动物细胞培养的注意事项
动物细胞培养实验报告
动物细胞培养实验报告第一篇：一、实验目的1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2、学习并掌握细胞传代培养的方法。
3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。
二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。
传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
三、细胞培养相关设施及材料1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。
孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。
制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。
储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。
清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。
2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。
动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立-中山大学
原代细胞的分离和制作
人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细 胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于 周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块 充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：
一、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方 法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时 间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞， 离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓 度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液， 因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这 样可根据需要收获目的细胞 ．
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二、实体组织材料的分离方法
（一）机械分散法
所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分 散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头 压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此 法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适 用于处理纤维成分少的软组织。
肿瘤学、病毒学、分子生物学
等领域已得到广泛的应用。
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动物细胞培养基本流程
剪碎，胰蛋白酶
动物组织 分离细胞
单个细胞 原代培养
原代细胞 传代培养
细胞株 （遗传物质没有发生改变）
细胞系 （遗传物质发生改变） 4
细胞培养的材料准备 1 细胞培养液 2 胰酶消化液 3 PBS缓冲洗涤液 4 洁净无菌的细胞培养瓶、培养板
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细胞培养基应用选择精要
L6细胞培养注意事项
尚恩生物| L6细胞(大鼠骨骼肌成肌细胞)培养教程细胞名称： L6(大鼠骨骼肌成肌细胞)细胞别称： L-6; L-6 myoblast细胞货号： SNL-030生长特性：贴壁培养条件： DMEM+10% FBS+1% P/S培养环境：空气，95%；二氧化碳(CO2)，5%；37℃细胞简介： L6成肌细胞是由Yaffe从大鼠大腿肌的原代培养物在3-甲基胆蒽存在下培养2代后分离得到，Yaffe称其为L6，因为他和Sara Neuman在1967年的六日战争中建立了该细胞系。
L6细胞在培养基中可融合形成多核的肌管和横纹肌纤维，细胞融合的程度随着代数的增加而下降，因而L6细胞应冷冻于低代次阶段并周期性地重新克隆以选择融合能力强的细胞。
如果让培养容器中的细胞长满，L6细胞的成肌组分将迅速耗尽。
L6细胞表达肌球蛋白基因，是一种合适的转染宿主，经测试，鼠痘病毒呈阴性。
▲细胞正常生长形态照片L6细胞培养注意事项1细胞贴壁较弱该细胞贴壁比较弱，消化时间偏短，注意控制消化时间。
另外，在遇到运输震荡、低温、室温静置太长时间、添加的培养基或其他试剂过冷等情况时会出现明显的细胞回缩变粗变短甚至脱落的现象，及时放回培养箱静置培养后可恢复正常。
2注意控制细胞密度密度过高和过低都会影响细胞状态。
密度过低时，细胞生长速度减慢；长满后长时间高密度培养将导致细胞受损，且成肌组分将耗尽影响后续实验。
建议细胞生长至80%密度时立即传代。
3细胞生长较快注意每天观察细胞密度和培养基颜色，及时换液或传代。
应注意每天传代对细胞不利，通过控制接种密度将传代频率保持在2天左右传一次为宜。
4容易聚集成团该细胞传代容易聚集成团，传代的时候注意尽量吹散细胞。
动物细胞培养实验2
实验题目：动物细胞培养教师：XXX实验类型：综合学时：26(参考)内容：一、实验目的通过本实验了解原代细胞与传代细胞培养的基本方法以及在细胞培养过程中严格的操作程序。
初步掌握无菌操作的基本原则，认识无菌操作在细胞培养中的重要性。
二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官）经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外生长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌操作。
三、试剂与器材1.材料出生后2-3天的乳鼠2.试剂平衡盐液－Hank液细胞消化液 0.5%水解乳蛋白-Hank液犊牛血清碳酸氢钠 1万单位/ml青、链霉素 3%谷氨酰胺磷酸盐缓冲液3.实验器材镊子解剖刀剪眼科剪眼科镊纱布块玻璃漏斗量筒记号笔试管试剂瓶三角瓶移液管培养皿培养瓶吸管橡皮头显微镜血细胞计数板计数器酒精灯酒精棉球试管架试管解剖板碘酒棉球口罩二氧化碳培养箱超净工作台灭菌锅倒置显微镜四、实验内容原代培养：取肾→消化分散组织→计数与稀释→分装培养→观察。
传代培养：配置培养液→消化细胞→细胞计数→培养观察。
培养细胞冷冻保存。
五、关键步骤及注意事项1. 注意无菌操作，及时更换培养液。
六、思考题1. 简述细胞传代培养的操作程序注意事项？2. 细胞培养获得成功的关键要素是什么？3. 简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。
动物细胞培养
实验一动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。
本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。
Ⅰ清洗与灭菌一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水[体积分数0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。
动物细胞培养方法
动物细胞培养方法
动物细胞培养是一种常用的实验手段，广泛应用于细胞生物学、药物研发、生物医学研究等领域。
以下是一般性的动物细胞培养方法：
1.细胞系的选择：选择合适的动物细胞系是动物细胞培养的第一步。
细胞系的选择要考虑细胞类型、来源、生长特性和用途等因素。
2.细胞培养基的准备：准备适用于所选细胞系的培养基。
培养基包括基本培养基和补充物，如生长因子、抗生素等。
不同的细胞系需要不同的培养基。
3.细胞的解冻：从冷冻保存的细胞库中取出细胞，进行解冻。
解冻过程要尽可能快速，以减少细胞对冷冻损伤的敏感性。
4.细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要将其传代，以维持细胞的生长状态。
传代过程包括细胞的分离、计数和重新接种。
5.细胞培养条件的控制：控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常细胞培养箱会提供稳定的培养环境。
6.细胞的观察和检测：定期观察细胞的形态、生长状态，并进行必要的细胞检测，如细胞计数、细胞周期分析等。
7.防止细胞污染：严格遵循无菌操作规程，防止培养物受到细菌、真菌、支原体等的污染。
使用无菌操作室和经过无菌处理的实验器材。
8.制备细胞冻存物：定期制备细胞冻存物，以备将来使用。
冻存物的制备需要使用适当的冻存液和合适的冷冻保存温度。
9.特殊操作：针对具体实验需求，可能需要进行细胞转染、感染、药物处理等特殊操作。
在进行动物细胞培养时，实验者需具备丰富的培养经验和相关技能，同时需按照实验室的标准操作规程进行操作，以确保实验的准确
性和可重复性。
动物细胞培养
概念动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在单独细胞培养的过程中不再形成个体。
2简介动物细胞培养液的成分体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。
将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。
由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。
[1]动物细胞培养液的特点液体培养基、通常含动物血清。
动物细胞培养的条件1.无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。
此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。
2.营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子等）3.血清和血浆(提供细胞生长必须的营养成份)4.温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）5.气体环境（95%的空气+5%CO动物细胞培养2的混合气体）其中5%CO2气体是为保持培养液的pH稳定基本过程取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。
将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。
当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。
此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。
再配成一定浓度的细胞悬浮液。
另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。
当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。
动物细胞培养管理制度
动物细胞培养管理制度一、培养基的准备和管理1.1 培养基的准备1.1.1 培养基成分的准备应严格按照配方进行，精确称量各种成分，尽量避免因操作不当或器皿受到污染导致成分比例出错。
1.1.2 培养基成分的保存应在密封、阴凉、干燥、无异味的条件下，避免受到阳光直射和高温影响。
1.1.3 开启新瓶或新袋的培养基前，应先用无菌液体将外包装表面消毒，避免外包装受到污染，然后在洁净无菌的操作台上打开瓶盖，尽量避免让空气中的微生物进入培养基内。
1.2 培养基的管理1.2.1 包装好的培养基应有清晰的标签，标注成分、配制日期、有效期等信息，并存放于适当的温度下，避免受到阳光直射和高温影响。
1.2.2 一旦发现培养基外观发生变化，如颜色、透明度等明显异常，应停止使用，并将问题培养基送至实验室进行分析检测。
1.2.3 使用的培养基应记录每次使用的日期、批号、制备者等信息，以便后期的追踪和管理。
二、细胞的培养和传代2.1 细胞的培养2.1.1 在细胞培养前，应先对工作台、培养箱等培养环境进行必要的消毒处理，保证操作环境的无菌。
2.1.2 培养细胞前，应仔细查看细胞培养饲养瓶或培养皿，检查是否有异物或污染，如有，应立即处理或更换合适的饲养瓶或培养皿。
2.1.3 细胞培养进程中，应定期检查细胞的状态，如细胞的形态、密度、生长速度等，一旦发现异常应及时进行处理。
2.2 细胞的传代2.2.1 传代前，应先对饲养瓶或培养皿中的细胞进行观察和计数，掌握细胞的状态和数量，以确定需要传代的细胞数目。
2.2.2 传代操作时，应注意操作的轻柔、迅速和无菌，避免对细胞造成机械性损伤或污染。
2.2.3 传代后，应对培养皿或饲养瓶进行标记，记录传代的日期、次数等信息，以便后期的追踪和管理。
三、细胞的冻存与解冻3.1 细胞的冻存3.1.1 冻存前应检查细胞的状态、数量和培养基的成分是否符合冻存要求，然后进行冻存液的配置和标记，避免出错。
3.1.2 冻存过程中，应确保细胞在冻存容器内的均匀分布，避免出现细胞团或细胞沉积现象，影响细胞的存活率。
生物选择性必修三生物技术与工程第三章动物细胞工程【1】细胞培养是动物细胞工程的基础
探究点二 动物细胞培养的技术流程
下图是动物细胞培养的基本 流程图。据图回答下列问题。
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较,分化程度低的细胞与分化程度 高的细胞比较,哪些细胞更易于培养?为什么? 提示 幼龄动物的细胞和分化程度低的细胞更易培养,原因是这些细胞的分 裂能力强。 2.进行动物细胞培养时,常用胰蛋白酶分散细胞,这说明细胞间的物质除了 水以外主要是什么?能否使用胃蛋白酶处理?为什么? 提示 蛋白质。不能使用胃蛋白酶处理,因为胃蛋白酶的最适pH是1.5左右, 而动物细胞培养液的pH为7.2~7.4,在此环境下,胃蛋白酶无活性。
[探究应用] 1.动物细胞培养需要满足一定的气体环境,下列相关叙述错误的是( ) A.O2的作用是为细胞需氧呼吸提供原料 B.CO2的作用是维持培养液的pH C.通常采用培养皿或松盖培养瓶培养 D.CO2培养箱内应含有95%的O2和5%的CO2 答案 D 解析 CO2培养箱内应含有95%的空气和5%的CO2,D项错误。
2.在进行动物细胞培养时,需要( ) A.用胃蛋白酶处理以获得细胞悬液 B.充入5%的CO2以刺激细胞正常呼吸 C.加入经高压蒸汽灭菌的血清以提供营养 D.定期更换培养液以清除代谢产物
答案 D 解析 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理以获得细胞悬液,A项不符合题意;充入 5%的CO2是为了维持培养液的pH相对稳定,B项不符合题意;加入血清为动 物细胞培养提供营养,高压蒸汽灭菌会破坏血清中的活性成分,C项不符合 题意;定期更换培养液以清除代谢产物,D项符合题意。
特别提醒动物细胞培养的注意事项 (1)动物细胞培养所用的通常是液体培养基,其并非完全的合成培养基,因 为还添加了动物血清等天然成分。 (2)在动物细胞培养过程中,应该对培养液和培养用具进行灭菌而非消毒。 (3)动物细胞培养时,二氧化碳培养箱内应含有5%的CO2和95%的空气,而非 5%的CO2和95%的O2。
培育技术在动物细胞培养与组织工程中的关键操作方法与注意事项
培育技术在动物细胞培养与组织工程中的关键操作方法与注意事项动物细胞培养与组织工程是一项重要的生物学研究领域，通过培育技术的应用可以实现对动物细胞的控制和扩增，为新药研发和组织工程提供必要的资源。
本文将就这一主题探讨培育技术在动物细胞培养与组织工程中的关键操作方法与注意事项。
一、培养基的选择与配制培养基是动物细胞培养的基础，选择合适的培养基对于细胞生长和增殖至关重要。
常用的基础培养基有DMEM、RPMI 1640和MEM等，根据实验需求可以在基础培养基中添加适当的添加剂，如胎牛血清、细胞因子和抗生素等。
在配制过程中要注意无菌操作，避免污染。
二、细胞的处理和传代细胞的处理和传代操作是动物细胞培养中至关重要的一环。
处理细胞前需将培养器具和试剂进行灭菌处理，保持无菌条件。
接种细胞时要注意细胞的浓度和接种稀释倍数，避免过度接种或过度稀释导致细胞的死亡或分离不良。
传代时应根据细胞的生长情况选择适当的倍数进行，一般建议传代细胞至80%-90%的密度。
三、细胞的培养条件调整培养过程中，细胞的生长状况受到培养条件的影响。
温度、湿度和CO2浓度是细胞培养中常关注的参数。
细胞的适宜温度一般为37℃，湿度需保持在95%以上，CO2浓度通常为5%。
此外，培养器具的摇床速度和培养时间也需根据细胞类型和实验目的进行调整。
四、细胞的遗传稳定性在动物细胞培养中，细胞的遗传稳定性是一项重要的指标。
细胞在长期培养过程中容易发生突变，导致细胞类型的改变和功能的丧失。
为了确保细胞的稳定性，可以使用遗传稳定性试剂，如抗生物质和抑制因子，同时进行细胞的遗传稳定性检测。
五、细胞冻存和解冻细胞冻存是维持细胞库和备份的重要手段，而细胞解冻是重新培养细胞的关键操作。
在细胞冻存过程中，应采用合适的冻存液和冻存容器，确保细胞的冻存质量。
解冻时需迅速将冻存管放入37℃水浴中解冻，解冻后立即将细胞转入预先准备的培养皿中。
六、细胞污染的防控在动物细胞培养中，细胞污染是一项常见但危害严重的问题。
动物细胞培养实验
实验一：实验器材准备【实验原理】细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。
一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。
三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。
【实验目的】①培养室的设置和设备。
②无菌概念和无菌操作要领。
【操作步骤】1．实验室设置（1）配液室（2）准备室（3）培养室培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点：①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。
②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，③门一般用拉门，以防止空气流动。
④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。
2．实验室常用设备（1）准备室的设备①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。
②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。
③干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。
④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。
不同物品其有效灭菌压力和时间不同。
⑤储品柜1：放置未消毒物品。
⑥储品柜2：放置已消毒物品。
准备室注意事项：①预防蒸馏器被烤干。
②勿将酸液溅到衣物或地面。
③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。
④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。
（2）配液室的设备①天平（扭力天平和电子天平）：称量用②pH计。
③磁力搅拌器。
（3）细胞培养室的设备①超净工作台：超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。
根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。
但两种净化台的气流方向不同。
实验四 动物细胞的传代培养
实验四动物细胞的传代培养1.实验目的（1）了解动物细胞培养的基本知识。
（2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的状态。
（3）掌握动物细胞的传代培养法。
2.实验背景与原理2.1 动物细胞培养的基本概念（1）组织培养: 把来自机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中, 使之成活、生长和繁殖。
严格又分为细胞培养、组织培养和器官培养。
值得注意的是和植物组织培养不同, 目前动物组织培养在一般培养条件下难以维持组织的结构和功能, 常最终转变成为细胞培养, 所以动物细胞与组织培养并无严格区别。
（2）原代培养: 直接从供体取来的细胞, 组织或器官进行的初次培养。
通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
（3）传代培养：原代培养物长成单层细胞, 达到一定密度时, 营养消耗殆尽, 需要补充营养, 分开扩大培养, 使之继续增殖。
注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的一个世代不同, 一代细胞约分裂3~5次, 不要混淆。
（4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。
若其形态均一, 生长增殖稳定, 生物性状明确, 即可称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。
不同种类的细胞成系的难易程度也不同, 一般胚胎、更新组织的细胞如造血、上皮等以及癌细胞较容易成系, 而神经等细胞则较难成系。
按照其生存期可分为有限细胞系（生存期有限的正常二倍体细胞）和无限细胞系（生存期无限的癌细胞、转化细胞等, 大多异倍体）2.2 动物细胞培养的基本条件体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境, 因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面。
（1）营养: 早期培养主要采用天然的生物性液体, 但其成分不确定, 难以控制营养成分。
现广泛使用的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基, 其主要成分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质。
培养基中还含有酚红指示剂, 使培养基的颜色可显示细胞生长状态。
动物细胞培养的流程和注意事项英语
动物细胞培养的流程和注意事项英语Animal Cell Culture: A Comprehensive Guide to Process and Considerations.Animal cell culture involves propagating animal cellsin a controlled environment outside of the body. It is widely used in biomedical research, drug discovery, and biotechnology for various applications. Establishing and maintaining successful animal cell cultures require careful planning, adherence to aseptic techniques, and optimization of culture conditions. This guide provides a comprehensive overview of the process and considerations involved in animal cell culture.1. Cell Line Selection and Acquisition.The first step in animal cell culture is selecting the appropriate cell line for the specific research or application. Factors to consider include cell type, species, genetic modifications, growth characteristics, andavailability. Once the cell line is selected, it can be obtained from cell banks or other researchers.2. Media Preparation and Storage.The growth medium provides nutrients, growth factors, and other essential components for the cells. It is crucial to prepare the medium according to the manufacturer's instructions, including the addition of supplements (e.g., serum, antibiotics). The prepared medium should besterilized by filtration and stored appropriately to maintain sterility and prevent contamination.3. Culture Vessel Preparation.Animal cells are typically cultured in specialized culture vessels designed to provide optimal growth conditions. The most common vessels include flasks, dishes, and multi-well plates. Before use, the vessels should be cleaned, sterilized (e.g., by autoclaving), and coated with an appropriate substrate (e.g., collagen) to facilitatecell attachment and proliferation.4. Aseptic Technique.Aseptic technique is paramount in animal cell culture to prevent contamination. This involves working in a sterile environment, using sterilized equipment and materials, and minimizing the risk of introducing contaminants into the culture. Proper use of biosafety cabinets, sterile gloves, and surface disinfectants is essential to maintain aseptic conditions.5. Cell Culture Initiation.Once the culture vessels and medium are prepared, the cells are introduced into the culture system. The initial cell seeding density should be optimized based on the specific cell line and culture conditions. Cells are typically added to the culture medium as a suspension, and the volume and concentration of the cell suspension should be carefully calculated to achieve the desired starting cell population.6. Culture Maintenance.Maintaining the cell culture involves regular monitoring and maintenance. This includes:Observation: Regularly observe the cells under a microscope to assess their growth, morphology, and confluence.Medium Change: Replace the culture medium every 2-3 days or as needed to remove waste products and replenish nutrients.Subculturing: When the cells reach a certain confluence (typically 80-90%), they need to be subcultured to a new culture vessel to prevent overgrowth and ensure optimal growth conditions.7. Cell Characterization and Authentication.To ensure the integrity and authenticity of the cell culture, it is essential to characterize the cells andverify their identity. This may involve testing for the expression of specific markers, performing genetic analysis (e.g., PCR, sequencing), and comparing the cells to known reference cell lines.8. Contamination Monitoring and Prevention.Contamination is a major concern in animal cell culture, as it can compromise the integrity of the experiments and lead to erroneous results. Regular contamination monitoring and preventive measures are crucial to maintain sterile culture conditions. This includes:Microscopic Inspection: Inspect the cells under a microscope for signs of contamination, such as changes in morphology, floating cells, or the presence of bacteria or fungi.Culture Purity Tests: Perform regular culture purity tests (e.g., bacterial and mycoplasma testing) to detectand eliminate contaminants.Biosafety Precautions: Adhere to proper biosafety precautions to prevent contamination, such as using sterile equipment, disinfecting surfaces, and working in a laminar flow hood.9. Scaling Up and Down.The scale of the cell culture may need to be adjusted depending on the research or production requirements. Scaling up involves increasing the culture volume and cell number, while scaling down involves reducing them. Careful planning and optimization of culture conditions are necessary to ensure successful scale-up or scale-down of the cell culture system.10. Cryopreservation.Cryopreservation is a technique used to preserve animal cells by freezing them at extremely low temperatures. This allows for long-term storage and recovery of the cells at a later time. Cells are typically cryopreserved in the presence of cryoprotectants to prevent damage during thefreezing and thawing processes.By following these steps and adhering to proper aseptic techniques and culture conditions, researchers canestablish and maintain successful animal cell cultures for various research and biotechnology applications. Optimization of culture conditions, regular monitoring, and contamination prevention measures are crucial to ensure the integrity and reproducibility of the cell culture system.。
动物科学细胞实验报告
实验名称：动物细胞培养与传代一、实验目的1. 熟悉动物细胞培养的基本操作流程；2. 掌握动物细胞传代技术；3. 学习观察细胞形态变化，了解细胞增殖、衰老等生命现象。
二、实验原理动物细胞培养是指将动物组织或细胞分离出来，在体外培养条件下使其生长、繁殖的一种技术。
通过动物细胞培养，可以研究细胞的生物学特性、细胞增殖、分化等生命现象，为生物医学研究提供重要手段。
动物细胞传代是指在细胞培养过程中，将细胞从培养瓶中取出，加入新鲜培养液，使细胞继续生长、繁殖的过程。
传代次数越多，细胞生长速度越慢，衰老现象越明显。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠胚胎成纤维细胞；2. 培养基：DMEM高糖培养基；3. 细胞消化剂：胰蛋白酶；4. 细胞培养瓶、培养皿、移液器、显微镜等。
四、实验步骤1. 预处理（1）将小鼠胚胎成纤维细胞从冻存管中取出，37℃水浴箱中解冻；（2）加入适量DMEM高糖培养基，轻轻吹打，使细胞分散均匀；（3）将细胞悬液转移至培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2. 细胞传代（1）观察细胞生长状态，待细胞密度达到80%时，进行传代；（2）用胰蛋白酶消化细胞，吹打均匀；（3）将消化后的细胞悬液转移至培养皿中，加入适量DMEM高糖培养基，终止消化；（4）收集细胞，用移液器将细胞悬液转移至新的培养瓶中；（5）将细胞悬液在37℃、5%CO2培养箱中培养。
3. 观察细胞形态变化（1）每隔一定时间，观察细胞形态变化，记录细胞增殖、衰老等现象；（2）用显微镜观察细胞形态，拍照记录。
五、实验结果与分析1. 细胞生长状态在培养过程中，细胞生长状态良好，细胞密度逐渐增加，细胞形态呈扁平状，细胞间连接紧密。
2. 细胞形态变化随着传代次数的增加，细胞生长速度逐渐减慢，细胞衰老现象逐渐明显。
在显微镜下观察，可见细胞出现皱缩、核仁缩小、细胞膜皱褶等衰老现象。
六、实验结论1. 动物细胞培养是一种重要的实验技术，可以研究细胞的生物学特性、细胞增殖、分化等生命现象；2. 动物细胞传代技术是细胞培养过程中的重要环节，有助于维持细胞的生长、繁殖；3. 细胞培养过程中，细胞形态变化反映了细胞的增殖、衰老等生命现象。
动物细胞培养总结!
动物细胞培养总结一．实验准备1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。
蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。
取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。
过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。
过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。
玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。
浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。
瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。
浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。
取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。
换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。
（2）消毒灭菌1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。
若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。
若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。
2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。
动物医学细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞培养的基本原理和操作方法。
2. 观察动物细胞在体外培养过程中的形态变化，了解细胞生长、衰老和死亡过程。
3. 探讨细胞培养技术在动物医学研究中的应用。
二、实验原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出，在体外条件下进行培养和繁殖的技术。
通过细胞培养，可以研究细胞的生物学特性、细胞代谢、细胞分化等，为动物医学研究提供有力支持。
三、实验材料1. 实验动物：小白鼠2. 实验器材：细胞培养瓶、超净工作台、显微镜、剪刀、镊子、培养皿、移液器、吸管、细胞培养液、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、75%酒精、无菌生理盐水、DMSO （二甲基亚砜）3. 实验试剂：细胞培养液、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、75%酒精、无菌生理盐水、DMSO四、实验步骤1. 取小白鼠胚胎，用剪刀剪开胚胎包膜，取出胚胎组织。
2. 将胚胎组织置于超净工作台上，用无菌生理盐水冲洗，去除杂质。
3. 将冲洗后的胚胎组织用剪刀剪成小块，加入胰蛋白酶，消化10-15分钟。
4. 倒掉消化液，加入适量细胞培养液，用吸管吹打均匀，制成细胞悬液。
5. 将细胞悬液转移至培养瓶中，加入青霉素、链霉素，防止细菌污染。
6. 将培养瓶放入细胞培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养。
7. 观察细胞生长情况，记录细胞形态、数量、生长速度等指标。
8. 在细胞生长过程中，定期更换培养液，以维持细胞生长环境。
9. 细胞培养至一定时期后，观察细胞衰老和死亡现象，分析衰老和死亡原因。
五、实验结果与分析1. 细胞形态：培养初期，细胞呈圆形，排列紧密。
随着培养时间的延长，细胞逐渐变长，形态不规则，出现细胞突起。
2. 细胞数量：培养初期，细胞数量增长较快，约每2-3天翻倍。
后期，细胞数量增长速度减慢，进入平台期。
3. 细胞生长速度：培养初期，细胞生长速度快，约每2-3天翻倍。
后期，细胞生长速度减慢，进入平台期。
4. 细胞衰老和死亡：培养至一定时期后，细胞出现衰老和死亡现象。
动物细胞培养技术小鼠脾脏细胞
姓名：XX 系年级：2013级XX班学号：201300XXXXXXX实验题目:动物细胞培养同组者: XXXXX动物细胞培养技术【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率；【实验原理】（一）. 动物细胞培养技术动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。
细胞培养的意义:⑴.具有其他生物技术无可比拟的优点；⑵.培养条件易改变和控制，便于单因子分析；⑶.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；⑷.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；(2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。
培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。
细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直至第一次传代为止。
2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。
原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化——接种——观察悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型（二）. 细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
动物细胞培养的基本技术
使用前半小时先开紫外线灯灭菌，再关灭菌灯启动风机 ，然后进行操作。使用后用75％的酒精擦洗台面。 切记：不要用有机溶剂擦拭挡风玻璃。
恒温培养箱
变通电热恒温培养箱 CO2培养箱
细胞培养总原则
1
2 3 4
无菌无毒害的环境 支持生长增殖的营养 其它类似体内的环境
维持细胞性状
(一) 细胞培养无菌无毒环境
实验室设计合理 常用设施及设备 培养器皿： 透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的 材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中 性硬度玻璃制品。
细胞培养无菌操作基本技术
工作环境及表面的处理 细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 培养液与培养细胞的处理
单蒸水冲洗3次
121℃高压蒸汽灭菌20min
塑料器材
常用的塑料器材有多孔培养板（4孔、6孔、 12孔、24孔、96孔）、培养皿、培养瓶及吸 头。 重复使用的处理步骤： 自来水刷洗 3％HCl或2％NaOH溶液浸泡过夜 双蒸水冲洗3次
自来水充分冲洗
紫外线直接照射或辐照灭菌
橡皮器材
首次使用： 自来水刷洗 5％ NaOH溶液煮沸15min 4％HCl盐酸煮沸15min 单蒸水冲洗3次 自来水冲洗8次
37℃，饱和湿度，5％CO2
其他设备
酶标仪
二、细胞培养常用器材及处理方法
玻璃器材 塑料器材 橡皮器材 金属器材 其他用品
玻璃器材
常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养 皿、吸管、离心管。 首次使用：
自来水刷洗 0.1％稀盐酸浸泡过夜 自来水冲洗
重复使用的处理步骤：
自来水刷洗 硫酸－重铬酸钾浸泡过夜 双蒸水冲洗2次 自来水冲洗10次 晾干、包装
动物细胞培养的流程和注意事项
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1. 细胞解冻和培养。
将冷冻保存的细胞从液氮中取出并快速解冻。
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动物细胞培养的注意事项
动物细胞培养是生物学研究和医学实验中重要的工具之一。
在进行动物细胞培养时，需要注意以下几个方面的问题，以确保实验的顺利进行和结果的准确性。
1. 培养基的选择
选择适当的培养基是动物细胞培养的基础。
不同种类的动物细胞对培养基的要求不同，因此在培养细胞前需要了解所使用细胞的特点，选择合适的培养基。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640等，可以根据实验需求添加适当的补充物。
2. 细胞的来源
细胞的来源对实验结果有重要影响。
通常，细胞可以从动物组织中分离得到，也可以通过购买商业化的细胞株获得。
在选择细胞来源时，需要考虑细胞的纯度、稳定性和应用范围等因素。
3. 细胞的处理和传代
在进行细胞培养时，需要注意细胞的处理和传代方法。
细胞的处理包括细胞的分离、传代和冻存等步骤。
分离细胞时应注意使用适当的酶或缓冲液，避免对细胞造成损伤。
传代时要控制细胞的密度和培养时间，避免细胞过度增长或老化。
4. 培养环境的控制
细胞的培养环境对细胞的生长和功能表达有重要影响。
在培养细胞时，需要控制培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度等因素。
通常细胞培养温度为37摄氏度，CO2浓度为5%。
同时，还需要注意培养器具和培养基的无菌操作，避免细胞受到外源性微生物的污染。
5. 细胞的检测和鉴定
在进行动物细胞培养时，需要对细胞进行检测和鉴定，以确保细胞的纯度和功能。
常用的细胞检测方法包括形态学观察、细胞计数、细胞周期分析和免疫细胞化学等。
此外，还可以使用PCR和酶切等分子生物学方法对细胞进行鉴定。
6. 细胞的存储和传输
细胞的存储和传输是细胞培养的常用操作。
存储细胞时，可以使用液氮冻存或干冰冻存等方法，注意选择适当的冻存液和冻存温度。
传输细胞时要注意包装和运输条件，避免细胞受到振动和温度变化等因素的影响。
7. 实验的伦理和安全
在进行动物细胞培养实验时，需要遵守伦理规范和安全操作。
尊重动物权益，遵循实验动物使用的伦理原则。
同时，要注意实验室的安全措施，如佩戴实验手套、口罩和实验服，避免对自身和他人造成伤害。
动物细胞培养是一项复杂而重要的实验技术，在进行动物细胞培养
时，需要注意培养基的选择、细胞的处理和传代、培养环境的控制、细胞的检测和鉴定、细胞的存储和传输、实验的伦理和安全等方面的问题。
只有在严格遵守操作规范和注意事项的前提下，才能获得准确可靠的实验结果，为科学研究和医学实践提供有力的支持。