细胞工程技术及其在药物领域的应用__论文

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课程论文

论文题目：细胞培养的用途

课程名称：细胞工程技术及其在药物领域的应用

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细胞培养与抗癌药美罗华的生产

馬董琦

摘要: 通过细胞融合技术生产杂交瘤细胞，利用细胞大规模培养生产单克隆体----利妥昔单抗(美罗华的主要成分)，治疗癌症。

关键词: 杂交瘤细胞细胞培养单抗

面对死神癌症,紫杉醇毕竟过于昂贵.而杂交瘤细胞生产的单克隆抗体,素具有的特异性---生物导弹,灵敏度高，纯度高.也就是可以对癌细胞定向给药针对消灭. 单抗药物长久以来单抗一直被认为对人类癌的诊断和治疗有很高的价

值.

杂交瘤技术

Kohler和Milstein1975年首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体，为此获得1984年诺贝尔奖。该技术将可以分泌单一抗体的淋巴细胞与可以无限增殖的骨髓瘤细胞融合，获兼具两种细胞特性的杂交细胞。这种细胞可以大量增殖并产生纯一的抗体，即单克隆抗体。

细胞培养

指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织，成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。

一．特异性杂交瘤细胞的生产

1.免疫脾细胞的制备制备杂交瘤细胞的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾

内直接免疫法。

2.骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3.细胞融合的关键:

1)技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。

这必然要失败的。

2)融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，

以及适宜的无菌操作技术是至关重要的.

4 阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有 RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。

5 克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限

稀释法。

1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复

杂，效率低，故不常用。

2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义

的细胞。

3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有

限稀释法好。

4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。

6 细胞的冻存(备用):可选择用-196摄氏度的液氮保存.

二大规模特异性单克隆抗体的制备

生物反应器

搅拌与通气在固定床的上方，在搅拌中产生负压，迫使培养基不断流经中间聚酯片载体，有利于营养物质和气体的传递。生反应器填充载体，高消毒；接种

细胞前需将反应器中的NLM 放出并加入新鲜培养基。

连续灌流培养

待种子细胞扩增培养到一定密度时接种到生物反应器中，接种细胞密度为，严格无菌操作以防污染。细胞在载体上生长，注意其培养条件温

度.搅拌速度溶氧气混合系统供气（氧气、空气、二氧化碳、氮气），以上设

定参

数由生物反应器自动化控制。当WJ 值低于0R!，葡萄糖消耗量，开始灌流新鲜培养基，设定灌流速度与回收速分离纯化等操作不再坳书

选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以

利于单克隆抗体的浓缩和纯化。

细胞培养注意事项

1、实验材料要新鲜，从活体分离材料后要低温保存，并尽快进行细胞分离实验。

2、无菌操作。操作时用的培养液，可加平时细胞培养液5倍含量的青链霉素。

3、用酶法分离细胞时，注意酶液的浓度和控制消化时间。

贴块法分离细胞时，注意动作要轻柔，不要伤到细胞组织，组织块边缘尽量平

整有利于细胞游离。

4、培养液的选择。不同的细胞有对培养液中营养的要求不同，根据所分离细胞

的特性选择。

美罗华

药物成分:本药除活性成分(利妥昔单抗)外，尚含有以下非活性成分：枸橼酸钠，聚山梨醇酯80，氯化钠和注射用水。本药为无色澄清液体，贮存于无菌，无防

腐剂，无致热原的单剂瓶中。

适应症: 适用于复发或化疗抵抗性B淋巴细胞型的非何杰金氏淋巴瘤的病人

作用机理:利妥昔单抗(美罗华)为一种单克隆抗体，该抗体与CD20抗原特异性结合。该抗原在95%以上的B淋巴细胞型的非何杰氏淋巴瘤中表达。美罗华在与抗体结合后，CD20不被内在化或从细胞膜上脱落,也不以游离抗原形式在血