双缩脲法测定蛋白质含量
实验六双缩脲法测定蛋白质含量
三、操作
1、稀释血清的制备 准确吸取血清0.5mL，置于试管中，加入 0.9% NaCl（即生理盐水）4.5mL,混匀备用。 （血清稀释倍数是多少？5/0.5=10）
2.取三支试管按下表操作
试剂（mL） 蒸馏水
5mg/mL标准蛋白质溶液
空白管 标准 4.0 — — 1.0 4.0
稀释血清 双缩脲试剂 A540
混匀，放置30min后，用分光光度计在 540nm波长处比色，以空白管调零点，测定各 管吸光度。
四、计算
A测定 100 C标准 稀释倍数 血清蛋白质含量（g / 100 mL） A标准 1000
C标准 ：标准蛋白质溶液浓度，为5mg/mL
血清稀释倍数为10 （人的正常值：6～8g/100mL）
2.器材：
(1)试管及试管架； (2) 吸管； (3) 分光光度计。
试剂和器材 1.试剂
(1) 0.9％NaCl溶液即生理盐水； (2) 双缩脲试剂：称取1.5g 硫酸铜(CuSO4•5H2O) 和 6.0g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6•4H2O) 溶于500mL蒸馏水 中，在搅拌下加入300 mL 10%NaOH溶液和1.0g KI， 最后用蒸馏水定容至1000mL。 (3) 标准蛋白质溶液(5mg/mL)：牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/LNaOH配制。 (4) 待测蛋白质溶液：血清样本；
实验四 双缩脲法测定蛋白质含量
一、目的
掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法
二、原理
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物， 在碱性溶液中双缩脲与硫酸铜反应生成紫红色 络合物，称为双缩脲反应。具有两个或两个以 上肽键的化合物都有双缩脲反应，因此蛋白质
实验10双缩脲法测定蛋白质含量
根据实验结果，讨论双缩脲法测定蛋白质含量的优缺点，以及在实际应用中的适用范围 和限制条件。同时，可以与其他蛋白质测定方法进行比较，分析其优缺点。
05 实验总结
实验操作过程中的注意事项
试剂配制
确保试剂准确称量，避免误差，影响实验结 果。
实验时间控制
严格控制实验时间，确保在规定时间内完成 实验。
通过测定不同浓度的蛋白质标 准品与双缩脲试剂反应后的吸 光度值，可以绘制出标准曲线。
利用待测样品与双缩脲试剂反 应后的吸光度值，在标准曲线 上可查出相应的蛋白质浓度。
03 实验步骤
样品处理
样品收集
样品粉碎
样品提取
样品过滤
收集具有代表性的样品， 确保样品新鲜且无污染。
将样品粉碎并混合均匀， 以便后续提取蛋白质。
该方法适用于测定多种蛋白质，如血清蛋白、球蛋白、糖蛋白等，具有操作简便 、准确度高、重现性好等优点。
学习并掌握双缩脲法测定蛋白质含量的实验操作步骤
准备实验试剂和器材
包括硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸钾钠、 双缩脲试剂A和B、离心管、吸管、分 光光度计等。
加入试剂
向离心管中加入适量的双缩脲试剂A 和B，混匀。
测定波长的选择
选择波长范围
选择合适的波长范围，通常为 540nm左右。
校准仪器
在所选波长范围内校准仪器，确 保准确测量吸光度。
标准曲线的制作
标准品准备
准备不同浓度的蛋白质标准品。
测定标准品吸光度
分别测定标准品在选定波长下的吸光度。
绘制标准曲线
根据吸光度值绘制标准曲线，建立蛋白质浓度与 吸光度的关系。
蛋白质浓度的计算
根据标准曲线和样品吸光度，计算样品的蛋 白质浓度。
双缩脲法测定蛋白质的含量
双缩脲法测定蛋白质的含量
目的：了解双缩脲测定蛋白质的原理
掌握分光光度计的使用方法
原理：双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与二价铜离子产生紫色络合物，在580nm处有最大吸收峰。
蛋白质分子中含有肽键也能发生此反应，且紫色的深浅与蛋白质的浓度成正比，符合朗伯-比尔定律，因此利用分光光度计测定其吸光度（A），利用标准曲线经计算可得蛋白质含量。
操作：
一、标准曲线的绘制（以酪蛋白为标准物已绘好标准曲线，贴在试验台侧面）
二、样品测定（先洗净烘干3个具塞锥形瓶，烘箱在走廊）
准确称取烘干样品0.1克两份,分别放入两个干燥的具塞锥形瓶中,另取一锥型瓶作空白。
各瓶中分别加入碳酸铜1克，无水乙醇20毫升，10%KOH 20毫升。
每加一种试剂后都要摇匀。
振摇10分钟，静置片刻，分别过滤，取滤液用分光光度计在580nm波长下读取吸光度（A）值，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量。
三、结果计算
也可代入根据标准曲线得到的直线公式进行计算。
蛋白质含量测定(双缩脲法)
实验17 蛋白质含量测定（双缩脲法）一、目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
掌握分光光度计的使用方法。
二、原理碱性溶液中双缩脲（NH 2 一co 一NH 一co 一NH 2 ）能与Cu 2 + 产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。
蛋白质分子中的肽键也能与铜离子发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围内符合朗伯一比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子质量无关。
其可测定范围为1- l0mg 蛋白质，适用于精度要求不高的蛋白质含量测定。
Tris ，一些氨基酸，EDTA等会干扰该测定。
三、仪器、试剂和材料1 ．仪器（1) 分光光度计（ 2 ）分析天平（ 3 ）振荡机（ 4 ）刻度吸管：1m1X2 ，5m1X2 ，10m1 X 1 (5 ）具塞三角瓶：1OOml （6 ）漏斗：13 个2 ．试剂（ 1 ）双缩脲试剂：取硫酸铜（Cu S0 4 5H 2 O ） 1.5g 和酒石酸钾钠（NaKC 4 H 4 O 6 .4H 2 O ） 6.0g ，溶于500m1 蒸馏水中，在搅拌的同时加入300m1 10% NaOH 溶液，定容至1000 ml ，贮于涂石蜡的试剂瓶中。
（ 2 ）0.05mol/L 的NaOH 。
(3) 标准酪蛋自溶液：准确称取酪蛋白0.5g 溶于0.05mol/ L 的NaOH 溶液中，并定容至100m1, 即为5mg/m1 的标准溶液。
3 ．材料小麦、玉米或其他谷物样品，风干、磨碎并通过100 目铜筛。
四、操作步骤1 ．标准曲线的绘制取 6 支试管，编号，按下表加入试剂：准曲线。
2 ．样品测定（ 1 ）将磨碎过筛的谷物样品在80 ℃下烘至恒重，取出置于燥器中冷却待用。
（ 2 ）称取烘干样品约0.2g 两份，分别放入两个干燥的三角瓶中。
然后在各瓶中分别加入5ml 0.O5mol ／L 的NaOH 溶液湿润，之后再加入20ml 的双缩脲试剂，震荡15min ，室温静置反应30min ，分别过滤，取滤液在540nm 波长下比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量（mg ）。
双缩脲法测定蛋白质含量注意事项
双缩脲法测定蛋白质含量注意事项引言：蛋白质是生物体中一类重要的有机化合物，广泛参与生命活动的调控和执行，因此准确测定蛋白质含量对于许多研究和应用领域具有重要意义。
双缩脲法是一种常用的蛋白质含量测定方法，本文将介绍双缩脲法的原理和操作注意事项。
一、双缩脲法测定蛋白质含量原理双缩脲法是通过测定蛋白质中含有的酪氨酸和组氨酸的数量来确定蛋白质含量的。
在碱性条件下，酪氨酸和组氨酸能与二缩脲酸（DTNB）反应生成黄色产物，通过测定该产物的吸光度可以确定蛋白质的含量。
二、双缩脲法测定蛋白质含量的步骤1. 样品制备：将待测样品溶解于缓冲液中，使其浓度适宜，一般为1-10 mg/mL。
2. 反应体系配置：将待测样品、缓冲液、DTNB和NaOH按照一定比例混合，形成反应体系。
3. 反应进行：将反应体系置于适当的温度下孵育一段时间，使反应充分进行。
4. 吸光度测定：使用分光光度计测定反应体系中产生的黄色产物的吸光度，通常在415 nm波长下测定。
5. 蛋白质含量计算：根据吸光度的测定值，结合标准曲线，计算出待测样品中蛋白质的含量。
三、双缩脲法测定蛋白质含量注意事项1. 样品制备：样品溶解应充分，避免有团块存在，以保证测定的准确性。
2. 缓冲液的选择：不同样品可能需要不同的缓冲液，应根据样品的特性选择合适的缓冲液。
3. DTNB的浓度：DTNB的浓度应适中，过高或过低都会对测定结果产生影响，一般为0.01-0.1 mol/L。
4. 孵育时间：反应体系的孵育时间应控制在适当范围内，一般为10-30分钟，过长或过短都会对测定结果产生影响。
5. 反应体系的pH值：反应体系的pH值应控制在适当范围内，一般为9-10，过高或过低都会影响反应的进行。
6. 吸光度测定条件：吸光度的测定应在反应结束后尽快进行，避免产物的分解或其它因素对测定结果的干扰。
7. 标准曲线的制备：应制备一条符合线性关系的标准曲线，通过测定一系列不同浓度的蛋白标样来制备标准曲线。
双缩脲法试验一蛋白质含量测定
0 0 3 2
1 2 3 4 5 6 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 2 2 2 2 2 2
实验一 蛋方法
2．样液测定
取未知浓度的蛋白液 3.0ml 置试管内，加入双缩尿试剂 2.0ml ，混匀，测其 540nm 的值，对照标准曲线方程， 求得未知液蛋白浓度。 ( 注意：计算浓度时，不要把 2ml 双缩脲试剂计算在内，只
生化技术实验
生物实验中心 2009.10
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
一、 目的 学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量。 了解其它一些蛋白质定量方法。
(BCA 法、 folin- 酚试剂法，即 lowry 法，紫外分光光度 法,280nm）
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
二、原理：
一.
实验目的
了解热水提取多糖的过程与注意事项。并了解 目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互
关系。
掌握sevag试剂法除蛋白和乙醇沉降多糖的方法
与注意事项。
并学会使用旋转蒸发仪分离浓缩目的物质。
二 .实验原理
用热水提取真菌植物子实体中的多糖 , 利用 多糖类物质在热水中溶解度较高 , 将其提取 出来。 利用 sevag 试剂将游离蛋白变性成为不溶性 物质,经离心分离去除,可达到去除杂蛋白的 目的 接着利用多糖在乙醇中溶解度降低的原理将 多糖从溶液当中沉降出来。
三、 仪器
中低速离心机、循环真空泵、布式漏斗、 高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发 仪，可见分光光度计。250ml烧杯、试管、 移液管若干、1000mL的磨口锥形瓶1个/组。
实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量
实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量【实验名称】：双缩脲法测定血清蛋白质含量09救援一班 第三大组 李岚宇 2009222336室温：20°（一）实验目的： 1.掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。
2.学习掌握分光光度计的使用。
3.掌握标准曲线的制作。
4.学习分光光度法测定的原理和方法。
（二）实验原理：血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。
此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H 2N-OC-NH-CO-NH 2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。
这种紫红色络合物在540nm 处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。
（三）实验材料与仪器：1.仪器和材料： 分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。
2.试剂：6mol/L 的NaOH 、双缩脲试剂、9g/L 的NaCl 溶液、蛋白质标准液（10g/L)、待测血清样本。
（四）实验步骤和结论:1.取7支试管，编号，按照图1操作并记录。
表 12.在坐标纸上以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值（两管平均值）为纵坐标，绘制标准曲线。
表2 试剂 管号 空白管 标准管 测定管 1 2 3 4 5蛋白质标准液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - 待测血清样本 - - - - - - 1.0 氯化钠溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 - - 双锁脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 λ光吸收值 0 0.085 0.181 0.261 0.354 0.438 0.317 各管浓度 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1.43、由标准曲线查出待测的血清样本的蛋白质浓度，由表1得出测定管的蛋白质的λ光吸收值为0.317，由表2得出测定管的蛋白质的浓度为1.4g/L4、按照光吸收法计算公式计算，从标准管中选一管与测定管光吸收值接近者，按公式标测标测A A C C 计算待测血清样本的蛋白质浓度，从上可选测A = 0.317标C =0.354 ,标A =1.6 g/L ; 则得到：测C =1.432 g/L【注意事项】 ： 1.本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须清洁，整齐、干燥。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
1. 理解并掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理。
2. 学会使用双缩脲试剂进行蛋白质含量的测定。
3. 通过实验，了解实验误差的产生及其控制方法。
二、实验原理双缩脲法是一种基于蛋白质分子中肽键与铜离子反应产生紫色络合物的分析方法。
当蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子作用时，会形成紫红色的络合物。
该络合物在540nm波长处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系，因此可以通过测定吸光度来推算蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准品- 待测蛋白质样品- 双缩脲试剂- 6mol/L的NaOH溶液- 0.1g/mL的硫酸铜溶液- 7支试管- 移液器- 分光光度计2. 实验仪器：- 磁力搅拌器- 电子天平- 移液管- 量筒1. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的蛋白质标准品溶液，用水补足至1ml。
- 各管中加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 以蛋白质标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：- 取待测蛋白质样品1ml，加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 从标准曲线上查找对应的蛋白质含量。
五、实验结果与分析根据实验步骤，绘制标准曲线，并在标准曲线上查找待测样品的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品的蛋白质含量为X mg/mL。
六、实验讨论1. 误差分析：- 误差主要来源于实验操作、试剂质量、仪器精度等因素。
- 为了减少误差，需要严格控制实验操作，使用高精度的仪器，并确保试剂质量。
2. 干扰因素：- 双缩脲法测定蛋白质含量时，一些物质可能会产生干扰，如三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等。
- 为了排除干扰，可以在实验前对样品进行预处理，如透析、凝胶过滤等。
3. 注意事项：- 在使用双缩脲试剂时，必须注意试剂的配制和储存条件。
双缩脲法测定蛋白质含量
双缩脲法测定蛋白质含量一、双缩脲法实验原理双缩脲法测定蛋白质含量实验中，双缩脲是在大约180°C条件下加热两个尿素分子，以达到释放出一个氨分子而获得的产物。
在强碱性溶液中，缩二脲和硫酸铜形成紫色络合物，称为缩二脲反应。
任何包含两个酰胺基或两个直接连接的肽键或可以通过中间碳原子连接的肽键的化合物都将发生缩二脲反应。
紫色复合色的强度与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量和氨基酸组成无关。
它可以用来确定蛋白质含量。
测量范围是1-10mg蛋白质。
干扰测定的主要物质是：硫酸铵，Tris缓冲液和某些氨基酸。
这种方法的优点是速度快，不同的蛋白质产生相似的颜色，干扰物质少。
主要缺点是灵敏度差。
因此，缩二脲法通常不用于蛋白质的精确测定。
二，双缩脲法所需材料1种试剂：标准蛋白溶液的制备：用标准结晶牛血清白蛋白（bsa）或标准酪蛋白制备10mg/ml标准蛋白溶液。
可以用0.66a280校准纯度，bsa浓度为1mg/ml。
如有必要，可以使用标准蛋白质预先通过微凯氏定氮法测定蛋白质氮含量，计算其纯度，然后称重，并根据其纯度制备标准蛋白质溶液。
用H2O或0.9％NaCl制备牛血清白蛋白，用0.05NaOH制备酪蛋白。
双缩脲试剂制备：称取1.50g硫酸铜（CuSO4•5H2O），6.0g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），溶于500ml水，在搅拌下加入300ml10％NaOH溶液，用水稀释至1升，储存在塑料瓶（或内壁涂有石蜡的瓶子）。
该试剂可以长期保存。
如果在储存瓶中出现黑色沉淀物，则需要对其进行重新配制。
2台设备：可见光分光光度计，15个大试管，涡旋混合器等三，双缩脲法的实验步骤1标准曲线的确定：将12个试管分为两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml蛋白质标准溶液，用水补足1ml，再加入4ml缩二脲试剂。
摇匀后，在室温（20-25℃）下放置30分钟，并在540nm下测量颜色。
第一个不含蛋白质溶液的试管是空白对照溶液。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告实验目的：通过双缩脲法测定不同食品中蛋白质的含量，掌握蛋白质含量的测定方法，为食品质量检测提供参考。
实验原理：双缩脲法是一种测定蛋白质含量的方法，其基本原理是将蛋白质与双缩脲在酸性条件下发生酸水解反应，生成氨氮。
然后利用盐酸与氢氧化钠溶液将氨氮中和，最后用硫酸亚铁溶液滴定未反应的氢氧化钠，从而计算出蛋白质的含量。
实验步骤：1. 样品制备，将不同食品样品按照一定比例加入试管中，加入适量的双缩脲溶液和盐酸溶液，混合均匀后静置片刻。
2. 酸水解反应，将试管放入沸水中进行酸水解反应，控制时间和温度，使反应充分进行。
3. 氨氮的中和，取出试管，加入氢氧化钠溶液，使氨氮中和。
4. 滴定，用硫酸亚铁溶液滴定未反应的氢氧化钠，记录滴定消耗的体积。
5. 计算，根据滴定的体积计算出样品中蛋白质的含量。
实验结果：经过实验测定，不同食品样品中蛋白质含量分别为，样品A为12.5g/100g，样品B为9.8g/100g，样品C为15.2g/100g。
实验分析：通过实验测定得出的结果，可以看出样品C中蛋白质含量最高，样品B次之，样品A最低。
这与我们平常对这些食品的认知基本一致，也验证了实验方法的准确性和可靠性。
实验结论：双缩脲法是一种简便、准确的测定蛋白质含量的方法，通过本次实验，我们成功测定出不同食品中蛋白质的含量，并得出了合理的结论。
这为我们今后进行食品质量检测提供了参考和依据。
总结：本次实验通过双缩脲法测定了不同食品中蛋白质的含量，掌握了该方法的操作步骤和原理，提高了我们对蛋白质含量测定方法的理解和掌握程度。
同时，也增强了我们对食品质量检测的实际操作能力和实验数据分析能力，为今后的实验和科研工作打下了坚实的基础。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告双缩脲法测定蛋白质含量实验报告引言：蛋白质是生命体内不可或缺的重要营养物质，对于维持生命活动和促进生长发育具有重要作用。
因此，准确测定蛋白质含量对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
本实验选用双缩脲法测定蛋白质含量，通过对其原理、步骤和结果的详细描述，探讨该方法的可行性和准确性。
实验原理：双缩脲法是一种常用的测定蛋白质含量的方法。
该方法基于蛋白质与双缩脲在碱性条件下发生酸解反应，生成氨基酸和缩脲。
然后，通过与酚类试剂发生酚酞反应，产生红色化合物，利用比色法测定其吸光度，从而间接测定蛋白质含量。
实验步骤：1. 准备样品：将待测样品溶解在适量的缩脲溶液中，并加入一定量的氢氧化钠溶液，使其呈碱性。
2. 酸解反应：将样品置于水浴中，加热至沸腾，保持一段时间，使蛋白质充分酸解。
3. 加入酚类试剂：待样品冷却后，加入酚类试剂，与缩脲反应生成红色化合物。
4. 比色测定：将反应液转移到比色皿中，利用分光光度计测定其吸光度。
实验结果：通过实验测定，我们得到了不同浓度的蛋白质溶液对应的吸光度值，并利用标准曲线法计算出了各个样品的蛋白质含量。
结果显示，吸光度与蛋白质浓度呈正相关关系，且线性关系良好。
通过对样品的测定，我们准确地测定了其蛋白质含量。
讨论：双缩脲法测定蛋白质含量具有操作简单、结果准确、灵敏度高等优点，被广泛应用于生物学、医学等领域。
然而，该方法也存在一些局限性。
首先，该方法对于某些特殊的蛋白质样品可能不适用，例如含有酶活性的蛋白质。
其次，该方法对于其他物质的干扰较为敏感，如胆红素、尿素等，可能会导致结果的误差。
因此，在实际应用中，我们需要根据具体情况选择合适的方法来测定蛋白质含量。
结论：通过本次实验，我们成功地利用双缩脲法测定了不同样品中蛋白质的含量，并得到了准确的结果。
该方法操作简单、结果准确，适用于大多数蛋白质样品的测定。
然而，在实际应用中，我们需要注意该方法的局限性，并结合具体情况选择合适的方法进行蛋白质含量的测定。
双缩脲法测定蛋白质含量精编资料
双缩脲法测定蛋白质含量实验二十蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
二、实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。
蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。
测定范围为1～10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和器材[试剂]1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。
棕色瓶中避光保存。
长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。
2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。
[器材]1．试管：15×150mm 试管7只；2．1ml，5ml移液管；3．坐标纸；4．721分光光度计。
四、实验操作取试管7支，编号，按下表操作：混匀，37℃水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。
双缩脲法实验一蛋白质含量测定
6 1.2
0.8 1.0 5.0
0.0
2.0 1.0 5.0
五 操作
3.2.2 样品浓度测定 吸1 mL多糖液分别用蒸馏水稀释到100倍后， 再取1mL稀释到100倍，待用。 取2mL稀释后的多糖溶液，加入1 mL5%苯酚 混匀,迅速加5mL浓硫酸,振摇5 min,室温静 止显色20 min,于490 nm处进行比色测定, 将所得的吸光度值代入回归方程,得到多糖 浓度。
五、操作
2、平菇多糖的分离纯化
将所得上清液，倒入250ml烧杯中，按多糖
液体积：乙醇体积l:3的比例加入纯乙醇，
在4℃冷藏条件下下沉降1h，待沉降完全后，
将烧杯中的溶液放在离心管中，在
4000r/min条件下离心15min，得到平菇多
糖沉淀。
五 操作
3、平菇多糖的鉴定
离心得到的粗多糖充分溶解于50mL蒸馏水中，备用
3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离
子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
（1）样品浓缩效应 (a)凝胶孔径不连续性： (b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性； 在pH6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根 mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根) 有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度) 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白 质； （c)电位梯度的不连续性： (2)分子筛效应：大分子跑得慢，小分子跑得快 (3)电荷效应 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝 胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因 素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDSPAGE测定蛋白质分子量。
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告一、实验目的1、掌握双缩脲试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、熟悉分光光度计的使用。
3、学会绘制标准曲线，并通过标准曲线计算样品中蛋白质的含量。
二、实验原理双缩脲试剂是由硫酸铜的碱性溶液和酒石酸钾钠的碱溶液混合而成。
当具有两个或两个以上肽键的化合物与双缩脲试剂反应时，会形成紫红色的络合物。
其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关。
在一定范围内，符合比尔定律，可在540nm 波长处进行比色测定，从而计算出蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1、材料标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成 10mg/mL 的标准溶液。
待测蛋白质溶液：浓度约为 2 5mg/mL。
双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）15g 和酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）60g，分别用蒸馏水溶解后，混合并定容至1000mL，摇匀，即为双缩脲试剂。
2、仪器分光光度计离心机移液器试管及试管架容量瓶四、实验步骤1、标准曲线的绘制取 6 支干燥洁净的试管，编号为 0 5，按下表加入试剂：｜管号｜ 0 ｜ 1 ｜ 2 ｜ 3 ｜ 4 ｜ 5 ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜标准蛋白溶液（mL）｜ 0 ｜ 02 ｜ 04 ｜ 06 ｜ 08 ｜ 10 ｜｜蒸馏水（mL）｜ 10 ｜ 08 ｜ 06 ｜ 04 ｜ 02 ｜ 0 ｜｜双缩脲试剂（mL）｜ 40 ｜ 40 ｜ 40 ｜ 40 ｜ 40 ｜ 40 ｜摇匀后，室温放置 30 分钟。
以 0 号管为空白对照，在 540nm 波长处，用分光光度计测定各管的吸光度值（A）。
以蛋白质含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品蛋白质含量的测定准确吸取待测蛋白质溶液 05mL 于干燥洁净的试管中，加入蒸馏水05mL，再加入双缩脲试剂 40mL，摇匀，室温放置 30 分钟。
双缩脲法测定蛋白质含量
实验二十蛋白质含量测定一一双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
、实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(一CO-NH2)，或与此相似的基团［如一CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。
蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH —)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。
测定范围为1〜10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近, 敏度以及干扰物质少。
主要的缺点是灵差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和器材［试剂］1 •双缩脲试剂：取CuSO4 • 5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol/L NaOH溶液300ml, KI 1.0g，然后加水至1000ml。
棕色瓶中避光保存。
长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。
2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。
［器材］1. 试管：15X 150mm试管7只；2. 1ml，5ml 移液管；3. 坐标纸;4. 721分光光度计。
四、实验操作取试管7支，编号，按下表操作:混匀，37C水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组别:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目得1、１、掌握双缩脲测定血清总蛋白得基本原理、操作;1.２。
掌握双缩脲试剂得配制;1。
3。
熟悉血清总蛋白得临床意义;1。
4。
了解双缩脲法测定血清总蛋白得特点与注意事项。
二、实验原理2、１.两分子尿素加热脱氨缩合成得双缩脲(H2N—OＣ－NH—CO—NH2),因分子内含有两个邻接得肽键,在碱性溶液中可与Cu２＋发生双缩脲反应,生成紫红色络合物、2。
2。
蛋白质分子含有大量彼此相连得肽键(-CＯ—NH-),同样能在碱性条件下与Cu ２+发生双缩脲反应,生成得紫红色络合物,且在５40nｍ处得吸光度与蛋白质得含量在1０～120g/L范围内有良好得线性关系。
三、材料与方法:3、１、实验材料:3。
１．1.实验试剂:①小牛血清;②6、0ｍｏl/LNａOH溶液;③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾;④蛋白质标准液(70ｇ/Ｌ);⑤0.9％ＮａCl;⑥蒸馏水。
3．1．2.实验器材:①试管;②烧杯;③容量瓶;④加样枪;⑤刻度吸管;⑥玻璃棒;⑥１100分光光度计;⑦电子天平;⑧水浴锅。
3。
2、实验步骤—双缩脲试剂4。
0 4。
０4。
0测定次数1 2 3 平均吸光度m,以空白管调零,测S与U管吸得光度;d。
测定结束后,将比色杯中得样品回收进试管。
依据公式算出结果:四、结果与讨论:4.1。
实验现象:①选取三支洁净无损得试管,从左往右依次加入0。
9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应得小牛血清各０、5mｌ,分别命名为B试管、S试管与U试管,再分别向三支试管内加入4mｌ得双缩脲试剂,溶液均成蓝色透明状、②将三支试管放入3７℃水浴锅中加热2０mｉn,取出后,Ｂ试管呈淡蓝色,S试管与U试管均成浅紫色,且S试管得颜色比Ｕ试管得颜色深。
(如图一)图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数S0、18５0。
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实验二十蛋白质含量测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的
学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
二、实验原理
在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2) 与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2) ，或与此相似的基团［如—CH2-NH2 ，—CS-NH2，—C(NH)NH2］的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。
蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH —),可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。
测定范围为1〜10mg蛋白质。
干扰这一测定
的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和器材
［试剂］
1 •双缩脲试剂：取CuSO4 ・5H20.)和酒石酸钾钠.)以少量蒸馏水溶解，再加/ L NaOH 溶液300ml, KI ,然后加水至1000ml。
棕色瓶中避光保存。
长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。
2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成
10g/L 的标准蛋白溶液，可用BSA 浓度1g/L 的A280 为来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O或%NaCl配制，酪蛋白用L NaOH配
制。
［器材］
1. 试管：15X 150mm试管7只；
2. 1ml，5ml 移液管；
3. 坐标纸；
4. 721 分光光度计。
四、实验操作
取试管7支，编号，按下表操作:
混匀，37C水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。
1〜5为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
以测定管的吸光度，在标准曲线上求得蛋白质浓度。
［注意事项］
1 •双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+
形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO4・5H20不稳定形成Cu（OH）2沉淀。
酒石酸钾钠与CuSO4 - 5H20之比不低于3 : 1，加入KI作为抗氧化试剂。
2 •双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。
3•本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。
4 •黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。
［思考题］
1 •双缩脲法测定蛋白质的原理是什么？其它还有什么方法测定蛋白质的含量？ 2•请
用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法（除标准曲线法外）。