质粒DNA的提取和PCR技术讲义
质粒DNA的提取与PCR详解
◆溶液Ⅲ
5mol/Ｌ乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
◆异丙醇 ◆无水乙醇
四.试验步骤:
(1)培养细菌:大肠杆菌接种到LB培养基2ml-5ml 中,37度振荡培养8-16小时.
(2)取培养液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm 离心3分钟,去掉上清液，重复收集一次。加入 300ul溶液Ｉ,充分吹打混匀后,室温放置5分钟.
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步 骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分 离和纯化质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高 pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂， 将质粒DNA释放到上清液中。碱性溶剂使碱 基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于 处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地 超螺旋结构。在裂解过程中，细菌蛋白质、破 裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕 成大型复合物，与PDS一起沉淀。离心除去变 性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。
• 在细菌的细胞内，质粒以超螺旋形式 （cccDNA）存在。在提取质粒的过程中，还 有另外两种存在形式：线性（linear DNA）和 松弛型(ocDNA)。
三. 试剂:
◆溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0)
◆溶液Ⅱ
H2O 引物1
9 ul 0.5ul
引物2 0.5ul
质粒模版 0.5ul
(二) PCR循环条件
94℃
3 min
94℃
30 s
60 ℃ 30 s 30 cycle
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒 DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应 )在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA ，使目的 DNA 按 2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A. 变性：加热反应系统至95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。
B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（ 35－70℃, 一般低于模板 Tm 值的 5℃左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。
C. 延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq 酶作用下，以dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒 DNA 的提取与制备(1). 碱裂解法：染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异：A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒 DNA 均变性；B. 当以高盐缓冲液调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2). 离心层析柱：A. 硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA ，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。
3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 :DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰C. A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应DNA 的纯度；A260/A280=1.8DNA 纯净A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。
质粒DNA的提取定量PCR鉴定
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定量PCR：使用定量PCR仪进行定量PCR反应，获取质粒DN的拷贝数
提取质粒DN：使用碱裂解法或柱层析法等方法提取质粒DN
数据分析：使用定量PCR软件分析定量PCR结果，获取质粒DN的拷贝数
结果验证：使用电泳法或荧光定量PCR等方法验证定量结果
定量注意事项
确保样品的纯度和完整性
PCR反应需要四种主要成分：模板DN、引物、DN聚合酶和dNTP
PCR反应可以快速复制特定的DN片段，用于基因克隆、突变检测、基因表达分析等领域
PCR反应体系
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模板DN：提供待扩增的DN序列
DN聚合酶：催化DN复制
Mg2+：稳定DN聚合酶活性
酶抑制剂：防止非特异性扩增
电泳试剂：用于电泳分析的试剂，如溴化乙锭、琼脂糖等
荧光定量PCR仪：用于定量PCR分析的仪器
实验步骤和实验操作
质粒DN提取：选择合适的菌株，培养至对数生长期，然后进行质粒DN的提取。
PCR鉴定：设计特异性引物，进行PCR反应，然后进行电泳分析。
实验操作：按照实验步骤进行实验操作，注意操作规范和实验安全。
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因功能研究
PCR鉴定：用于基因突变、基因表达和基因功能研究
质粒DN提取和PCR鉴定：用于药物开发和生物制药
在基因工程中的应用
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因编辑等实验
PCR鉴定：用于检测基因突变、基因表达和基因拷贝数等实验
基因工程：通过改变生物的基因来改变其性状，如抗病、抗虫、抗除草剂等
质粒DNA的提取和PCR技术
3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时 如果能看到三条带，这三条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的 带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
操作步骤注意事项： 操作步骤注意事项
1。配置反应体系。 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 1ul 4种dNTP混合物 200umol/L 引物 各1～10pmol 模板DNA 10～200ng Taq DNA聚合酶 0.25u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 10ul 2。 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 50℃ 1分钟， 72℃ 1.5分钟， 共30轮循环。 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 4. 电泳结束，观察
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳 性的产生。
吸样枪:吸样枪污染值得注意.由于操作时不慎将样品或模板核酸 吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源。吸头、小离心管应 一次性使用 。 开关盖时注意不要接触到内壁，并且不要开盖时间太长，以免 污染。 2。预混和分装PCR试剂:PCR反应液应预先 配制好，然后小量 分装。节省时间并保证各管成分平行 。最好在加样时都在冰上 低温进行，以防止加入酶后反应立即开始。 3。阳性对照与阴性对照的设立。-重要！ 阳性对照与阴性对照的设立。 重要！ 阳性对照与阴性对照的设立 重要 有利于问题的解决， 有利于问题的解决，对于优化条件以及排除污染可能性都很有 用！
质粒DNA提取实验知识讲解
质粒D N A提取实验质粒DNA提取实验质粒DNA提取可以：（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。
质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。
提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增②细菌菌体的裂解③质粒DNA的纯化一、材料与试剂准备1. 材料：大肠杆菌。
2. 仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。
3. 试剂：（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。
（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。
（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。
（4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。
（5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。
二、实验步骤1.摇菌培养1）将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。
2）置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。
3）灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。
4）挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。
5） 37℃，180rpm，振荡培养过夜。
2.收获细菌并裂解1）离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。
2）用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。
3）细菌高速离心1min,彻底去除上清。
4）加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。
5）加入250ulLB溶液。
立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。
枯草芽孢杆菌质粒DNA的提取方法与PCR的设计
枯草芽孢杆菌质粒DNA的提取方法与PCR的设计班级：生物制药122 姓名：张泽伟学号：12243247一、枯草芽孢杆菌质粒DNA的提取1)菌体的培养与收集：挑取枯草芽孢杆菌的单菌落于2~10mlLB液体培养基中28~35℃振荡培养10~15小时，0.5~5wt%转接到40~150ml新鲜LB液体培养基中继续振荡培养，至细菌生长密度为OD600＝0.5~1.2，收集40~150mg菌体于离心管中；2）原生体的制备：向收集的菌体中加入1~1.5ml预冷的洗涤液A悬浮细胞，离心弃上清，菌体重悬于200~300μl细胞裂解液B，37℃温育1.5~2h；3）细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的上述溶液中加入200~300μl溶液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞，向裂解液中加入100~150μl溶液D，轻轻混匀，于20℃中放20~30min；4℃离心，将上清液转移至新离心管内，加入无水乙醇，20℃过夜；4℃离心，弃上清，70wt%乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入无菌纯水溶解沉淀；4）质粒的纯化：将制备好的上述溶液转移到一个干净的离心管中，加入25倍体积DNA联接液E到离心管中，用手颠倒15分钟混匀；将联接混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置15分钟，3000~10000rpm离心1~3分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入联接混合液离心，直至所有联接混合液离心完毕；将含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入300~700μl洗涤液F到结合柱中，离心，倒掉收集管中的废液；将结合柱重新放回收集管，8000~18000rpm离心15分钟；将结合柱装入新的离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30~50μl洗脱液G，不戳破膜，室温放置，8000~15000rpm离心1~3分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于20℃；其中洗脱液G为0.1mM的HCl，pH=9.0。
质粒DNA的提取与PCR详解
3. 质粒DNA的琼脂糖凝胶检测
DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分 子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带 负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场 强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛效 应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动 速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离 不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质 量相同,但构型不同的DNA分子。
H2O 引物1
9 ul 0.5ul
引物2 0.5ul
质粒模版 0.5ul
(二) PCR循环条件
94℃
3 min
94℃
30 s
60 ℃ 30 s 30 cycle
72 ℃ 1 min
72 ℃ 7 min
4℃
forever
电泳检测实验结果
(3)加入300ul新配置的溶液Ⅱ（100ul NaOH
+100ul SDS,用蒸馏水稀释至10ml）,轻柔颠倒510次,零下20度放置5分钟.
(4)加入300ul溶液Ⅲ,颠倒5-10次,放置5分钟.
(5)12000rpm离心15分钟,取上清液（不大于 700ul）于一新的Eppendorf管.加入等体积 异丙醇,混匀后放置5分钟,12000rpm离心 10分钟,弃去上清.
• 在细菌的细胞内，质粒以超螺旋形式 （cccDNA）存在。在提取质粒的过程中，还 有另外两种存在形式：线性（linear DNA）和 松弛型(ocDNA)。
三. 试剂:
◆溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0)
◆溶液Ⅱ
实验四、PCR扩增目的基因
实验目的：
1.学习PCR实验操作与原理 2.掌握PCR扩增基因电泳检测方法
质粒DNA的抽提、纯化与检测ppt课件
常用限制性内切核酸酶有高度特异的碱基识别序列 和切割点。
例如 EcoRⅠ的切割位点： ５′－ G ▼A A T T C －３ ′ ３′－ C T T A A▲ G －５ ′
Hind Ⅲ的切割位点：
3.4kb
EcoRⅠ
2.5kb
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体， 如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
如何获得批量的纯化质粒DNA分子？
〔一〕载体的制备 ： 质粒DNA的提取与纯化
提取方法概述
常用方法 碱裂解法 煮沸裂解 氯化铯密度梯度离心法
试剂盒法
根本步骤 培育细菌使质粒扩增
搜集和裂解细菌 分别、纯化质粒
碱裂解法分别纯化质粒DNA
双酶切体系的建立
质粒DNA
2μL
10×M Buffer
1μL
EcoR Ⅰ
1μL
Hind Ⅲ
ddH2O
6μL 合计
20μL
10μL
预备室教师已将其配 成2×限制性酶反响混
合液
21
重组质粒的酶切反响
20μL质粒
5μL质粒 〔冻存〕 5μL质粒 〔参与15μL TE〕 10μL质粒〔酶切〕
10μL 10μL
思索题
1. 碱裂解法分别纯化质粒DNA根本原理是什么？结合根本原 理分别讲述溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ发扬怎样的作用。
2. 实验操作中应留意哪些步骤？否那么能够产生怎样的后果？ 3. 如何经过电泳分析判别得到的质粒DNA的质量？ 4. 假设质粒DNA中残留有蛋白质或RNA，电泳后会出现什么结
果？
❖ 如今常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常 含抗生素抗性基因。
《DNA提取和pcr扩增》课件
在法医学中的应用
鉴定身份：通 过DNA提取和 PCR扩增，可 以确定死者的
身份
亲子鉴定：通 过DNA提取和 PCR扩增，可 以确定亲子关
系
犯罪现场分析： 通过DNA提取 和PCR扩增， 可以分析犯罪 现场的DNA证
据
遗传病诊断： 通过DNA提取 和PCR扩增， 可以诊断遗传
量DNA
便携化：开发 便携式DNA 提取和PCR扩 增设备，方便
现场检测
成本降低：降 低DNA提取 和PCR扩增的 成本，使其更 广泛应用于科
研和临床
法规监管：应 对法规监管的
挑战，确保 DNA提取和 PCR扩增技术 的合规性和安
全性
感谢您的观看
汇报人：
03 PCR扩增
PCR原理
概念：聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。
原理：通过DNA聚合酶的催化，以四种脱氧核苷酸为原料，以引物为模板，经多次循环合成 新的DNA链。
步骤：高温变性、低温复性、中温延伸三个温度循环，使目的DNA片段指数级扩增。
应用：广泛用于基因克隆、基因突变、物种进化等研究领域。
表观遗传学：研究基因表达调控的机制，包括DNA甲基化、组蛋白修 饰、非编码RNA等
单细胞基因组学：研究单个细胞的基因组，包括单细胞测序、单细胞转 录组测序等
空间基因组学：研究基因组在空间上的分布和相互作用，包括空间转录 组测序、空间蛋白质组测序等
合成生物学：设计和构建具有特定功能的生物系统，包括基因编辑、基 因合成、生物合成等
DNA提取和PCR扩 增
,
汇报人：
目录 /目录
01
质粒DNA的提取酶切及检测课件
用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 Rd菌株用d，即Hind。
如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
•质粒DNA的提取酶切及检测
•18
II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于 这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都 是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识 别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核 苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8 个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限 制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向 “读”都完全相同。这种酶的切割可以有两 种方式：
12000rpm，离心2min，取上清记录体积到一新管
上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），室温2min
•质粒DNA的提取酶切及检测
•14
12000rpm，离心5min
沉淀用70%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）
12000rpm，离心2min
沉淀风干
沉淀用20uL TE溶解，-200C保存
•质粒DNA的提取酶切及检测
•13
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性
12000rpm，离心5min，取上清记录体积到一新管
上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）
n EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： EcoRⅠ:G↓AATTC;HindⅢ:A↓AGCTT 。G，A 等核苷酸表示酶的识别序
DNA和质粒抽提PPT课件
.
11
（四）分泌物
（以痰液为例） 痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，深部
咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前 应先漱口，以避免混入大量的口腔脱落的上皮细 胞和唾液等影响检测结果
.
12
结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液 去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸， 使用生理盐水后取上清液
.
6
AB C D
mRNA逆转录后RT-PCR结果（0、3、6个月）
.
7
（二）血浆和血清
血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标 本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等 释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广 泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测中
.
8
血浆DNA又称为循环DNA，是一种无细胞状态的 胞外DNA，主要是游离的单链、双链DNA或DNA蛋白质的混合物
2）长期贮存： TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿 可有效防止细菌和核酸的污染。
.
29
第二部分 基因组DNA的分离与纯化
.
30
一、DNA样品准备
常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织：
最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 － 70℃或液氮
.
31
二、DNA提取
.
5
DNA提取前样本采集、预处理和保存：
（一）全血 1.抗凝剂
EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素
抗凝剂处理血
肝素 柠檬酸* EDTA*
-80℃ 保存2个月，第10天收率90%
4℃ 室温
质粒DNA提取讲课文档
第十页，共50页。
2.2 质粒的构建
（切割目的基因和载体）
（
DNA
（连接目的基因和载体）
分 （分离目的基因）
子
克
隆
）
（表达目的基因）
（转化宿主细胞）
（筛选标记基因）
第十一页，共50页。
2.3 质粒的应用
➢ 运送外源基因高效转入受体细胞。 ➢ 为外源基因提供复制能力或整合能力。 ➢ 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
第十八页，共50页。
3.2 试剂
产品组成 溶液P1（Buffer P1） 溶液P2（Buffer P2） 溶液P5（Buffer P5） 漂洗液PWT（Buffer PWT） 洗脱缓冲液TB（Buffer TB） Rnase A(10mg/mL)
TIANRed 吸附柱CP3（Spin Columns CP3) 收集管（Collection Tubes 2mL)
① 质粒具有自我复制的能力。 ② 质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。 ③ 质粒可自行丢失与消除。 ④ 质粒的转移性。 ⑤ 质粒可分为相容性与不相容性两种。
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2.1 载体的特点
① 具有复制起点。 ② 携带易于筛选的选择标记。 ③ 具备合适的酶切位点。 ④ 具有较小的相对分子质量和较高的拷
5
第五页，共50页。
1.1 质粒的定义
➢ 天 然 质 粒 的 DNA 长 度 从 数 千碱基对至数十万碱基对 都有。
➢ 一般来说，质粒的存在与 否对宿主细胞生存没有决 定性的作用。
➢ 它是基因工程最常见的运载 体。
第六页，共50页。
1.2 质粒的分类
1.接合性质粒 2.抗药性质粒* 3.产细菌素和抗生素质粒
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操作步骤及注意事项
1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中， 于37℃振荡培养14～18 h。-培养时间不能太长，否则细
菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。
2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心 12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可 能流尽。 3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振 荡，使菌体分散混匀。 4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要 剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞 膜裂解,DNA变性。-放置时间不能太长。因为在碱性条件下
1。培养细菌的容器用过后都要及时进行灭菌，细菌培养基上清
不要随便丢弃，应存放在一起进行灭菌处理，以免污染环境。
2。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿 异戊 醇时要在通风橱中进行，氯仿 可引起神经系统功能紊乱要引起 肝脏损害 。异戊醇其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有 刺激作用
3。电泳时注意避免EB污染。
基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋 白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。当加 入中和液后，因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏 但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态，离心 时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成 大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖，当加入溶液三后 形成PDS被离心时可沉淀下来。
PCR技术
❖ 基本原理 ❖ 反应动力学 ❖ 使用步骤及注意事项 ❖ 反应参数要素 ❖ PCR优化
PCR技术
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年 代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、 敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化
等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因 或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使
作用沉淀
4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白，为
tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚与水互溶。异戊醇的作用是降 低表面张力，可以减少泡沫
5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒 6.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时 如果能看到三条带，这三条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的
带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
实验室安全：
同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。 6.12000g离心10min取上清，加入等体积的苯酚/氯仿 /异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。-抽提掉
剩余蛋白。
7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入0.5~0.7 倍体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。-可
以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min 离心。不要沉淀太 久
取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。其次操作 过程注意：避免基因组断裂，除净蛋白，盐离子清洗干净。
质粒数量：同量摇菌量中质粒量取决于质粒拷贝数。低拷贝 数质粒可以通过添加氯霉素来增大拷贝数。
2。阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。
溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与 NaOH作用,减弱了其碱性。
肉眼能直接察和判断 。-可以用于基因克隆，目的
基因检测等。
发展：Taq DNA聚合酶：分离于温泉菌中，耐高温。 PCR和TaqDNA聚合酶被美国《科学》杂志1989年的 “年度分子”，并被列为80年代10项重大科学发明之 首
基本原理：
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退 火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条 新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延 伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链 又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
8.1ml 75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清，将 沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶解。 9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃ 水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
10.琼脂糖电泳检测。检测，定量。
其它注意事项：
1。质粒质量： 首先实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提
质粒DNA的提取和 PCR技术
质粒提取
❖基本原理 ❖操作步骤 ❖注意事项 ❖实验室安全
基本原理
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至 200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独 立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份.质粒已 成为目前最常用的基因克隆的载体分子，碱裂解法是 最常用的方法。
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性
高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS
基因组DNA会慢慢断裂 。混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试 剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基 因组DNA 。
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀， 见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此时质
粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，