灰色链霉菌产链霉素汇报、

灰色链霉菌产链霉素
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一、实验背景

灰色链霉菌是一种放线菌，而高氏一号斜面培养基是一种合成培 养基，可用于培养放线菌。种子扩大培养是发酵工程的一个组成部分， 指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜 面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养 ,最终获得一定数
枯草芽孢杆菌原液涂板所得抑菌圈图片
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5、链霉素的活性鉴定
测得抑菌圈直径为 1.7cm，1.4cm,1.5cm 平均值为1.53cm
枯草芽孢杆菌稀释五倍涂板所得抑菌圈 图片
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5、链霉素的活性鉴定
测得抑菌圈直径为 1.8cm，1.4cm,1.5cm 平均值为1.57cm

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4、枯草芽孢杆菌的活化 将配制好的蛋白胨牛肉膏培养基斜面接种枯草芽孢杆菌，方法同灰色 链霉菌活化方法相同。28℃培养24h。

5、链霉素活性的鉴定


5.1 枯草芽孢杆菌悬液制备
加入1ml生理盐水于枯草芽孢杆菌斜面中，轻轻冲下菌落，取至新的 灭菌的1.5mlEP管内，备用。
量和质量的纯种过程。

种子扩培的一般过程是： 斜面菌种 → 一级种子培养（摇瓶） → 二级种子培养(种子罐) → 发酵。根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩
散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供
试品的效价。
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二、实验方法

1、灰色链霉菌的活化 1.1 培养基的制备 本实验原计划采用高氏培养基活化菌种，后因效果不佳，改用PDA培 养基培养。因此制备PDA培养基。

2wk.baidu.com4 发酵液的制备

水解糖160g、尿素5g（单独灭菌）、MgSO40.5g、Na2HPO41.6g、
玉米浆 25~35g 、 FeSO4 和 MnSO4 各20mg/L ，消泡剂 0.3g ，，水 1000mL， pH7.2。
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三、实验结果

1、灰色链霉菌的活化
管中可见成片白色菌落，并且管底含有水。
及枪头、超净工作台等。
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2、斜面培养基的制备 2.1 高氏培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢 二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升， PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以
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2、种子液的制备
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3、链霉菌的发酵
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4、枯草芽孢杆菌活化
由于斜面培养基太软，划线的时 候破坏了培养基，菌落也成片。
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5、链霉素的活性鉴定
测得抑菌圈直径为 1.2cm1.2cm,1.4cm 平均值为1.27cm
划到斜面的顶部。注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。

3 ）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。接种完毕，接种环上的余菌 必须灼烧灭菌后才能放下。

4）斜面置于28℃恒温箱中，培养2~3d观察结果。
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2、种子液的制备 将活化的菌种斜面，在无菌的条件下，注入10mL 无菌水，震荡成孢 子悬浮液（孢子浓度约为8×104个/mL）。待发酵培养基灭菌后冷却 到28℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2mL，标记。

28℃、200r/min旋转式摇床培养24h，观察菌丝体形态及浓度。 3、摇瓶大量发酵 待发酵培养基（ 50ml）灭菌后冷却到 30 ℃时，按接种量 8%-10%进 行接种，即每个发酵瓶加入5ml种子液。32℃、100r/min旋转式摇床 培养24h，发酵过程中，补加灭菌尿素以增加氮源，维持pH值。
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五、讨论

1 、由于考虑到链霉素的抑菌效果，我组采用不同倍数稀 释的枯草芽孢杆菌悬液。 2、此次实验未取得理想的实验结果，可能原因如下： ① 发酵液中的链霉素浓度低，产物生成少； ② 制得的产物没有分离纯化，所得结果可能是发酵液渗透 所致；

③ 阳性对照未长菌，可能与实验操作、样品、菌液有关。
上培养基中）。

2.2 PDA培养基：淀粉含量高的土豆、葡萄糖、琼脂。将土豆切成小 块，煮烂用纱布滤出土豆汁。将1000ml的土豆汁中加入葡萄糖20g，
琼脂15-20g。
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2.3 种子液的制备 豆饼粉 20g 、淀粉 40g 、酵母膏 5g 、蛋白胨 5g ，硫酸铵 3g ，硫酸镁 0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000mL、pH7.2-7.4。

5.2 枯草芽孢杆菌悬液的稀释 用生理盐水将悬液分别稀释5倍和10倍，备用。
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5.3 涂平板 将制备好的不同浓度的枯草芽孢杆菌悬液涂布于4个制备好的LB平板，
浓度分别为原液、5倍、10倍，第4个平板作为阳性对照，悬液浓度为
原液。

5.4 打孔 将涂布好的平板用1ml枪头打3个孔，孔径光滑均一。 5.5 加样 将发酵液取10ml于10mlEP管内，2000r/mim离心5min，取上清加 于每个孔内，加满为止，但不能溢出。阳性对照的孔内加入一定浓度 的链霉素液。

37℃培养12h，观察抑菌效果。
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实验材料的准备

1、实验器材 天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、 18mL × 180mL 试管、棉花、电炉、烧杯、报纸、记号笔、酒精灯、 接种环、250/500ml三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、
接种环、涂布棒、旋转式摇床、4℃冰箱、37℃孵箱、各型号移液枪
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1.2 斜面接种
1) 左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种 环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻
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2) 左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手 掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基
上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部向上划一直线，一直
枯草芽孢杆菌稀释十倍涂板所得抑菌 圈图片
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5、链霉素的活性鉴定
平板上未见预期结 果，即透明的抑菌 圈，培养基上也未 长菌。
阳性对照，枯草芽孢杆菌原液涂板所得图片
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四、结论

通过活化灰色链霉菌并将其大量发酵，离心获取产物即链 霉素；通过打孔加入链霉素，观察其抑菌圈大小判断链霉 素的效价，可评价制得链霉素的活性。