碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)
碱性磷酸酶染色(NAP)
临床义
临床上主要用于鉴别： 临床上主要用于鉴别： 1. 慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病(无继发性感染者 时，NAP积分一般明显下降， 慢性粒细胞白血病 无继发性感染者)时 积分一般明显下降， 无继发性感染者 积分一般明显下降 积分常＜ 分 甚至为零分；类白血病反应时则显著增高， 积分常＜13分，甚至为零分；类白血病反应时则显著增高，积 分常＞ 分常＞200分。 分 2. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高， 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高，病 情好转时， 积分则可逐渐下降。 情好转时，NAP积分则可逐渐下降。 积分则可逐渐下降 3. 急性白血病的细胞类型：ALL增高，AML下降。 急性白血病的细胞类型： 增高， 下降。 增高 下降
方法步骤
新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s 流水轻轻冲洗30 10%甲醛甲醇固定液固定30s， 30～ 1. 新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲洗30～ 60s，待干。 60s，待干。 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10 15min。 10～ 2. 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10～15min。 3. 流水冲洗1 ～ 2min，加苏木素染色液中复染5～8min，流水冲洗，待 流水冲洗1 2min，加苏木素染色液中复染5 8min，流水冲洗， 干，镜检。 镜检。 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标准如下： 4. 结果判断 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标准如下： 0分：胞质中无阳性染色颗粒。 胞质中无阳性染色颗粒。 1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 5 计算阳性率和积分值。 计算阳性率和积分值。
碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)使用说明
碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)使用说明自备材料：1、载玻片、湿盒2、普通光学显微镜产品简介：碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。
此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。
碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)不是采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI磷酸盐水解，释放出磷酸不萘酚，后者不偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。
该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色，碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。
操作步骤(仅供参考)：一、涂片或切片1、血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蜡切片无需固定)，水洗。
2、滴加配制好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15～20min，水洗。
3、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。
4、水洗、镜检或甘油明胶封固后镜检。
二、贴壁培养细胞1、取6孔板或其他容器培养的细胞，弃液，PBS清洗干净。
2、加入ALP固定液固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗。
3、滴加配制好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15～20min，PBS清洗。
4、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。
5、PBS清洗、镜检。
注意事项：1、血液或骨髓细胞涂片或其他样本均应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。
2、培养细胞染色操作过程中，清洗、染色等步骤都应轻微，以免损伤或丢失细胞。
碱性磷酸酶光镜显示法
碱性磷酸酶一、钙-钴法光镜显示方法（1）孵育液的配制：3％β-甘油磷酸钠 10ml （底物）2％巴比妥钠 10ml （缓冲液）2％氯化钙 20ml （捕获剂）5％硫酸镁 5ml （激活剂）双蒸水（D.W） 5ml孵育液最终pH值9.4，置于冰箱保存。
（2）操作步骤：①新鲜组织，作冰冻切片（可用10％福尔马林固定10min，或不固定）；②入孵育液，恒温37℃孵育 30～60min （磷酸钙沉淀形成）③流水冲洗 5min④置2％硝酸钴内 2min （磷酸钴形成）⑤蒸馏水冲洗；⑥置1％硫化铵溶液内 1min （硫化钴形成，脂溶性沉淀）⑦蒸馏水冲洗甘油明胶封固。
（3）结果与评价:碱性磷酸酶活性产物为棕黑色硫化钴沉淀。
（4）对照：从孵育液中去除底物或用左旋咪唑等抑制剂的方法，则酶活性反应为阴性。
二、偶氮-偶联法光镜显示方法（1）孵育液的配制：萘酚AS（或萘酚AS-MX） 10～25mg（底物）溶于N，N-二甲基甲酰胺液 0.5ml（促溶剂）0.2mol/L Tris盐酸缓冲液（pH9.2） 50ml（缓冲液）坚牢蓝B（或BB，RR，或坚牢红TR或坚牢蓝VRT） 50mg（捕获剂）（以上尽可能混合和过滤，必要时可用氢氧化钠调整pH9.0～9.2值）。
（2）操作步骤：①新鲜组织，作冰冻切片；②入孵育液，恒温37℃（或室温下）孵育5～60min （有色沉淀形成）③双蒸馏水冲洗 3～5min④4％甲醛，室温下固定 10～50min⑤蒸馏水冲洗 3～5min⑥甘油明胶封固。
（脂溶性沉淀）（3）结果与评价：采用不同的重氮盐，酶的活性显色也不同，用坚牢蓝B（或BB，RR）酶活性呈蓝色-紫色，用坚牢红TR (或坚牢紫B）酶活性呈红色。
中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色偶氮偶联法
中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色偶氮偶联法[原理]中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在碱性环境中，能水解磷酸萘酚钠，释放的萘酚与重氮盐作用生成不溶性有色的偶氮染料，定位于胞浆中。
[试剂](1)固定剂，为40％甲醛25m1，加无水乙醇至100m1。
(2)丙二醇缓冲液。
①贮备液(0．2mol/L 2—氨基-2-甲基-1，3-丙二醇液)为2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇10．5g，蒸馏水加至500ml。
②应用液(0.05mol/L pH9.75)，为0．2mol/L贮备液25m1， o.1mol/L盐酸 5m1，蒸馏水加至100m1。
(3)基质孵育液pH9.5-9．6(用前临时配制)，α—磷酸萘酚钠20mg溶于0.05mol/L丙二醇缓冲液20m1，再加坚牢蓝RR(或坚牢紫酱)20mg，混合后用滤纸过滤，立即应用。
(4)10g/l亮绿。
[操作](1)新鲜血片或骨髓片用4-10℃的固定剂固定30秒。
(2)、在涂片上滴加新配过滤的孵育液，在室温下作用10-15分钟。
(3)水洗，10g/L亮绿复染2分钟。
(4)水洗，晾干镜检。
[结果观察](-)：阴性反应。
(+)：胞浆中含少量紫黑色，无紫黑色颗粒或红色物质。
(++)：胞浆中含有中等量紫黑色颗粒或呈弥漫红色。
(+++)：胞浆中有丰富的紫黑色颗粒或弥漫较深红色。
(++++)：有极丰富的大紫黑色颗粒或弥漫深红色。
[参考值]中性粒细胞碱性磷酸酶活性积分值为10—50分。
[临床意义]基本同改良Gomor；氏钙钻法。
编写：谢平制定日期：2011.12.1[附注](1)若涂片不能及时测定，可固定干燥后放冰箱4℃保存。
(2)在甘油磷酸钠和巴比妥钠应临用前称取，分别为0．38和0．28，再加蒸馏水20m1即配成。
配制后的β-甘油磷酸钠不宜久放。
(3)涂片从孵育液拿出可不用水洗，直接加硝酸钻，但与硝酸钴作用后，应反复水洗，以免残留的硝酸钻与硫化胺作用后使整个涂片变黑，造成假阳性。
底物及偶联剂浓度对碱性磷酸酶染色灵敏度的影响
１４ ９ ２・
广东医学 ２０ 年 １ 月 第 ２ 卷第 １ 期 Ｇ ａ ｇ ｏ ｇ ｄ ａ Ｊ ｕ ｎ ｌ ｏ． ０ ８ Ｖ １ ２ ， ｏ １ ０８ １ ９ １ ｕ ｎ ｄ ｎ ｉ ｌ ｏ ｒａ Ｍｅ ｃ Ｎ ｖ ２ ０ ， ｏ ９ Ｎ ．１ ．
短 篇 报 道
底 物及偶 联 剂 浓度 对碱 性磷 酸酶 染色 灵 敏度 的影 响
９ ８ ４
４ １
９３ ８
１ ６
３ ３ ｌ １
１
的不 同浓 度对 Ｎ Ｐ染色 灵 敏度 的影 响 。 Ａ １ 资料 与 方 法 １１ 一 般 资 料 ． 随机 选 择 Ｎ Ｐ积分 高 Ａ
ＡＣＤ
ＡＣＤ
６ ８
２ ４
６ ４
１２ ０
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１８ ４ ２０ ５
１２ ５ １０ ２
ｌ２ ７ ２ｏ ｏ
１２ ６ ８
类 白 上感
１１ ９ ６
１０ ５ １ ５
１３ ７ ７
ｌ９ ３ １ ９
（ ９６ ，６ １ ，５ ９ ，３３ ） 中位 数 ６ ． ９６ ．３ ５ ．４ ３ ． １ 及
色 灵敏 度 造 成 明 显影 响 。真 性 红 细
（８ ０ ， ７ ５ ， ８５ ｌ． ０ 依 次 降 ５ ．０ ５ ． Ｏ ３ ．０，７ ０ ） 低， 见表 １ ｒ ｄ ａ 。Ｆｉ ｍ ｎ秩和检 验示 校正 ｅ
２ ． ８ ， ０ ０ ００ 以 １ 为 共 ６６ ８７ Ｐ： ．０ ； 组 同对照组 ， 两两 比较 ｑ检验示 １组与 ２
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP)
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液（NAP）预期用途：供骨髓细胞图片及血液细胞图片染色检查检验原理：本染色方法为偶氮偶联法，在PH9.2-9.8的碱性环境下，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸萘酚AS-BI水解，生成α-萘酚，再以稳定的重氮盐与萘酚偶联生成不溶性有色偶氮染料沉淀，定位于细胞浆中主要组成成分：储存条件：本试剂盒应储存于2℃-8℃低温环境。
样本要求：新鲜骨髓细胞涂片及血液细胞涂片（切勿使用抗凝血）检验方法：一、工作液配制（一）、浸染工作液配制（一份浸染工作量是43ml,至少可同时放置8-10张涂片）1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟；2、染缸（自备染液缸）内加入蒸馏水40ml；3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀4、再加D液1ml入染缸内，轻轻混匀（二）滴染工作液配制（一份滴染工作液是2.15ml）使用器材：一次性塑料试管、微量移液器，一次性吸嘴，滴管。
操作：取B液50μl,C液50μL混匀，静置2分钟，再加蒸馏水2ml，D液50μl,混匀，二、染色步骤1、干燥涂片，滴加A液固定剂（用前恢复室温，并充分摇匀）固定约30-60秒，蒸馏水冲洗，甩干；2、滴加或浸入工作液15分钟，蒸馏水冲洗2-3分钟，甩干3、E液(使用前务必摇匀！)复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检4、计算积分：反应结果以积分值报告，油镜下计数100个中性杆状核、分叶核粒细胞，分别记录其分级情况，所有阳性细胞积分相加即为积分。
如：参考范围：阳性反应主要见于成熟中性粒细胞（杆状及分叶核粒细胞）中，健康成人一般的中性粒细胞碱性磷酸酶积分值为13-130，但各个实验室条件各异，实验室应有自己的参考值。
检验结果的解释NAP阳性颗粒为蓝色检验方法的局限性仅限于形态学染色观察使用注意事项1、5Tests只限滴染使用2、使用前应恢复室温，用前请摇匀试剂；B,C液请充分混匀，所用容器必须洁净，工作液颜色为金黄色3、应采用新鲜涂片作NAP染色,放置过久则酶的活性会降低；使用抗凝血涂片染色阳性结果不稳定4、工作液配制以后应在十分钟以内使用5、需用感染发热病人或正常人外周血涂片作为阳性对照6、每次试剂使用后，请迅速盖好密封保存，以免挥发及影响效果7、本品应由专业人士使用及进行结果的判读7、使用前应详细阅读使用说明书及产品包装标识，在有效期内使用，并做好个人卫生防护8、生产批号、效期见外包装9、用后应按医院或环保部门要求处置废弃物。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色偶氮偶联法-检验科临检室作业书
中性粒细胞碱性磷酸酶染色偶氮偶联法1.实验原理在PH9.2-9.8的缓冲溶液中，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸苯酚钠水解，生成α-苯酚和磷酸钠，再以稳定的重氮盐与酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。
2.标本采集2.1病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史，凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠的妇女作骨穿时要慎重。
2.2标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液。
2.3标本采集要求：2.3.1高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。
2.3.2临床上首选穿刺部位为髂后上棘，翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部位。
小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。
3.标本储存：滴加95％乙醇盖满血膜10分钟，水洗待干，室温避光保存。
4.标本运输：室温运输。
5.标本拒收的标准：溶血，稀释标本不能作测定。
6.试剂：6.1试剂名称：中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂。
6.2试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司6.3试剂组成：试剂1.固定剂：甲醛10ml加甲醇90ml混合，2℃~8℃避光保存，有效期6个月。
试剂2.贮存液：200mgα-磷酸苯酚钠(AS-BI)溶于1mlN-N二甲基甲酰胺+200mlTris-Hcl缓冲液，2℃~8℃避光保存。
试剂3.Tris-Hcl缓冲液，Tris4.85g溶于200ml蒸馏水，加浓Hcl1滴~2滴，PH固定为9.1。
试剂4.作用液：取贮存液2ml于温水中30℃预热5分钟加坚固蓝BB盐2mg，混合。
试剂5.中性红溶液：2℃~8℃避光保存。
7.操作步骤：7.1新鲜干燥涂片滴加固定剂作用2~5秒，水洗，待干。
7.2滴加作用液室温染色15~20分钟，水洗，待干。
7.3中性红复染3分钟，水洗，干后镜检。
8.结果判断：阳性反应，棕黑色颗粒定位于胞桨中。
在油镜下计数100个中性粒细胞，求出碱性磷酸酶阳性细胞百分比，并求出积分。
9.临床意义：NAP的积分，参考值为35-70分。
酶类染色液
酶类染色液北京华越洋生物------------------------------------------------------碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。
二甲苯应采用AR以上级别。
碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×100ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。
二甲苯应采用AR以上级别。
碱性磷酸酶-PAS联合染色液6×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色与过碘酸雪夫试剂合用,同时显色碱性磷酸酶和PAS阳性物质。
适用于冰冻切片、石蜡切片,碱性磷酸酶活性部位呈黑色,PAS阳性物质呈紫红色。
染色过程中注意控制过碘酸处理的时间,否则容易褪色。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×2ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。
碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。
油镜下计数100个中性粒细胞,求出百分比和积分。
非特异性反应少，结果可靠。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×10ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。
碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。
油镜下计数101个中性粒细胞,求出百分比和积分。
非特异性反应少，结果可靠。
碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法) 4×2ml 酶类染色40% —20℃,避光,6个月用于石蜡切片、冰冻切片、骨髓细胞涂片、血液涂片等的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。
冰冻切片组织碱性磷酸酶活性染色试剂盒产品说明书(中文版)
冰冻切片组织碱性磷酸酶活性染色试剂盒产品说明书（中文版）主要用途冰冻切片组织碱性磷酸酶活性染色试剂是一种旨在使用偶联偶氮技术，在底物存在的情况下，分析组织样本中碱性磷酸酶表达，而呈现亮红色沉淀现象的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心改良、成功实验证明的。
主要适用于动物组织冰冻切片，同时也适合原生代或培养细胞的酶活性检测。
尤其可用于骨组织病理生理的研究和干细胞分化能力的鉴定。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，灵敏牢固，显色清晰。
技术背景碱性磷酸酶（ALKALINE PHOSPHATASE）在碱性环境下催化各种醇和酚的磷酸酯水解，存在于活跃运输的膜上，如毛细血管及毛细血管的动脉部分的内皮，肾近曲小管壁边缘和小肠上皮的纹状缘，胎盘组织，未分化的干细胞等表达含量最为丰富。
它与骨质的形成，维持细胞内磷酸酶的浓度，以及与经膜吸收和转运过程有关。
偶联偶氮技术的基本原理为碱性磷酸酶水解底物（磷酸萘酯）释放出萘酚，立即为重氮盐所捕获而成为不溶性有色的偶氮染料。
实验最初（1944）应用β-萘磷酸盐作为底物，释放出的萘酚与重氮α-萘胺偶联，在酶的活动处形成有色沉淀。
Burstone （1962）推荐使用替代萘酚，如萘酚AS-MX磷酸盐。
重氮盐有很多种，但较适宜的有Fast blue RR，Fast red TR，Fast violet B，Fast blue VRT 和Fast black B。
偶联偶氮技术孵育时间短；稳定，灵敏；在正常组织中因无萘酚，故不需要对照；反应产物为偶氮染料难以溶解，不易弥散因而图象清晰。
产品内容清理液（Reagent A）120毫升固着液（Reagent B）10毫升反应液（Reagent C）10毫升染色液（Reagent D）5管产品说明书1份保存方式保存在4℃冰箱里，避免光照，有效保证6月用户自备甲基绿复染试剂盒（HL40010）或苏木素复染试剂盒（HL80050）：用于常规染色后复染小型染色缸：用于染色操作光学显微镜：用于组织细胞染色后观察分析实验步骤样本染色操作开始前，将试剂盒里的反应液（Reagent C）和染色液（Reagent D）置于室温下预热，并避光。
碱性磷酸酶染色(NAP)
0分：胞质中无阳性染色颗粒。
1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。
2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。
3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。
4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。
5 计算阳性率和积分值。
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注意事项
1. 磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多，应根据基质选择相适 应的重氮盐，坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是本法成败的 关键。
2. 骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒，取材 不佳时，往往影响结果。
3. 酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。
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临床意义
1. 鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血：IDA时骨髓细胞外铁显著减少或消失， 铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒细小色浅，且以Ⅰ型为主，Ⅱ型极少见， Ⅲ型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检查是诊断 IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非IDA，如HA、MA、AA等病人的 细胞外铁通常增高，内铁亦增高，以Ⅰ型、Ⅱ型为主，可以见到Ⅲ型，罕 见Ⅳ型。因此，有助于鉴别IDA与非IDA。
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方法步骤
1. 干燥涂片用甲醇固定10min，待干。
2. 玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37℃染色30min。
3. 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染10～15min。
4. 流水冲洗，待干，镜检。ห้องสมุดไป่ตู้
5. 结果判断
(1) 幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。
(2) 细胞外铁 用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注
2. 用于诊断铁粒幼细胞性贫血：能找到数量不等的环形铁粒幼细胞，多见粗 颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼细胞。
3. 用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的MDS：骨髓中环形铁粒幼细胞＞15%。
碱性磷酸酶染色试剂盒(偶氮偶联法)
产品组成：
规格
名称
3×10ml 3×20ml
Storage
S0100 (A): ALP 固定液
10ml
20ml
RT 避光
S0100 (B): ALP 孵育液 B1: AS-BI 染色液
5ml
10ml
-20℃ 避光
B2: FBB 染色液
5ml
10ml
4℃ 避光
临用前，按 B1:B2=1:1 比例混合，即为 ALP 孵育液，即配即用。
染色结果：
ALP 活性部位 细胞核
蓝色 红色(核固红)或绿色(甲基绿)
血液、骨髓涂片结果判断：
一般以积分报告结果，根据 100 个中性粒细胞阳性颗粒进行 0～4+计分。
细胞分值
染色特点
0
无颗粒
1
稍有颗粒
2
中等程度颗粒
3
多数颗粒
4
充满颗粒
临床意义： 1. 类白血病反应积分明显增高，未经治疗的慢性粒细胞白血病积分明显减低。 2. 急性细菌性感染积分明显增高，病毒性感染积分多正常或减低。 3. 再生障碍性贫血积分常增高，PNH、MDS 积分常减低。
碱性磷酸酶染色试剂盒(偶氮偶联法) 也称中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色液，不是采 用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在 pH9.2～9.8 的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使 AB-BI 磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚， 后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片、 冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色,碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于 胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。
PNPP偶氮法测碱性磷酸酶
介绍一种检测成骨细胞的碱性磷酸酶的方法：
PNPP偶氮法
用吸管吸掉96孔板内的培养液，用PBS冲洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺（试剂盒里的缓冲液EDA或AMP），1mmol/L氯化镁和6.7mmol/L PNPP的反应液,每孔150ul.37℃避光放置半小时,然后加0.1mol/L氢氧化钠100ul终止反应,用酶标仪于405nm波长下测定OD值.样品OD值在ALP 标准曲线上读取酶活性值(U/L).
ALP标准曲线的绘制:称取PNP0.0111克用三蒸水溶解后稀释至250ml,此时PNP的浓度为
320umol/L.依次倍比稀释成160umol/L,80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相当于ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶标仪于405nm波长下测定PNP的OD值.以ALP活性值作为自变量,对应的OD值作为应变量,求得直线回归方程.。
2018-nap染色步骤-范文模板 (11页)
本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==nap染色步骤篇一：NAP染色SOP责任部门：检验科碱性磷酸酶（NAP）染色标准操作规程编制：肖启国审核：肖启国批准：卿文衡实施：201X-01-011.目的规范NAP染色的操作，保证操作安全可靠运行，为临床提供准确可靠的结果。
2.SOP程序编写依据依据ISO15189：201X《医学实验室—质量和能力的专用要求》《碱性磷酸酶（NAP）染色液使用说明书》《全国临床检验操作规程》（第3版） 3.SOP 变动程序本操作程序的变动，可由其使用的工作人员提出，报经专业主管和科主任签字批准，方可变更。
4.适用范围适用血细胞内碱性磷酸酶染色测定，用于辅助诊断。
5.实验原理:血细胞内的碱性磷酸酶在碱性（PH9.2-9.8的缓冲溶液）环境下，水解α-磷酸萘酚钠，产生α-萘酚。
后者与重氮剂偶联形成有色沉淀物，沉淀物的显色深浅与NAP成正比。
6.标本采集6.1 病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史，凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠的妇女作骨穿时要慎重。
6.2 标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液。
6.3 标本采集要求：6.3.1 高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。
6.3.2 临床上首选穿刺部位为髂后上棘，翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部位。
小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。
7. 标本储存：滴加95％乙醇盖满血膜10分钟，水洗待干，室温避光保存。
8. 标本运输：室温运输。
9. 标本要求：1）新鲜涂片.2）溶血，稀释标本不能作测定。
3）样本不宜采用抗凝剂和沾上酸，碱类物质，以免产生假阴性。
10. 试剂：10.1 试剂名称：中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂。
10.2 试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司 10.3 试剂组成：试剂1. 固定剂：甲醛10ml加甲醇90ml混合，2℃~8℃避光保存，有效期1年。
碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)
碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)
产品简介：
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。
此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。
MB碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)不是采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。
该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色,碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。
产品组成：
有效期： 6个月有效。
碱性磷酸酶染色(NAP)
碱性磷酸酶染色（NAP）碱性磷酸酶染色（NAP）在临床的应用基本属于常规筛查的染色法。
（1）原理（偶氮偶联法）：血细胞内的碱性磷酸酶在pH 9.4～9.6的条件下将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。
（2）结果判断：阳性结果为胞质内出现灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀①（一）灰褐色沉淀，为0分。
②（+）胞质出现灰褐色沉淀，为1分。
③（++）胞质深褐色沉淀，为2分。
④（+++）胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，为3分。
⑤（++++）胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核，为4分。
（3）参考值：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）的积分值为7～51。
由于各实验室的实验条件不同，正常值也有差异，应建立本实验室的正常值。
这里的正常值仅供参考。
（4）临床意义:①生理变化：①年龄变化：新生儿NAP活性增高，以后下降。
儿童期各年龄大致相似，成年期较儿童期活性减低，老年期更低。
②应激状态下的变化：紧张、恐惧、激烈运动等NAP活性可增高。
③月经周期中的变化：经前期增高，行经后降低，经后期恢复。
④妊娠期的变化：妊娠2～3个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月增高，分娩时达高峰，产后则恢复正常。
②病理性变化：①感染：细菌性感染时NAP积分值增高。
在细菌性感染中球菌性感染较杆菌性感染为高；在球菌性感染中，急性较慢性为高。
病毒性感染时，NAP积分值一般无明显变化。
因此本染色法有时可帮助鉴别细菌性感染和病毒性感染；②血液病：慢性粒细胞白血病的NAP积分值明显减低，常为“0”，缓解时NAP 积分值上升到正常。
类白血病反应时的NAP积分值明显增高，中性杆状核粒细胞的碱性磷酸酶活性增强，甚至中性晚幼粒细胞也呈阳性反应。
因此本法常用来鉴别慢粒和类白血病反应及观察慢粒疗效的指标之一；急性粒细胞白血病时NAP 积分值减低，急性淋巴细胞白血病时NAP积分值一般增高，因此本法可作为鉴别急粒和急淋的方法之一；急性单核细胞白血病时NAP积分值一般减低，有时可正常；粒细胞白血病合并细菌性感染时NAP积分值可增高，但不如单纯细菌性感染增高的明显；再生障碍性贫血的NAP积分值增高，当病情好转时，NAP积分值可下降，完全缓解时NAP活性可恢复到正常，因此本法对再障的诊断、疗效观察和估计病情均有一定意义；阵发性睡眠性血红蛋白尿的NAP积分值减低，因此本法可作为鉴别阵发性睡眠性血红蛋白尿和再生障碍性贫血的方法之一；真性红细胞增多症的NAP积分值升高，而继发性红细胞增多症的NAP积分值无明显变化。
碱性磷酸酶显色剂使用方法
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
使用方法1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度.3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。
成骨细胞染色方法以ALP为目标物的检测方法：1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。
自来水冲洗数次。
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。
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碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)
简介：
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。
碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI 磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中, 碱性磷酸酶活性部位呈红色，位于胞桨。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片入ALP 固定液固定，水洗。
2、滴加配制好的ALP 孵育液，放入湿盒中，避光孵育，水洗。
3、Lea 苏木素染色液复染或甲基绿染色液复染。
4、水洗、镜检或甘油明胶封固后镜检。
染色结果：
临床意义：
1、 类白血病反应积分明显增高，未经治疗的慢性粒细胞白血病积分明显减低。
2、 急性细菌性感染积分明显增高，病毒性感染积分多正常或减低。
3、 再生障碍性贫血积分常增高，PNH 、MDS 积分常减低。
编号 名称
DE0004 4×2ml DE0004 4×10ml DE0004 4×20ml Storage 试剂(A): ALP 固定液 2ml 10ml 20ml RT 避光 试剂(B): ALP 孵育液
B1: AS-BI 染色液 1ml 5ml 10ml -20℃ 避光 B2: FBB 染色液
1ml
5ml
10ml
-20℃ 避光
临用前，按B1:B2=1:1比例混合，即为ALP 孵育液，即配即用。
试剂(C): Lea 苏木素染色液 2ml 10ml 20ml 4℃ 避光 试剂(D): 甲基绿染色液 2ml
10ml
20ml RT 避光
使用说明书
1份
ALP 活性部位 红色
细胞核
蓝色(苏木素)或绿色(甲基绿)
注意事项：
1、血液或骨髓细胞涂片或其他样本均应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。
2、ALP孵育液易失效或降低阳性强度，即配即用，不宜久置。
3、复染时，Leagene苏木素染色液或甲基绿染色液二者取其一。
4、每次染色时，应有阳性对照片。
相关：
编号名称
DC0032 Masson三色染色液
DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)
TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)。