化学免疫荧光组织细胞

四、PAP法 (peroxidase anti-peroxidase)
抗原 ＋Ⅰ抗＋Ⅱ抗＋ PAP 复合物＋底物
PAP 复合物：(2分子抗体3分子酶),小而稳定,穿透性好 注意： Ⅰ抗与 PAP 复合物同源, 第二抗体必须过量
优点:
敏感(较间接法敏感100倍),非特异性染色极轻微
五. ABC法
A-(avidin)卵白素, B-(biotin)生物素化的酶, C-复合 物
免疫细胞化学常用的酶
名称 Horseradish peroxidase 分 子 量 内源性 商品 有
40～45KD
+
Alkaline phosphatase Acid phosphatase
80～120Kd
++
有
100Kd
+++ －
有 有
Glucose oxidase 160～190kD
显色反应(底物)
•PBS冲洗，5min×3次
•0.3%过氧化氢甲醇溶液，20min(阻断内源性过氧化酶)
•PBS冲洗， 5min×3次
•蛋白酶消化(可省)
•滴加非免疫动物血清，1/5—1/30, 20min
•滴加第一抗体，60min
•PBS冲洗，5min×3次 •滴加第二抗体，60min •PBS冲洗，5min×3次
免疫组化的优点
特异性强 敏感性高 定位准确、形态与功能相结合
免疫组化主要染色方法的原理
主要的技术:免疫荧光技术
免疫金银标记技术 免疫酶标记技术(PAP法) 亲和免疫组化技术(ABC法, SP法)
一、直接法
抗原 ＋酶标Ⅰ抗（特异性抗体）＋底物
用于标记的酶应具备以下几点
① 酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易 于光镜或电镜下观察 ② 所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向 周围组织弥散，影响组织学定位 ③ 较易获得的酶分子，最好有商品出售 ④ 中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存1～2年活性不应改变， ⑤ 酶标过程中，酶与体连结，不能影响二者的活性 ⑥ 被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质
免疫组化定量分析(图象分析)
灰度 长度 面积
免疫组化结果的判断原则
1.必须设立对照 2.抗原表达必须在特定部位 3.阴性结果不能视为不表达 4.免疫组化与HE切片诊断冲突应以HE诊断为准
Ck阳性
•滴加PAP (或 ABC或SP)复合物，60min •PBS冲洗，5min×3次 •显色:新鲜配置的DAB溶液，3~10min
HRP标记抗体的呈色液为0.01%～0.1%H2O2, 0.01%～0.05% DAB, 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)
•自来水冲洗
•复染
•中性树胶固定
HRP 的底物
DAB (3，3-二氨联苯胺) 棕黄色 4-氯-1-萘酚 灰兰色 α-笨脂派若宁 红色
ALP 是以As-Mx为底物，FB/FR为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。
ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等 的ICC染色 GOD 是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、 NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate）0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀
直接法的优点: 方法简单,特异性高。
直接法的缺点: 每一种特异性抗体都需要标记, 敏感性相对较低.
二、间接法
抗原 ＋Ⅰ抗（特异性抗体）＋酶标Ⅱ抗＋底物
间接法的优点:不必标记每一种抗体
敏感性提高3-4倍
三、酶桥法
基本原理 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强 的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在 与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体， 经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶 标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价 连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省第一抗体的用量。
PAP技术
1975年，Kohler 和Milstein 单克隆抗体技术
1981年，Hsu(许世明)
1990年代--现在，
ABC法
SP法，原位杂交，原位PCR
免疫荧光组织(细胞)化学
免疫荧光组织(细胞)化学是根据抗原抗体反应的原理， 先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再
用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织
抗原 ＋Ⅰ抗＋Ⅱ抗＋ Ⅲ抗（酶抗）＋酶＋底物
注意： Ⅰ抗与 Ⅲ抗同源
酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶 活性。 但仍有其不足：
① 在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作 为抗 原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的 亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶 结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法 的敏感性。 ② 第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗 酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的 显示. 为此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，现为 ICC研究中常用的方法之一。
辣根过氧化物酶
（Horseradish peroxidase , HRP）
是最常用的一种酶。HRP广泛分布于植物界，以植物辣根 （西洋山嵛菜）的叶内含量最丰富而得名。它是由无色的
酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，糖占
16%～18（8条糖链分布在HRP分子表面），分子量40kD ， 最适pH5～5.5，最适温度40～45℃； pH4～11，50℃ 以下均较稳定，易溶于水和58%以下 的饱和硫酸铵溶液。
免疫组织化学的原理及其应用
中南大学基础医学院病理学教研室
免疫组化技术的原理
利用抗原与抗体的特异性结合原理
和特殊的标记技术，对组织和细胞 内的特异性抗原和抗体进行定位、 定性或定量检测的一门技术。
免疫组化的发展史
1941年，Coons 免疫荧光技术
1968年，Nakane(中根一惠) 酶标记技术
1974年，Sternberger
A与B有极强的亲和力，一个A结合四个B 抗原 ＋Ⅰ抗＋生物素化Ⅱ抗＋ ABC 复合物＋底物 注意： AB复合物临时配制 B液浓度不能太高
六. SP法
SP：链霉菌抗生物素蛋白 抗原 ＋Ⅰ抗＋生物素化Ⅱ抗＋ SP 复合物＋底物
显色
DAB (3，3-二氨联苯胺) 棕黄色 4-氯-1-萘酚 α-笨脂派若宁 灰兰色 红色
•镜检,观察,记录
可以系列酒精脱水、Hemo-De透明、DPX封固
结果判断
阳性细胞数: －(0%)，+(25%)， ++(50%)，+++(75%) 阳性强度: －，+，++，+++
阳性分布：细胞膜、细胞浆、细胞核
免疫组化半定量分析
考虑阳性强度和细胞比例Fra Baidu bibliotek
参照Bresalier方法综合评分进行半定量分析，阴性为0分 ；弱阳性为1分；阳性为2分；强阳性为3分。平均染色强度 计分IS(intensity score)公式为: IS=∑{(0×F0)+ (1×F1)+ (2×F2)+ (3×F3)}
内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，
利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出
明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细
胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用
定量技术测定含量
免疫荧光技术的不足
需要荧光显微镜
荧光衰减,不能长期保存
定位不准确
免疫组化染色方法选择的原则(五个S原则 )
Specificity Sensitivity Simplicity
Safety
Save of time and money
免疫组化染色步骤
•切片脱蜡至水后
①石蜡切片经二甲苯或Hemo-De脱蜡，下行酒精至水。 ②固定/无固定新鲜组织冰冻切片，室温干燥2h以上