酶活性的检测 (20)1、检测用仪器简介2、变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速而且可重复的方法。
通过对电泳条带的观察和分析，可以很明显的看出发酵前后或不同产品的抗原蛋白含量。
一、 原理SDS —聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳主要依据蛋白质的分子量对豆粕中的抗原蛋白进行分离。
SDS 与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折迭结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS —蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS —PAGE 因易于操作和用途广泛， 成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
二、 仪器 1、电泳仪及电泳槽 2、振荡器3、离心机（10000 转）4、移液枪（大、中、小）5、离心管（7ml 、5ml 或 1.5ml 、1ml ）三、 试剂： 1、单体母液： 100ml 丙烯酰胺（ACR ） 30g 甲叉双丙烯酰胺 0.8g去离子水定容至 100ml ，棕色瓶 4℃下存放。
可保存 3 个月。
2、分离胶缓冲液（（PH=8.8） 100mlTris-base （1.5mol/L ） 18.17gSDS 0.4g 浓 HCL 调节 PH 至 8.8，定容至 100ml ，过滤，4℃存放。
3、浓缩胶缓冲SDS 0.4g 浓 HCL 调节 PH 至 6.8，定容至 100ml ，过滤，4℃存放。
4、10%（w/v ）过硫酸铵 1ml 过硫酸铵 0.1g去离子水1ml4℃密封存放，可保存 7 天。
电泳缓冲液1000mlTris-base 3.02g甘氨酸18.8gSDS 1g蒸馏水溶解定容。
6、样品缓冲液储液（2×）50ml浓缩胶缓冲液（4×）25mlSDS（固体干粉）2g甘油10ml溴酚兰20mgβ-巯基乙醇 2.5ml加去离子水溶解，-20℃保存。
7、染色液1000ml考马斯亮蓝R-250 2.5g乙醇454ml冰醋酸92ml蒸馏水454ml8、固定液1000ml甲醇450ml冰乙酸100ml蒸馏水450ml9、脱色液1000ml乙醇456ml冰乙酸72ml蒸馏水472ml10、蛋白抽提液（PH=8.0）1000mlTris-base 3.64gβ-巯基乙醇0.7ml浓 HCL 调节 PH 至 8.0，定容至 1000ml，4℃存放。
四、待测固体样品处理粉碎待测样品，过 80 目筛，分析天平精确称量 1.000g，用蛋白抽提液浸泡，料水比为 1:30，摇床中 160rpm、22℃震荡抽提 3h，8000rpm 离心 15min。
取上清液保存。
短期4℃，长期-20℃保存。
五、电泳过程1、密封：将胶板上好并安装在电泳槽中，注意电泳槽底面与侧面卡紧，以免漏液。
2、制样：取蛋白样品10μl，与相同体积的加样缓冲液混匀，沸水浴 5min，冷却后备用（4℃保。
存）3、制胶：分离胶的配制胶浓度18%单体母液（ml）7.2去离子水（ml） 1.8分离胶缓冲液（ml） 3.010%APS（μl）60TEMED（μl）20共配制 12ml 胶液，合适本实验双槽式电泳槽两板胶用量。
将胶液沿着玻璃板倒入两板之间的夹缝至离上板口 1.50cm 处，加入1ml 蒸馏水密封。
室温静置 1h 待其凝固。
凝固之后倒掉蒸馏水，并用滤纸将胶面吸干。
浓缩胶的配制胶浓度5%单体母液（ml）0.75去离子水（ml） 3.00浓缩胶缓冲液（ml） 1.2510%APS（μl）40TEMED（μl）12共配制 5ml 胶液，合适本实验双槽式电泳槽两板胶用量。
倒好胶后，插好梳子，使梳子孔中无气泡。
室温静置1h 待其凝固。
4、上样及电泳：以10μl移液器上样10μl，电泳条件主要采用稳压的方式：样品在浓缩胶时的电压为 47-50V，此时相应的电流一般是 16-18mA；电泳 1.5h 后，样品大概在分离胶时调节电压 125-145V，此时相应的电流为 30-35mA，电泳时间约 4h。
5、染色、脱色：电泳结束后，撤下胶板，切去浓缩胶，小心揭下分离胶，固定液漂洗 20min 后放入适量新鲜染色液染色 1h。
弃去染色液，用自来水漂洗至漂洗液无颜色，倒入适量脱色液脱色，隔 2h 换一次脱色液，直至凝胶出现清晰地条带为止。
3、Elisa 大豆球蛋白（酶联免疫法）检测方法提供方：国家饲料工程技术研究中心产品：大豆球蛋白（Glycinin）定量测定试剂盒，生产厂家：北京龙科方舟生物工程技术有限公司原理本试剂盒采用间接竞争ELISA 方法，在酶标板微孔条上预包被大豆球蛋白抗原，样品中的大豆球蛋白和微孔条上预包被抗原竞争抗大豆球蛋白抗体，加入酶标二抗后，用TMB 底物显色，样品吸光度值与其所含大豆球蛋白的含量成负相关，与校准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中大豆球蛋白的含量。
适用范围可定量检测大豆及其深加工产品（豆粕、发酵豆粕、膨化大豆、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白等）中大豆球蛋白的含量。
试剂和组成（1）试剂（2）其它盖板膜 3 张、自封袋 1 个、移液器吸头 10 个步骤：（1）试剂配制1X样品提取工作液的配制：将30X样品提取液用双蒸水或去离子水按1：29体积比进行稀释（例如配制总体积为300ml1X样品提取液，首先量取290ml双蒸水或去离子水置于容器中，再量取10ml30X 样品提取液加到装有290ml双蒸馏水或去离子水的容器中混匀即得），用于样品中大豆球蛋白的提取。
1X洗涤工作液的配制：将20X浓缩洗液用双蒸水或去离子水按1：19体积比进行稀释（例如配制总体积为200ml1X洗涤工作液，首先量取190ml双蒸水或去离子水置于容器中，再量取10ml20X 浓缩洗液加到装有190ml双蒸馏水或去离子水的容器中混匀即得用于酶标板的洗涤。
（2）样品前处理将待检样品粉碎成60目以上颗粒，称取0.1g样品加入到已配好的30ml1X样品提取工作液中（见试剂配制），于25℃振荡提取12-16小时，静止20分钟,取上清液用样品稀释液稀释到工作浓度，建议每份样品稀释成多个浓度（豆粕、发酵豆粕、膨化大豆样品建议稀释比例为1:300）。
（3）样品检测1.将所需试剂从冷㯿环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30分钟以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2.取出需要数量的酶标板条，将不用的酶标板条放入自封袋，于2-8℃干燥保存。
3.洗涤工作液在使用前也需回温。
4.编号：将样品和校准品对应微孔按序编号，每个样品和校准品做2孔平行，并记录校准品孔和样品孔所在的位置。
5.加校准品/样品：将6种校准品以及待测样品各50ul到对应的微孔中，再加入抗体工作液50ul/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30分钟。
6.洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见试剂配制）300ul/孔充分洗涤5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）。
7.加酶标试剂：加入酶标试剂100ul/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光反应30分钟，取出重复洗板步骤6。
8.显色：将等体积底物液A与底物液B放入干净容器中，振荡混匀。
加入AB混合液100ul/孔，用盖板膜盖板后，置37℃避光反应15分钟。
9.测定：加入终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm 处（建议用双波长与 450/630nm 检测，在 5 分钟内读完数据），保存每孔吸光度值。
（4） 结果计算结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。
注意样品吸光值与大豆球蛋白的含量成负相关。
1.用样品的平均吸光度值 校准值比较即可得出其浓度范围。
例如样品1的吸光度值为 0.301，样品2的吸光度值为0.712，校准品吸光度值分别是：0ug/ml 为1.952；0.1ug/ml 为1.420；0.3ug/ml 为0.980；0.9ug/ml 为0.464；2.7ug/ml 为0.256；8.1ug/ml 为0.152。
则样品1的浓度范围是0.9ug/ml-2.7ug/ml ，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中大豆球蛋的浓度范围；样品2的浓度范围是0.3ug/ml-0.9ug/ml ，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中大豆球蛋白的浓度范围。
2. 定量分析2.1 百分吸光率的计算校准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即 百分吸光度值（%）=BB0×100%B —校准品2-6溶液或样品溶液的平均吸光度值 B0—校准品1的平均吸光度值2.2 校准曲线的绘制与计算以校准品百分吸光率为纵坐标，以大豆球蛋白校准品浓度的对数为横坐标，绘制校准曲线图。
将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度， 乘以其对应的稀释倍数即为样品中大豆球蛋白的实际浓度。
如图：也可利用试剂盒所带配套分析软件，便于大量样品的准确、快速分析。
性能参数（1）样品线性回归与预期浓度相关系数≥0.98 。
（2）批内变异系数≤10%批间变异系数≤15%注意事项（1）室温低于20℃或试剂及样品没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的吸光度值偏低。
（2）在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。
所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
（3）每加一种试剂前需要将其摇匀。
（4）反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
（5）不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
（6）储存条件保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新干燥密封。
校准品和底物液B 对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
（7）试剂变质的迹象：发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。