一种准确测定眼角膜上皮缺损面积的内参对照法_张小锐
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［基金项目］ 国家重大新药创制科技重大专项综合性新药研究开发 技术大平台（2009ZX09301-002） ；军事医学科学院毒物药物研究所科 研基金（2009D03） ［作者简介］ 张小锐，男，助理研究员，博士研究生，主要从事免疫药 理等研究，E-mail：zhangx_r@ 126． com ［作者单位］ 军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850 ［通讯作者］ 周 文 霞，Tel：010-66931625，E-mail： zhouwx @ nic． bmi． ac． cn
图 3 激活 AOI
步骤 3： AOI 数 据 获 取。点 击 Count / Size 对 话 框 中 的 View 菜单，并选取菜单下的 Statistics 选项，Area 数据见于该 对话框中（图 4）。
图 4 获取 AOI 数据
步骤 4：数据输出。点击 Count / Size 对话框中的 File 菜 单，选取 Export Options 选项，设置数据输出的位置，然后点 击 File 菜单下的 Export Data 选项即可输出数据（ 图 5） 。
图 1 角膜上皮缺损荧光素钠染色结果 A． 正常眼角膜上皮不着色；B． 碱烧伤后角膜上皮明显着色
2． 2 IPP 软件应用 步骤 1： IPP 软件的激活及兴趣 区 域 （ area of interest，
AOI） 的选取（ 图 2） 。
图 2 IPP 软件的激活及 AOI 区域的选取
步骤 2：将 AOI 区域激活为目标区域。点击工具栏中的 Measure 菜单，并点击 Count / Size，在出现的对话框中，点击 Edit 菜单，选取 Convert AOI（ s） To Object（ s） 即可激活目标区 域（图 3）。
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军事医学科学院院刊 2010 年 12 月 第 34 卷 第 6 期 Bull Acad Mil Med Sci，Vol 34，No 6，Dec，2010
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一种准确测定眼角膜上皮缺损面积的内参对照法
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技术方法
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张小锐，韩 寒，周文霞，张永祥，刘克良
［摘要］ 目的 介绍一种自行设计的内参对照法，用于检测眼角膜上皮缺损面积大小。方法 通过兔眼角膜碱烧
［Abstract］ Objective To introduce a self-designed method for determining the cornea epithelial defects． Method The model of alkali-induced rabbit corneal epithelial defects was evaluated． The area was measured using fluorescein sodium staining，round scale，digital photographs and Image-pro plus analysis software． Results The alkali-induced rabbit corneal epithelial defect model was duplicated，and digital photographs under different conditions were taken． By analyzing the photographs，the area was 40． 3 mm2 and 40． 7 mm2 when adopting obverse side shot by 2 independent analyses，and the difference was insignificant compared to the real defect area of 40． 7 mm2 ． There was no difference when the shot distance was changed，but the area was significantly larger than the real epithelial defect when the shot angle was changed． Conclusion A method for determining cornea epithelial defects is established，which can be applied to determining all kinds of irregular surface areas． ［Key words］ cornea； epithelial defect；area；Image-pro plus software
2． 4 不同拍摄角度对测定角膜溃疡面积的影响 分析近距离正面拍摄和远距离侧角度拍摄所获得的数
据（ 表 2） ，发现两组间有明显的统计学差异，并且侧角度拍 摄所获得面积明显高于正面测定值（ 图 7） ，而近距离拍摄组 和对照组间无统计学差异。
表 2 侧面拍照和近距离拍照所获取的角膜缺损面积原始数据
组别 侧角度拍摄组
581
于兔眼角膜中央；1 min 后取下滤纸片，反复用生理盐水冲洗 6 次，2 ml / 次。 1． 3 角膜染色及拍照
造模 1 h 后，滴加盐酸丙美卡因滴眼液 2 滴进行局部麻 醉，并加浓度为 2% 的荧光素钠 5 μl 染色［5］。再用自制圆形 标尺靠近眼角膜，将溃疡处圈在标尺内。最后将数码相机调 节到近景模式，分别控制拍照的距离（5 ～ 10 cm 为近距离， 20 cm 以上为远距离） 、拍照的角度 （90° 为正面拍摄，15 ～ 45°为侧角度拍摄） 观察角膜缺损面积的大小。 1． 4 上皮缺损面积分析
图 5 数据输出
2． 3 不同拍摄距离对测定角膜缺损面积的影响 分析实验动物近距离拍摄和远距离拍摄所获得的数据
（表 1） ，两组间无统计学差异（ 图 6） ，而模型组和对照组（ 根 据损伤半径计算出的溃疡面积） 比较也无明显差异。
表 1 远距离和近距离拍照所获取的角膜缺损面积原始数据
组别
动物编号
远距离正面拍摄组
对照组数据为实际溃疡面积，由造模使用的绵纸片半径 计算而来。其他各组则采用 IPP 软件分析照片的相对溃疡 面积（ A1） 和相对标尺面积 （ A2） ，并根据标尺的实际面积 （78． 5 mm2 ） 计算而来，方法为：测定溃疡面积（ A0） = （ A1 / A2） × 78． 5，具体分析方法见实验结果部分。 1． 5 统计学分析
计学差异。而改变拍摄距离并不影响实验结果的准确性，但改变拍摄照片的角度使测定结果明显高于实际值。结
论 设计并建立了一种准确测定角膜上皮缺损面积的方法，该方法重复性好，适合于多种不规则表面积的测量。
［关键词］ 角膜；上皮缺损；面积； Image-pro plus 软件
［中图分类号］ R772
［文献标志码］ A
近距离正面拍摄组
动物编号
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
A1 A2
1225 2114 1090 1834 1251 2080 988 1854 1113 1784 866 1574 4495 7955 4675 9944 4748 9608 4174 8594 4823 8432 8151 15 515
就可计算出准确的角膜缺损面积，该方法为定量数据的获取 提供了一种更好的途径。
1 材料与方法
1． 1 材料 清洁级新西兰白兔，体质量（2． 0 ± 0． 5） kg，购自本院实
验动物中心。氢氧化钠（ NaOH） ，为北京长城化学试剂厂产 品，分析纯。盐酸丙美卡因滴眼液，购自比利时 Alcaine 公 司。荧光素钠，为北京化学试剂公司产品，配成浓度为 2% 的生理盐水溶液，用 0． 22 μm 的微孔滤膜过滤。尼康 Coolpix 4500 数码相机。Image-pro plus（ IPP）6． 0 图像分析软件， 为 Media Cybernetics 公司产品。自制直径为 10 mm 的圆形 内参照标尺等。 1． 2 眼角膜损伤模型的制备
［文章编号］ 1000-5501（2010）06-0580-03
A control method for accurately determining cornea epithelial defects
ZHANG Xiao-rui，HAN Han，ZHOU Wen-xia* ，ZHANG Yong-xiang，LIU Ke-liang
数据用 x珋± s 表示，并采用 SPSS 12． 0 统计学软件分析成 组设计的定量资料，组间差异用 t 检验，P ＜ 0． 05 表示差异具 有统计学意义。
2 结果
2． 1 角膜上皮缺损荧光素钠染色结果 实验结果显示，正常眼角膜无明显坏死，未见荧光素钠
染色（ 图 1A） 。经过碱烧伤后，角膜发生明显的变性和上皮 缺损，其中荧光素钠染色部位为缺损处（ 图 1B） 。
手术前 15 min，实验兔用硫酸阿托品眼用凝胶及托品卡 胺充分散瞳，5 mg / ml 盐酸丙美卡因滴眼液 1 ～ 2 滴局麻受试 眼，将浸润 1 mol / L 的 NaOH 溶液的滤纸片（ 直径7． 2 mm） 置
军事医学科学院院刊 2010 年 12 月 第 34 卷 第 6 期 Bull Acad Mil Med Sci，Vol 34，No 6，Dec，2010
（ Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）
* Corresponding author，Tel：010-66931625，E-mail：zhouwx@ nic． bmi． ac． cn
兔眼角膜碱烧伤模型是药物临床前研究的常用模型，该 模型可用于抗角膜溃疡及新生血管形成等药物的研究［1，2］。 通过该模型可观察的指标主要有角膜上皮缺损面积及溃疡 深度大小的变化、角膜穿孔率的差异、新生血管的数目以及 眼损伤综合评分等［3］。目前角膜上皮缺损面积的测定主要 是用裂隙灯检查法（ slit lamp examination，SLE） 拍片，经扫描 仪扫描后，采用 Photoshop 等软件将照片缩放到与原始兔眼 同等大小，再用网格法计算照片上角膜缺损处的面积［4］。该 方法步骤多且需要特殊仪器裂隙灯，不利于实验动物观察。 我们所推荐的方法只需分析数码照片，依据内参照标尺面积
A1 / A2 A0（ mm2）
0． 57 0． 47 0． 51 0． 48 0． 58 0． 52 0． 54 0． 47 0． 51 0． 49 0． 55 0． 53
44． 8 37． 2 40． 1 38． 0 45． 3 40． 8 42． 2 37． 0 40． 2 38． 3 42． 9 41． 3
1
2
3
4
5
6
近距离正面拍摄组
1
2
3
4
5
6
A1 A2
1154 2024 2026 4272 1894 3712 1449 2996 1623 2810 1270 2446 3625 6742 6028 12 776 4742 9260 8099 16 620 3924 7186 6208 11 810
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军事医学科学院院刊 2010 年 12 月 第 34 卷 第 6 期 Bull Acad Mil Med Sci，Vol 34，No 6，Dec，2010
图 6 不同的拍摄距离对兔眼角膜溃疡面积测定结果的影响 采用 1 mol / L NaOH 烧伤 1 min 诱导新西兰白兔眼角膜上皮损伤模 型，荧光素钠染色，并用数码相机拍照。角膜缺损面积用 IPP 6． 0 软件分析。x珋± s，n = 6
伤模型，采用荧光素钠染色，圆形标尺做内参照，数码相机拍照与 Image-pro plus（ IPP） 分析软件相结合的方法，测定
Baidu Nhomakorabea
上皮缺损面积。结果 成功复制了兔眼角膜碱烧伤模型，并用数码相机记录不同拍摄条件下的照片。IPP 软件分 析发现，正面拍摄照片两批次的测定均值分别为 40． 3 mm2 和 40． 7 mm2 ，与实际上皮缺损面积 40． 7 mm2 相比，无统
图 3 激活 AOI
步骤 3： AOI 数 据 获 取。点 击 Count / Size 对 话 框 中 的 View 菜单，并选取菜单下的 Statistics 选项，Area 数据见于该 对话框中（图 4）。
图 4 获取 AOI 数据
步骤 4：数据输出。点击 Count / Size 对话框中的 File 菜 单，选取 Export Options 选项，设置数据输出的位置，然后点 击 File 菜单下的 Export Data 选项即可输出数据（ 图 5） 。
图 1 角膜上皮缺损荧光素钠染色结果 A． 正常眼角膜上皮不着色；B． 碱烧伤后角膜上皮明显着色
2． 2 IPP 软件应用 步骤 1： IPP 软件的激活及兴趣 区 域 （ area of interest，
AOI） 的选取（ 图 2） 。
图 2 IPP 软件的激活及 AOI 区域的选取
步骤 2：将 AOI 区域激活为目标区域。点击工具栏中的 Measure 菜单，并点击 Count / Size，在出现的对话框中，点击 Edit 菜单，选取 Convert AOI（ s） To Object（ s） 即可激活目标区 域（图 3）。
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军事医学科学院院刊 2010 年 12 月 第 34 卷 第 6 期 Bull Acad Mil Med Sci，Vol 34，No 6，Dec，2010
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一种准确测定眼角膜上皮缺损面积的内参对照法
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技术方法
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张小锐，韩 寒，周文霞，张永祥，刘克良
［摘要］ 目的 介绍一种自行设计的内参对照法，用于检测眼角膜上皮缺损面积大小。方法 通过兔眼角膜碱烧
［Abstract］ Objective To introduce a self-designed method for determining the cornea epithelial defects． Method The model of alkali-induced rabbit corneal epithelial defects was evaluated． The area was measured using fluorescein sodium staining，round scale，digital photographs and Image-pro plus analysis software． Results The alkali-induced rabbit corneal epithelial defect model was duplicated，and digital photographs under different conditions were taken． By analyzing the photographs，the area was 40． 3 mm2 and 40． 7 mm2 when adopting obverse side shot by 2 independent analyses，and the difference was insignificant compared to the real defect area of 40． 7 mm2 ． There was no difference when the shot distance was changed，but the area was significantly larger than the real epithelial defect when the shot angle was changed． Conclusion A method for determining cornea epithelial defects is established，which can be applied to determining all kinds of irregular surface areas． ［Key words］ cornea； epithelial defect；area；Image-pro plus software
2． 4 不同拍摄角度对测定角膜溃疡面积的影响 分析近距离正面拍摄和远距离侧角度拍摄所获得的数
据（ 表 2） ，发现两组间有明显的统计学差异，并且侧角度拍 摄所获得面积明显高于正面测定值（ 图 7） ，而近距离拍摄组 和对照组间无统计学差异。
表 2 侧面拍照和近距离拍照所获取的角膜缺损面积原始数据
组别 侧角度拍摄组
581
于兔眼角膜中央；1 min 后取下滤纸片，反复用生理盐水冲洗 6 次，2 ml / 次。 1． 3 角膜染色及拍照
造模 1 h 后，滴加盐酸丙美卡因滴眼液 2 滴进行局部麻 醉，并加浓度为 2% 的荧光素钠 5 μl 染色［5］。再用自制圆形 标尺靠近眼角膜，将溃疡处圈在标尺内。最后将数码相机调 节到近景模式，分别控制拍照的距离（5 ～ 10 cm 为近距离， 20 cm 以上为远距离） 、拍照的角度 （90° 为正面拍摄，15 ～ 45°为侧角度拍摄） 观察角膜缺损面积的大小。 1． 4 上皮缺损面积分析
图 5 数据输出
2． 3 不同拍摄距离对测定角膜缺损面积的影响 分析实验动物近距离拍摄和远距离拍摄所获得的数据
（表 1） ，两组间无统计学差异（ 图 6） ，而模型组和对照组（ 根 据损伤半径计算出的溃疡面积） 比较也无明显差异。
表 1 远距离和近距离拍照所获取的角膜缺损面积原始数据
组别
动物编号
远距离正面拍摄组
对照组数据为实际溃疡面积，由造模使用的绵纸片半径 计算而来。其他各组则采用 IPP 软件分析照片的相对溃疡 面积（ A1） 和相对标尺面积 （ A2） ，并根据标尺的实际面积 （78． 5 mm2 ） 计算而来，方法为：测定溃疡面积（ A0） = （ A1 / A2） × 78． 5，具体分析方法见实验结果部分。 1． 5 统计学分析
计学差异。而改变拍摄距离并不影响实验结果的准确性，但改变拍摄照片的角度使测定结果明显高于实际值。结
论 设计并建立了一种准确测定角膜上皮缺损面积的方法，该方法重复性好，适合于多种不规则表面积的测量。
［关键词］ 角膜；上皮缺损；面积； Image-pro plus 软件
［中图分类号］ R772
［文献标志码］ A
近距离正面拍摄组
动物编号
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
A1 A2
1225 2114 1090 1834 1251 2080 988 1854 1113 1784 866 1574 4495 7955 4675 9944 4748 9608 4174 8594 4823 8432 8151 15 515
就可计算出准确的角膜缺损面积，该方法为定量数据的获取 提供了一种更好的途径。
1 材料与方法
1． 1 材料 清洁级新西兰白兔，体质量（2． 0 ± 0． 5） kg，购自本院实
验动物中心。氢氧化钠（ NaOH） ，为北京长城化学试剂厂产 品，分析纯。盐酸丙美卡因滴眼液，购自比利时 Alcaine 公 司。荧光素钠，为北京化学试剂公司产品，配成浓度为 2% 的生理盐水溶液，用 0． 22 μm 的微孔滤膜过滤。尼康 Coolpix 4500 数码相机。Image-pro plus（ IPP）6． 0 图像分析软件， 为 Media Cybernetics 公司产品。自制直径为 10 mm 的圆形 内参照标尺等。 1． 2 眼角膜损伤模型的制备
［文章编号］ 1000-5501（2010）06-0580-03
A control method for accurately determining cornea epithelial defects
ZHANG Xiao-rui，HAN Han，ZHOU Wen-xia* ，ZHANG Yong-xiang，LIU Ke-liang
数据用 x珋± s 表示，并采用 SPSS 12． 0 统计学软件分析成 组设计的定量资料，组间差异用 t 检验，P ＜ 0． 05 表示差异具 有统计学意义。
2 结果
2． 1 角膜上皮缺损荧光素钠染色结果 实验结果显示，正常眼角膜无明显坏死，未见荧光素钠
染色（ 图 1A） 。经过碱烧伤后，角膜发生明显的变性和上皮 缺损，其中荧光素钠染色部位为缺损处（ 图 1B） 。
手术前 15 min，实验兔用硫酸阿托品眼用凝胶及托品卡 胺充分散瞳，5 mg / ml 盐酸丙美卡因滴眼液 1 ～ 2 滴局麻受试 眼，将浸润 1 mol / L 的 NaOH 溶液的滤纸片（ 直径7． 2 mm） 置
军事医学科学院院刊 2010 年 12 月 第 34 卷 第 6 期 Bull Acad Mil Med Sci，Vol 34，No 6，Dec，2010
（ Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）
* Corresponding author，Tel：010-66931625，E-mail：zhouwx@ nic． bmi． ac． cn
兔眼角膜碱烧伤模型是药物临床前研究的常用模型，该 模型可用于抗角膜溃疡及新生血管形成等药物的研究［1，2］。 通过该模型可观察的指标主要有角膜上皮缺损面积及溃疡 深度大小的变化、角膜穿孔率的差异、新生血管的数目以及 眼损伤综合评分等［3］。目前角膜上皮缺损面积的测定主要 是用裂隙灯检查法（ slit lamp examination，SLE） 拍片，经扫描 仪扫描后，采用 Photoshop 等软件将照片缩放到与原始兔眼 同等大小，再用网格法计算照片上角膜缺损处的面积［4］。该 方法步骤多且需要特殊仪器裂隙灯，不利于实验动物观察。 我们所推荐的方法只需分析数码照片，依据内参照标尺面积
A1 / A2 A0（ mm2）
0． 57 0． 47 0． 51 0． 48 0． 58 0． 52 0． 54 0． 47 0． 51 0． 49 0． 55 0． 53
44． 8 37． 2 40． 1 38． 0 45． 3 40． 8 42． 2 37． 0 40． 2 38． 3 42． 9 41． 3
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近距离正面拍摄组
1
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军事医学科学院院刊 2010 年 12 月 第 34 卷 第 6 期 Bull Acad Mil Med Sci，Vol 34，No 6，Dec，2010
图 6 不同的拍摄距离对兔眼角膜溃疡面积测定结果的影响 采用 1 mol / L NaOH 烧伤 1 min 诱导新西兰白兔眼角膜上皮损伤模 型，荧光素钠染色，并用数码相机拍照。角膜缺损面积用 IPP 6． 0 软件分析。x珋± s，n = 6
伤模型，采用荧光素钠染色，圆形标尺做内参照，数码相机拍照与 Image-pro plus（ IPP） 分析软件相结合的方法，测定
Baidu Nhomakorabea
上皮缺损面积。结果 成功复制了兔眼角膜碱烧伤模型，并用数码相机记录不同拍摄条件下的照片。IPP 软件分 析发现，正面拍摄照片两批次的测定均值分别为 40． 3 mm2 和 40． 7 mm2 ，与实际上皮缺损面积 40． 7 mm2 相比，无统