猪瘟的临床诊断

猪瘟的临床诊断与实验室诊断猪瘟（classical swine fever，CSF），又称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒引起的猪的一种热性、致死性、高度接触性传染病，对养猪业影响颇大。

1984年，国际兽疫局（OIE）将其列入A类传染病，我国目前将其定为一类传染病。

根据多年的流行病学研究和文献资料表明，大、中型养猪场通过科学而有效的免疫接种程序所建立的猪群，在猪瘟流行时只引起猪瘟的散发。

尽管实行科学的防疫制度，包括疫苗提高药量，但没有完全扑杀带毒猪，某些养猪场就成为猪瘟的疫源地。

因此，要不断地学习和研究预防猪瘟科学的措施、方法，主要环节是提高防疫措施、诊断、接种后的免疫预防和评价。

对此，养猪场迫切需要及时诊断猪瘟和定期检疫猪瘟，只有快速、灵敏、准确、便捷的临床与实验室诊断，有利于有效地控制和扑灭猪瘟，从而保护养猪业。

1 临床诊断猪体温变化明显，迅速上升到41℃，少数达到42℃，稽留不退。

食欲不振，其特征为病猪把嘴放在食物处片刻，又回到休息处。

精神萎顿，伏卧嗜睡，后肢无力。

先便秘后腹泻，以后交替发生，粪便中混有粘液或血丝。

后期部分病猪有尿血、气喘等症状。

急性结膜炎流出粘液或脓性分泌物，有些上、下眼睑粘在一起。

常在鼻端、耳、四肢侧、腹下有出血斑和出血点，指压不褪色。

个别猪有神经症状：磨牙、痉挛、脚交叉、站立不稳。

先天性猪瘟病毒感染可造成流产、木乃伊胎、畸形、死胎、有震颤症状的弱仔猪出生、或外观正常但生产出被感染的仔猪。

全身性出血，皮肤、粘膜、实质器官都有充血和大小不等的出血点。

淋巴结外观充血肿胀，切面周边出血，呈红白相间的“石样”。

脾脏不肿大，边缘发现楔状梗死区。

肾皮质色泽变淡，有点状出血。

膀胱粘膜表现不同程度的充血，粘膜上有针尖大小的出血点。

扁桃体出现梗死，随着细菌侵入发生化脓性炎症。

肠道有不同程度的充血和出血，回盲瓣、回肠、结肠可见轮层状溃疡即“扣状肿”。

公猪包皮积尿。

根据以上临床症状、特征性病理变化，可以建立猪瘟的初步诊断，但应与猪丹毒、猪副伤寒、猪肺疫、猪弓形体和链球菌病等进行鉴别。

2 实验室诊断根据临床症状、特征性病理变化，建立猪瘟的初步诊断，但确诊、非典型猪瘟，特别是仔猪表现的复杂症状，难以做出诊断，必须借助实验室诊断进行确诊，现在实验室诊断应用方法有动物试验、病毒分离、免疫荧光试验等。

2.1 动物试验取病猪的扁桃体、脾脏、肾脏、淋巴结等组织（扁桃体是分离病毒首选器官，如采集不到扁桃体，也可采集脾脏、肾脏、淋巴结），剪碎、研磨，加生理盐水制成乳剂，无菌处理后接种易感猪，观察发病情况，然后分离病毒。

中国兽医药品监察所建立用家兔代替易感猪诊断猪瘟试验（兔体免疫交叉试验），将病料乳剂接种健康家兔，7d 用兔化猪瘟弱毒注射家兔，24h后每6h测温1次，连续3d。

无定型热反应，说明病料中含有猪瘟病毒。

2.2 病毒分离取病猪的扁桃体、脾脏、肾脏、淋巴结组织，加双抗后磨成乳剂，过滤、离心后取上清液，接种PK-15、PK-2a、ST等细胞进行病毒分离。

Moormann等用SK-6细胞培养克隆化的猪瘟病毒，获得高效价的猪瘟病毒，并提取猪瘟病毒的RNA，建立猪瘟病毒的cDNA文库，完成Alfort株、Brescia株的全基因序列分析。

2.3 免疫荧光试验用冰冻切片或细胞触压片进行直接或间接荧光抗体染色，也可先将病料乳剂接种于细胞培养后，再用荧光抗体检测感染细胞，能直接检出感染细胞中的病毒抗原。

此法方便快速、检出率高，许多国家将它作为执行猪瘟消灭计划的法定诊断试验。

2.4 血清中和试验可以检测出猪体的抗体，目前最常用方法是免疫荧光中和试验、PAV株中和试验。

邵振华等利用免疫荧光中和试验，对70日龄65份、5～6日龄34份、7月龄44份的猪瘟非免疫血清进行猪瘟母源抗体检测，结果70日龄阳性率52.3%，到5～6月龄全部转为阴性。

2.5 间接血凝试验操作简单，易制定，既可检测抗原，也可检测抗体，主要是监测猪瘟免疫抗体水平。

树春等将猪瘟兔化弱毒株细胞培养物浓缩纯化，致敏由戊二醛鞣酸处理的健康绵羊红细胞，制成冻干猪瘟间接血凝诊断液，用以检测血清中的猪瘟抗体效价。

2.6 骨髓细胞学检查法病初取病猪胸骨的骨髓浆汁做成涂片，姬姆萨染色后镜检，出现副淋巴母细胞，确定病猪感染猪瘟病毒。

2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）酶免疫分析技术是继荧光技术后发展起来又一先进诊断技术，其基本原理是特异性反应系统、间接放大系统和显示系统结合起来，用于检测抗体或抗原的一种免疫方法。

Shannon等报道，在猪瘟感染前病毒血症产生时，采其血清进行ELISA检测猪瘟病毒，可做早期诊断，捕获ELISA能够检测2种不同猪瘟病毒株感染的病猪的血液和组织中的抗体。

2.8 核酸探针杂交试验核酸探针技术以病毒RNA基因组为模板制备探针，在cDNA合成后进行Southern-blotting。

这种方法特异性强、准确可靠，可用于不同毒株的分离和鉴定。

Cruliere等、Dable等、Colijin等利用猪瘟病毒基因组RNA构建cDNA，与牛病毒性腹泻病毒进行序列分析，合成36个探针，按照它们在病毒基因组的位置，根据特异杂交带区别猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒以及绵羊边界病病毒。

2.9 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）是以病毒RNA为模板进行反转录，再以PCR进行核酸扩增来检测猪瘟病毒。

罗廷荣等应用RT-PCR对猪瘟诊断表明，RT-PCR技术可应用于临床诊断。

Sand-Vik等和Glodrick等分别利用此法对猪瘟病毒进行检测，结果显示此法具有检出率高、特异性强，微量病料即可诊断，且具有生物安全性，无散毒的危险。

实验室诊断方法介绍如下：(一)动物接种检测猪瘟病毒的敏感方法，应用易感的幼龄猪(10～20kg体重)进行接种试验。

取病料或新鲜猪尸的血液或组织乳剂，肌肉注射接种1～2头幼猪。

试验猪应事先进行血清中和试验，以排除有过猪瘟病毒或牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染。

如果幼猪在接种后6～7天停食或体温升高，则立即采血分离病毒。

幼猪发病死亡后，立即采取扁桃体、脾脏、淋巴结、肾脏等做病毒分离。

如果幼猪在接种后21天不发病或发病后康复，则采血测定血清的中和抗体效价，并用强毒进行攻毒试验。

从血液或组织中可分离到猪瘟病毒，被接种的幼猪产生中和抗体，对强毒攻击表现免疫性，即可判为阳性。

相反，幼猪不发病，不产生中和抗体，对强毒攻击有易感性，则判为阴性。

如果幼猪发病或死亡，但未分离出猪瘟病毒也不产生中和抗体，则应考虑其他病原感染的可能性。

由于普遍存在低毒力的病毒株，所以被接种幼猪即使不呈现猪瘟症状，也应进行血液中的病毒分离试验。

(二)免疫荧光试验主要用于检测病毒抗原，是目前国外实验室诊断猪瘟的最常用方法，结果直观、可靠。

特别是在疫情初起必须查清病原、检疫及以猪场猪瘟净化时，此种检测方法尤为重要。

进行免疫荧光试验时，将待检病猪的扁桃体、肾脏、淋巴结、脾脏等组织的冰冻切片或抹片，或待检细胞培养片，经丙酮固定后，滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片、抹片或细胞片表面，置37℃作用30min，然后用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2，0.01mol/L)洗涤，自然干燥后置荧光显微镜下观察。

必要时，设立抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。

在荧光显微镜下，见切片、抹片或细胞培养物(细胞盖片)中有胞浆荧光，并由抑制试验证明为特异性荧光，判为猪瘟阳性反应；无荧光判为阴性反应。

必须指出，牛病毒性腹泻病病毒与猪瘟存在共同抗原性，因此，牛病毒性腹泻病病毒也能结合猪瘟荧光抗体。

但因牛病毒性腹泻病病毒对猪并无明显的病原性，也不能在猪体充分增殖，因此不至于干扰诊断结果，且因牛病毒性腹泻病病毒可在细胞培养物上引起细胞病变，鉴定并不困难。

(三)中和试验血清中和试验可以检出动物体的抗体，但因推广应用弱毒疫苗，猪群中的猪瘟抗体滴度普遍较高，故应进行双份血清的检查(前后期相差14天以上)，才能确立抗体滴度增高与感染患病的关系。

目前最常应用的血清中和试验方法是免疫荧光中和试验，即用定量病毒加不同稀释度的被检血清进行试验。

同时以SPF猪血清作为阴性对照，以猪瘟高免血清作为阳性对照。

所有试验血清均经56℃灭活30min后，按下列步骤进行：用含0.5％乳白蛋白水解物和0.025mol/L的MgCl2•6H2O(即每1000mL中含有5.07g)的Earle氏液稀释病毒和被检血清。

被检血清按4倍连续稀释法稀释，由1:4至1:1024。

取不同稀释度的血清分别和等量病毒液混合，置37℃感作1h，随后接种飞片上的PK-15细胞培养物。

同时设置各种对照组。

再培养18～24h，取出后做免疫荧光抗体检查。

计数各飞片中荧光细胞灶的数目。

与对照组相比较，凡能减少90％荧光细胞灶的血清稀释度就是该血清的终点滴度。

1:4血清组的荧光细胞灶减少不到90％者，判为阴性。

(四)琼脂扩散试验虽可选用病猪的脾、淋巴结和肠段为病料制备抗原，但以胰腺最好。

另需要具备特异性好的猪瘟高免血清。

本法操作简单，但敏感性较低，肯定是猪瘟病例的阳性检出率也低于50％。

欧洲一些国家，如英国的某些诊断实验室专门制备高价免疫血清和抗原，并有统一的判定标准。

用pH8.6的巴比妥缓冲液配制1.2％琼脂，加万分之一柳硫汞防腐。

按中央1孔，周围6孔的模式打孔。

孔径5mm，孔间距6mm。

检测抗原时，将高免血清滴人中央孔，周围孔分别滴加标准抗原和待检病料乳剂。

检测抗体时，将标准抗原滴人中央孔，周围孔上、下2孔滴加高免血清，其他4孔分别滴加被检血清。

(五)新城疫病毒强化法在一定条件下，先被猪瘟病毒感染的猪睾丸的细胞，在随后再感染新城疫病毒时，可以产生细胞病变。

这一现象被用来检测猪瘟病毒，称为新城疫病毒强化法，简称END(Exaltation of NDV)。

直接法END(将被检病料直接接种细胞培养物)的敏感性较低，但如改用两步法，即先将被检材料接种猪脾细胞培养物，传代适应之后再做END试验，则可明显提高其敏感性，几乎能与易感猪接种法等同。

具体做法是在猪睾丸细胞培养物中接种被检材料(HCV)，37℃培养4天，随后接种106个蚀斑形成单位的新城疫病毒，继续培养3天。

根据是否出现细胞病变进行判定。

同时设对照组。

如果细胞培养物出现病变，即表示有猪瘟病毒存在。

END 法适用于检测那些易在猪源细胞中生长的野外毒株，对大部分兔化弱毒株无效，因其往往不能在猪睾丸细胞充分增殖。

(六)酶标记抗体诊断法先用PK-15细胞增殖HCV作为抗原，包被微量滴定板，随后加入被检血清(第一抗体)，冲洗后再加入酶标记的兔抗猪IgG，再经冲洗，最后加入底物显色，判定结果。

由于我国养猪业普遍实施猪瘟兔化弱毒疫苗预防注射，猪血清中几乎都含有猪瘟抗体，给酶标抗体诊断法带来一定的困难。