最新分子生物学(考研复习幻灯片课件

分子杂交的目的就是运用特异性探针鉴定复 杂的靶DNA中同源的DNA片段。
双链probe或DNA解链主要取决于：
1．链的长度：链越长，需要的 能量多才 能解链； 2．碱基成分：GC含量高，较难变性； 3．化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰 胺，尿素破坏双链
核酸探针
核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，
副密码子：tRNA分子上决定其携带何种氨基 酸的区域，能被AA-tRNA合成酶识别。
核酶（ribozyme）
核酶(Ribozyme)是一种具有核酸内切酶活性 的反义RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列， 具有解离后重复切割相同靶分子的能力。
核酶发现的意义
它突破了“酶是蛋白质”的传统概念。 核酸性酶的发现对科学家们普遍感兴趣的生命的
tRNA
tRNA的二级结构
aa接受臂（amino acid arm） 二氢尿嘧啶环 （DHU loop） 反密码环（anticodon loop） 额外环（extra loop） TψC环（TψC loop）
同功tRNA：识别同种氨基酸，但反密码子不 同的多个tRNA。
多数tRNA和少数tRNA：反密码子相同但结 构不同的tRNA。
核酸的复性
定义 指变性DNA分子在适当条件下，两条彼 此分开的链自发重新缔合成为双螺旋结构
复性过程：成核作用；拉拉链作用 复性条件
足够的盐浓度，0.15～0.50mol/L 合适的温度：比Tm低20～25℃ 样品的性质 DNA的浓度 DNA片段的大小
核酸杂交技术（分子杂交）
分子杂交技术 利用核酸双链的碱基互补、 变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的 单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单 链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核 酸序列的存在。
包括正超螺旋和负超螺旋，在一定条件下， 可互相转变。双螺旋DNA的松开导致负超 螺旋，而拧紧则导致正超螺旋。
超螺旋DNA的性质
结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度 快。
变 性
核内不均一RNA（hnRNA）
真核细胞mRNA的原始转录物是分子量极大的前 体，在核内加工过程中所形成的分子大小不一的 中间产物。
常用的标记方法
缺口平移法 随机引物法
探针来源
基因组探针从已建立的基因组中筛选和分离所需的目 的基因。DNA克隆苷酸探针
根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA 片段。一般长约15～50个bp。多数探针的制备 都通过分子克隆的方法获得。
常用核酸分子杂交方法
Southern 印迹杂交法 Northern 印迹杂交法 斑点杂交或狭缝杂交法 菌落杂交 夹心杂交法 原位杂交
起源这一问题有了新的认识，对生物前化学 （prebiotic chemistry）有重要贡献。
核酶的类型
剪切型核酶
催化自身或者异体RNA的切割，相当于核 酸内切酶。
剪接型核酶
具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
核酶的催化活性
核苷酸转移作用 磷酸二酯键水解作用 磷酸转移反应催化作用 脱磷酸作用 限制性内切酶作用

核酸的杂交
定义
不同来源的、序列互补的单链RNA、 DNA， 或DNA和RNA，根据碱基互补原则，借助氢键连 接为双链分子的过程。
核酸杂交类型
单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA） 单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA） 单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）
核酸的变性
定义：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，但 并不涉及共价键的断裂
开放阅读框（open reading frame，ORF）
mRNA分子上从起始密码子开始到终止密码子结 束的一段连续的核苷酸序列，即mRNA分子上的 编码区。
真核生物mRNA的结构
3’端具有polyA结构； 5’端具有帽子结构； 只有一个开放阅读框。
原核生物mRNA的结构 3’端不具有polyA结构； 具有一个或多个开放阅读框。
随机引物法（6核苷酸引物标记法）
原理及过程：
利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成 含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→ 3’ 聚合酶活性。
被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模 板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为 起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。 反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成 的DNA链中，探针即被标记。
能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合， 进而检测同源序列。
Probe可以是整个基因，或是基因的一部分， 是DNA，也可以是RNA。
探针的标记
将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。 常用于标记探针的标识物
同位素：32P , 35S , 3H-dNTP等； 非同位素：地高辛-dNTP ，生物素-dNTP。
缺口平移法 （Nick Translation）
反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口， 然后利用DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性， 在缺口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸；同时 DNA聚合酶I有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口 处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的 核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记的单核 苷酸，随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进 行，探针即被标记。
变性方法：热变性、酸碱变性、化学变性剂 增色效应（hyperchromicity）由于DNA变性而引
起的光吸收增加的现象
DNA的融点（或熔解温度，Tm）DNA分子的一半 发生变性时的温度为Tm。
DNA分子的变性是一个爆发过程，变性作用发生在 一个很狭窄的温度范围（6～8℃），变性曲线为双 曲线
分子生物学（考研复习）
生物的遗传物质是DNA
Griffith，1928：肺炎双球菌转化实验 Avery，1943：体外转化实验 Hershey，1952：噬菌体转导实验
DNA超螺旋结构
超螺旋的意义：紧密，体积更小；能影响 双螺旋的解链程序，因而影响DNA分子与 其它分子之间的相互作用。