CFSE细胞增殖实验
CFSE染色方法
CFSE染色方法CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）染色方法是一种常用的荧光染色技术，通过这种方法可以追踪和分析细胞的增殖、分裂和活性等生理过程。
该方法利用CFSE荧光染料的特点，通过与细胞内的酯酶作用而形成的CFSE标记，来实现细胞的可见光荧光示踪。
1.准备CFSE染料溶液。
通常使用的浓度为5-10μM的CFSE染料溶液。
可以将CFSE染料溶于合适的溶剂中，如无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）或DMSO（二甲基亚砜）等。
2.处理待染细胞。
将需要染色的细胞分离出来，通常采用离心法获取细胞沉淀物。
接下来，将细胞悬浮液转移到培养基中。
3.CFSE染料标记。
将CFSE染料溶液与待染细胞混合，使其浓度达到适当的标记浓度。
染色时间一般为10-30分钟，但是时间过长或过短都有可能影响染料的有效标记。
染色完毕后，可以通过加入等体积的培养基来停止反应。
4.清洗和处理标记细胞。
将染色细胞通过离心去除无效的染料溶液，然后用新鲜的培养基洗涤细胞，去除未结合的染料。
5.扩增和培养标记细胞。
将清洗干净的细胞转移到含有适当培养基、生长因子和补充物的培养皿中，进行培养和扩增。
6.荧光显微观察。
通过荧光显微镜观察染色细胞，使用合适的荧光滤镜来观察CFSE荧光的发射。
CFSE染色方法的优势是可以追踪不同细胞的活动和增殖过程，如细胞分裂、生长速度等。
此外，该方法简单、可靠、重复性好，并适用于各种类型的细胞。
通过CFSE染色可以实现对细胞的定量和定性分析，对研究细胞增殖、分化、迁移等生命过程有重要意义。
总之，CFSE染色方法可以通过荧光示踪技术追踪和分析细胞的增殖和分裂过程。
通过上述实验步骤，可以成功地进行CFSE染色实验，并通过荧光显微镜观察和分析染色细胞的活动状态。
这项技术在生物学、生物医学和药物研发等领域有着广泛的应用前景。
CFSE细胞增殖实验
C F S E细胞增殖实验集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4. RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat InactivatedFBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/mlanti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。
（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。
2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度 5min离心后弃上清。
3. RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度 5min 离心后弃上清，10mlMACS buffer重悬，计数。
留取105个细胞进行FACS。
（三）磁珠分选nave CD8a+ T细胞cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells.100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells.well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (28 °C).5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells.6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (28 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11. Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer.12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through containingunlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells that passthrough, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and combine with the flow-through from step 3.14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。
CFDA SE (细胞增殖示踪荧光探针) 说明书
CFDA SE (细胞增殖示踪荧光探针) 产品编号产品名称包装C1031 CFDA SE (细胞增殖示踪荧光探针) 5mg产品简介：CFDA SE 的全称为Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester ，是一种近年来被广泛应用的细胞增殖检测用荧光探针，也可以用于细胞的荧光示踪。
基于CFDA SE 荧光标记的细胞增殖检测和[3H]-thymidine 掺入、BrdU 标记获得的检测结果完全一致，但同时可以提供更多的细胞增殖信息。
使用CFDA SE 检测可以提供整个细胞群中有多少比例的细胞分裂了1次、2次或更多次数，同时如果和其它荧光探针联用，可以获取不同分裂次数细胞的其它相关信息。
CFDA-SE 的分子式为C 29H 19NO 11，分子量为557.47，CAS number 为150347-59-4。
CFDA SE 可以通透细胞膜，进入细胞后可以被细胞内的酯酶(esterase)催化分解成CFSE ，CFSE 可以偶发性地(spontaneously)并不可逆地和细胞内蛋白的Lysine 残基或其它氨基发生结合反应，并标记这些蛋白。
在加入荧光探针CFDA SE 后大约24小时，即可充分标记细胞。
被CFDA SE 标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数个月。
CFDA SE 标记细胞的荧光非常均一，比以前使用的其它细胞示踪荧光探针例如PKH26的荧光更加均一，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均匀。
由于CFDA SE 标记细胞的荧光非常均匀和稳定，每分裂一次子代细胞的荧光会减弱一半，这样通过流式细胞仪检测就可以检测出没有分裂的细胞，分裂一次的细胞(1/2的荧光强度)，分离两次的细胞(1/4的荧光强度)，分裂三次的细胞(1/8的荧光强度)以及类似的其它分裂次数的细胞。
采用CFDA SE 通过流式细胞仪检测获得的检测结果参考右图。
每一个峰代表一种分裂次数的细胞，从右至左的峰通常依次为分裂0次、1次、2次、3次等次数的细胞。
FlowJo分析细胞增殖
注册 |登录构建全球华人科学博客圈返回首页 RSS 订阅 帮助 FlowJo 分析细胞增殖已有 521 次阅读 2012-8-21 14:20 |个人分类:FlowJo 使用|系统分类:科研笔记|关键词:细胞增殖，数据分析，FlowJo ，CFSE ，博文FlowJo 分析细胞增殖CFSE 法检测细胞增殖的原理：CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
演示数据：Proliferation tutorial ：实验中所用的荧光染料为eFluor ® 670 Proliferation Tutorial Data.rarFlowJo 分析细胞增殖的步骤：1. 确定要分析的目标细胞群（下图为演示数据中的样本Sample 1）2. 打开增殖分析平台：到“工具”菜单栏中选择“细胞增殖”，打开增殖分析平台，将参数轴中的参数更换为本实验中所采用的APC_A::670Dye ，如下图所示：张千君加为好友 给我留言 打个招呼发送消息FlowJo 中文技术博客分享/u/FlowJo流式细胞技术相关资源分享，流式细胞数据分析，流式技术支持及培训博客首页动态记录博文相册主题分享好友留言板个人资料左边为拟合结果图，右边为各个统计数据，其中：RMS: root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。
3.打开增殖分析平台左下角的“Options”选项选项中各个参数的介绍：#Peaks：增殖峰的数目，默认的最大数目为8个。
随着细胞的分裂，子代细胞所含的CFSE荧光染料的量以2倍的比例递减，分裂到第七代的时候，第七代细胞的CFSE荧光强度只有原代细胞的1/128，可能低于细胞的自发荧光。
CFSE的配制和实验步骤
在使用前仔细阅读说明书-Cellstain-CFSE货号规格C375 1 mg荧光染料CFSE(CFDA-SE)，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞。
其基本原理如下：CFSE是一种带有琥珀酰亚胺(NHS)的荧光染料，可以结合细胞内的蛋白质。
CFSE在结构上将酚羟基部位改造成AM体，所以自身不发荧光，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，进入细胞内的CFSE的AM部位能被细胞内酯酶水解发出绿色荧光。
CFSE的琥珀酰亚胺(NHS)和细胞内蛋白质的氨基部位结合，固定在细胞内，不会漏出细胞外。
CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光最强。
在细胞分裂增殖过程中，CFSE的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。
另外，CFSE标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。
建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、CFSE 的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。
配制试剂：1、从冰箱中取出CFSE试剂，放至室温后再打开。
盛放CFSE的管子开盖前请轻弹管壁几次，让粉末充分落入管底，必要时可采用离心的方法。
2、1000mgCFSE溶解于360ul的DMSO，制成5mM的储存液，于-20℃避光保存，使用时，用无血清DMEM培养液稀释成5μM的工作液备用。
a) DMSO 需要保证新鲜无水，否则将会导致AM体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。
b) 由于CFSE母液遇水极易分解，所以建议分装保存，例如分装成5μl/管。
（方法：分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最后和干燥剂一起用塑料袋密封，≦-20℃冷冻保存。
）c) CFSE 工作液应现配现用，因为CFSE吸水会分解，影响染色效果。
CFSE细胞增殖实验
C F S E细胞增殖实验Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4. RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat InactivatedFBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被取96孔板每孔加入100ul 10ug/mlanti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。
（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。
2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度 5min离心后弃上清。
3. RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度 5min 离心后弃上清，10mlMACS buffer重悬，计数。
留取105个细胞进行FACS。
（三）磁珠分选nave CD8a+ T细胞cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells.100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells.well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (28 °C).5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells.6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (28 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11. Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer.12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through containingunlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. 13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells that passthrough, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and combine with the flow-through from step 3.14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。
CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响
◇实验方法学◇CFSE 示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T 淋巴细胞增殖的影响包晶晶,林海霞,马 璟(上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心,上海 201203)收稿日期:2009-12-30,修回日期:2010-03-18基金项目:科技部“十一五新药创制”重大专项资助课题(No2008ZX093052006);上海市科委企业技术创新团队项目资助(No 08430516200)作者简介:包晶晶(1983-),女,硕士生,E 2mail:jjb19831@g mail .com;马 璟(1963-),女,博士,研究员,博士生导师,通讯作者,Tel:0212508003332106中国图书分类号:R 2332;R 329.24;R 331.125;R 979.1;R 979.5文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2010)06-0828-05摘要:目的 利用定量分析羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu 2orescein diacetate succini m idyl ester,CFSE )时间系列数据的方法研究淋巴细胞细胞增殖动力学及免疫抑制剂对淋巴细胞增殖抑制机制的研究。
方法 环磷酰胺造成小鼠免疫抑制模型,并用CFSE 染料给对照组和给药组动物的淋巴细胞染色,通过数学模型拟合法分析数据。
结果 对照组和给药组淋巴细胞增殖进入第一代分裂的时间分别是27117h 和22188h,每代细胞死亡率分别为20%和40%;进入分裂前的细胞半衰期分别为31153h 和43132h 。
结论 通过数学拟合法对CFSE 数据进行定量分析,探讨药物对淋巴细胞增殖影响的机制,该实验中的药物环磷酰胺抑制淋巴细胞增殖的方式可能是使细胞增殖时每代细胞的死亡率增加所致。
关键词:CFSE;定量分析;数学拟合;流式细胞仪;淋巴细胞增殖;环磷酰胺 传统的测定淋巴细胞增殖的方法只能通过细胞数量的变化来反映细胞增殖的的变化,不能更深入的洞察细胞增殖是如何被改变的。
基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立
本文受国家973计划(2005CB523202)资助作者简介:赵和平(1983年-),男,硕士,主要从事动物病毒疫苗效力评价研究;通讯作者及指导教师:仇华吉(1967年-),男,博士,研究员,主要从事分子病毒学与免疫学研究,E mail:huajiqiu@ 。
免疫学技术与方法基于CFSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立赵和平 孙 元 袁 远 仇华吉(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,哈尔滨150001)中国图书分类号 S852 文献标识码 A 文章编号 1000 484X(2009)02 0159 05[摘 要] 目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。
方法:用终浓度分别为3、6、9和12 g/ml 的刀豆素A(Con A)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(C FSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。
结果:不同浓度ConA 刺激后,猪PB MC 增殖能力不同,Con A 浓度为6 g/ml 时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT 试验也获得相似结果。
对PB MC 刺激5天后进行分析相对较好。
结论:建立了一种基于活细胞染料C FSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。
[关键词] 猪淋巴细胞;细胞免疫;C FSE 染色;淋巴细胞增殖试验A method for detecting porcine lymphocyte proliferation based on CFSE stainingZ HAO He Ping ,SU N Yuan ,YU AN Yuan,QIUHua Ji.Division o f Swine Infectious Diseases,Harbin Veterinary Research Institute,The Chinese Academy o f Agricultural Sciences,Harbin 150001,China[Abstract] Objective:To develop a method to assess porci ne cell mediated immunity (CMI).Methods:PBMCs from pigs were stained wi th intracellular fluorescen t dye,CFSE,and stimulated wi th varied amounts of ConA (0,3,6,9,and 12 g/mL),and plated in 3replicate cul tures for 3,5,or 7days.Then CD4+cell and CD8+cells were labeled with fluorescent antibodies.Data were acquired using flow cytometry (FC M )and analyzed using CellQuest software.Results:Cell division indices of porci ne CD4+and CD8+cells were different when porcine PB MCs were sti mulated with different doses of ConA.The results were similar to those obtained by MTT method.Op timal results were obtained when porcine lymphocytes were s timulated for 5days.C onclusion:The CFSE based method developed in this study can be used to analyze the proliferation of di fferent cell subsets si multaneonsly.[Key w ords] Porcine lymphocytes;Cell mediated immunity;CFSE staining;Lymphocyte proliferation目前对我国养猪业危害最大的主要是一些病毒性疾病,这些疫病主要通过疫苗接种手段来控制。
CFSE增殖实验
CFSE增殖实验-江英骙PBMC增殖染色分2天第一天1.分PBMC，培养基为R10+双抗（100: 1），将细胞从15ml离心管转移至培养瓶中（大概5ml的培养基，不要超过培养瓶的线），37度孵箱培养1天，使单核细胞贴壁；2.CD3包被96孔平底板（eBioscience, functional的抗体，浓度为1mg/ml的CD3），PBS每1ml中加5ul的CD3，然后每孔铺100ul，用封口膜封板，避免污染，可用包装纸再包起来，4度冰箱过夜。
第二天1.收PBMC，将培养瓶中的细胞悬液转移至15ml离心管中（贴壁细胞不要）。
先计数，离心，1800rpm，10min，弃上清，用预热的PBS（37度水浴锅提前预热无菌PBS）洗一遍细胞，离心，1800rpm，10min，弃上清，将细胞打散（用手弹）；2.CFSE应用预热至37度的PBS 调整至工作浓度（1ul的CFSE ，用预热的PBS加至终体积为2ml），每10的7次细胞加1ml；（15ml离心管）3.细胞管中加入37度的CFSE 1ml ，混匀，并将试管壁反复吹洗（避免粘于试管壁的细胞未染色或染色量少造成染色不均匀）；4.37度水浴锅避光孵育15min，中间至少震荡一次（用手弹）；5.直接离心，1800rpm，10min；6.加入R10+双抗（加入量是之前加入CFSE体积的5倍以上），5到10ml重悬，37度孵箱孵育5min；7.离心，1800rpm，10min；8.再洗一遍，重复步骤79.R10+双抗重悬，计数；10.调整细胞浓度至1*10^6/ml，每孔加入细胞100ul11.每孔加入新鲜配制的培养基100ul（R10+双抗，1ml加入CD28 5ul），每孔的终体积为200ul；（此时的培养基不用37度预热）12.放入大细胞房培养7天，收细胞；13.可染CD3，CD4(注意做blank对照)，进行流式分析（CFSE为FL1通道，与FITC为一个通道）。
CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化
素（ Ｐ Ｈ Ａ） 和佛 波酯 （ Ｐ ＭＡ） 培养７ ２ ｈ对淋 巴细胞分裂与增殖 的影 响． 并采用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法检 测不 同刺激剂
对淋 巴细胞上 清 Ｉ Ｆ Ｎ ￣ ／ 质量浓度的影响． ０ ． １ ２ ５ ｍＬ的抗 Ｃ Ｄ ３ ／ ２ ８抗体和 ５或 １ Ｏ ｇ ／ ｍ Ｌ的 Ｐ Ｈ Ａ 可
ｏ ｆ Ｎｏ ｎ—Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ｌ ａ Ｄｒ ｕ ｇ Ｍｅ ｔ ａ ｂ ｏ ｌ ｉ ｓ ｍ ｎｄ ａ Ｐ Ｋ ／Ｐ Ｄ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ，Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｍａ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ
中图分 类号 ： Ｒ ４ ４ ６
文献标识码 ： Ａ
文章 编号 ： １ ６ ７ ２— ０ ９ ４ ６ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ２— ０ １ ２ ９— ０ ６
ＣＦＳ Ｅ— － ｌ ａ ｂ ｅ ｌ ｅ ｄ ｐｒ ｏ ｌ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｓ ｆ ｏ ｒ ａ ｓ ｓ ｅ ｓ ｓ ｍｅ ｎｔ ｏ ｆ Ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｆ ｕｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎｄ ｕｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｄ ｉ ｆｅ ｒ ｅ ｎｔ ｓ ｔ ｉ ｍｕ ｌ ａ ｎｔ ｓ
Ｖ ｏ １ ． ３ ３ Ｎ ｏ ． ２
Ａ ｐ ｒ ． ２ ０ １ ７
Ｃ Ｆ Ｓ Ｅ法 检 测 刺 激 剂 对 淋 巴细胞 增 殖 与活 化
薛妮娜 坤 ， 董 凯 ， 来芳芳 ， 黄 蕊 ， 陈晓光ｈ
（ １ ．中国医学科学 院药物研究所 ， 天然药物活性物 质与功能 国家重点实验室／ 创新药物非Ｉ 临床药物 代谢及 Ｐ Ｋ ／ Ｐ Ｄ研究北京市重点实验 室 ， 北京 １ ０ ０ ０ ５ ０； ２ ．天津红 日药业股份有 限公 司 ， 天津 ３ ０ １ ７ ０ ０ ）
CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化
CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【摘要】研究不同刺激剂对人外周血淋巴细胞增殖与活化的影响.采用密度离心法分离人外周血淋巴细胞,并采用1μmol/L 的CFSE进行标记,通过流式细胞术技术检测刺激剂抗CD3/28抗体、植物血凝素(PHA)和佛波酯(PMA)培养72 h对淋巴细胞分裂与增殖的影响.并采用ELISA法检测不同刺激剂对淋巴细胞上清IFNγ质量浓度的影响.0.125 μg/mL的抗CD3/28抗体和5或10 μg/mL的PHA可以显著诱导CFSE绿色荧光逐渐递,形成类似"五指峰"样图谱,说明这两者具有很强的诱导淋巴细胞分裂与增殖的作用.相比之下,单用PMA促进淋巴细胞分裂与增殖的作用较弱.此外,抗CD3/28抗体、PHA和PMA均可增加淋巴细胞IFNγ的分泌,但其作用强度如下:抗CD3/28抗体>PHA>PMA.采用CFSE标记法检测淋巴细胞增殖的实验,得出抗CD3/28抗体和PHA是高效的淋巴细胞活化刺激剂,而且最佳质量浓度分别为0.125 μg/mL和10 μg/mL.%The aim of this pa per is to investigate the effect of different stimulants on the proliferation and activation of human peripheral blood lymphocytes. Human peripheral blood lymphocytes were isolated by density centrifugation and labeled with CFSE with the final concentratio n of 1μmol/L. Flow cytometry analysis was used to detect the division and proliferation of lymphocytes after administration of anti-CD3/28 antibody, phytohemagglutinin (PHA) and phorbol ester (PMA) for 72 h. In addition, IFNγ content that reflects the acti vation of T lymphocytes was detected by ELISA method.And found that 0.125μg/mL of anti-CD3/28 antibody and 5 or 10μg/mL of PHA could induce the gradual reduction of green fluorescence, with a "Multi-peak" pattern inflow cytometry analysis, the results indicated that both anti-CD3/28 antibody and PHA are potential had strong stimulants for lymphocyte division and proliferation. In comparison, the role of PMA alone in promoting lymphocyte division and proliferation was weak. Furthermore, anti-CD3/28 antibody, PHA and PMA almost could increase the IFNγ secretion from lymphocytes. However, anti-CD3/28 antibody was the most stimulator,PHA, and PMA was the weakest agent for stimulating the production of IFNγ in lymphocytes. In the CFSE-based proliferative assays for assessment of T cell function, this paper concluded that both anti-CD3/28 antibody and PHA were effective stimulants for the proliferation and activation of lymphocytes, with the optimal concentrations of 0.125 μg/mL and 10 μg/mL, respectively.【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(033)002【总页数】6页(P129-134)【关键词】淋巴细胞增殖;CFSE;干扰素γ;流式细胞术【作者】薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【作者单位】中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R446肿瘤免疫治疗己成为继手术、化疗和放疗之后的第四种常用的肿瘤治疗方法.肿瘤免疫治疗是通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫能力，从而控制和杀灭肿瘤细胞.而效应T淋巴细胞是诱发有效的抗肿瘤免疫反应的主要执行者，行使对肿瘤细胞的识别和消灭作用[1].在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞通过上调一些免疫检查点分子的配体，与T淋巴细胞表面这些共抑制性受体(PD1、CTLA4、LAG3等)相互作用，从而抑制T细胞的增殖与活化，形成肿瘤免疫逃逸微环境[2-3].目前，绝大多数上市或处于临床研究阶段的抗肿瘤免疫药物都是通过抑制T细胞的负性调控信号，通过激活T淋巴细胞的增殖和活性，强化T细胞的免疫应答，最终达到抵御肿瘤细胞增长的目的.因此，T淋巴细胞的增殖与活性水平的检测是细胞免疫功能研究的常用方法，也是目前抗肿瘤免疫药物研发中一个重要的考察指标[4].氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法被广泛用于淋巴细胞增殖的检测.但是其需要使用放射性同位素标记，具有潜在的污染，并且不容易大批量操作.其次，还有一些研究者采用MTT或MTS的方法检测淋巴细胞增殖.虽然MTT或MTS的操作方法相对简单，但灵敏性不高，且此方法不适合检测一些具有氧化还原性作用的药物，这类药物可直接与MTT反应，造成假阳性.此外，3H-TdR掺入法和MTT/MTS法均是以细胞的数量来反应增殖的变化，不能反应细胞的分裂情况，且无法测定不同亚群淋巴细胞的增殖情况[5-6].羧基荧光素乙酰乙酸(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester, CFSE)染色是一种有效的检测淋巴细胞分裂与增殖的方法.CFSE可穿过细胞膜，不可逆地与细胞内的氨基共价结合偶联到细胞内蛋白.在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记的荧光可平均分配到两个子代细胞中，出现连续的荧光强度递减现象，在流式细胞术检测过程中出现类似“五指峰”的特征[7-8].抗CD3/28抗体、刀豆蛋白A(ConA)、植物血凝素(PHA)佛波酯(PMA)可刺激小鼠脾或人外周血T淋巴细胞增殖.目前，文献中尚未对这些刺激剂促进T淋巴细胞增殖的强度进行比较.而且报道的这些刺激剂的最佳有效剂量也不尽相同.因此，本文采用CFSE标记法检测不同刺激剂诱导人外周血淋巴细胞分裂与增殖的活性，为验证肿瘤免疫药物的活性提供有效的评价方法.1.1 全血健康志愿者的抗凝血购自中国食品药品检定研究院.1.2 主要试剂人外周血淋巴细胞提取分离液购自达科为生物技术有限公司.CFSE、PMA、和PHA购自Sigma公司，人源抗CD3、CD28抗体购自美国Miltenyi?Biotec公司.人源IFN γ 的ELISA检测试剂盒购自cloud-clone公司.RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国GIBCO公司.1.3 主要仪器FACSVerse流式细胞仪为美国BD公司产品，Synergy H1多功能酶标仪为美国Bio-Tek公司产品，CO2培养箱为日本三洋公司产品，冷冻离心机为美国Sigma 公司产品.2.1 淋巴细胞的制备将健康志愿者的抗凝血与PBS混合，再缓慢加至淋巴细胞分离液中(这三者的终体积比例为1∶1∶1)，室温，800 r/min离心30 min.小心吸取中间的一层薄而致密的白膜(淋巴细胞层)至另一层离心管中，用PBS重悬洗涤2次，计数，调整细胞浓度为1×107/mL.2.2 CFSE标记淋巴细胞在上述淋巴细胞悬液中加入CFSE染液(CFSE，终浓度为1 μmol/L)，37 ℃避光孵育10 min，每5 min混匀细胞.加入预冷的2 mL灭活牛血清冰上终止2 min，1 500 r/min离心5 min，用预冷的含10%灭活胎牛血清的PBS洗涤2次.离心，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，计数，将细胞调整为3×106/mL，加入96孔圆底板，每孔100 μL，洗涤及离心过程中注意避光.2.3 流式细胞术检测淋巴细胞增殖活性向上述接种至96孔圆底板的淋巴细胞中分别加入100 μL含不同剂量的刺激剂的RPMI1640完全培养基：抗CD3/28抗体(终质量浓度：0.125、0.5、1、1.5μg/mL)、PHA(终质量浓度：1、5、10 μg/mL)和PMA(终质量浓度：1、5、10 ng/mL).每组实验做三个平行孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续孵育72h.离心，收集细胞上清，冻于-80 ℃冰箱保存.将细胞用预冷PBS洗涤2次，并用200 μL PBS重悬，采用流式细胞检测仪(BD FACS Verse)检测淋巴细胞的分裂和增殖情况，并采用Flowjo 7.6软件计算淋巴细胞增殖情况(CFSE荧光强度减低的细胞百分比)和分裂指数(CFSE荧光强度减低的细胞百分比与CFSE荧光强度不变的细胞百分比的比值).2.4 ELISA法检测淋巴细胞上清IFNγ质量浓度取上述条件下淋巴细胞上清液，采用ELISA法检测IFNγ的质量浓度.操作步骤参照试剂盒说明书.简要步骤如下：1)加入100 μL倍比稀释的人源IFNγ标准品及淋巴细胞上清原液，室温静置1 h；2)充分弃上清，分别加入1∶100稀释的IFNγ的一抗，室温静置1 h；3)弃上清，洗涤三次后，加入1∶100稀释后的IFNγ的二抗，室温静置30 min；4)弃上清，洗涤5次后，加90 μL底物(TMB)显色，室温避光放置15 min；5)加50 μL的硫酸终止反应；6)酶标仪450 nmol/L下检测淋巴细胞培养上清液中IFNγ的含量.2.5 统计分析数据采用Mean±SD表示，用SPSS17.0软件对实验数据进行显著性分析，P≤0.05具有统计学意义.3.1 CFSE法淋巴细胞增殖实验中细胞门的确定采用Flowjo 7.6软件对淋巴细胞分裂与增殖进行分析.根据前向散射角(FSC)和侧向角散射(SSC)显示图，发现排除了细胞碎片群外，在正常条件下，淋巴细胞主要分布为左下群，均一度较好的一簇细胞群.在接受不同刺激剂活化后，左下的淋巴细胞群开始往右上方移动，且出现比较散在的细胞群.根据流式细胞术的原理，我们认为在刺激剂活化淋巴细胞后，淋巴细胞出现不同程度的分裂和增殖，其细胞大小和均一度都发生改变，从而显示在右上方散在的细胞群.我们把原始淋巴细胞命名为R1门，刺激剂活化后的淋巴细胞命名为R2门(如图1(A)～(B)所示).且在正常条件下，R1门的细胞具有强的CFSE染色荧光(单峰)；在刺激剂作用下，R2门内增殖的淋巴细胞出现逐渐递减的CFSE染色荧光(多峰)(如图1(C)～(D)所示).3.2 抗CD3/28抗体对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响抗CD3和CD28抗体分别在体外模拟特异性T淋巴细胞活化的第一信号和第二信号，是T淋巴细胞活化常用的刺激剂.我们采用CFSE染色，通过流式细胞术检测抗CD3和CD28抗体对淋巴细胞增殖的影响.如图2(A)～(B)所示，抗CD3/28抗体可以强效地诱导绿色荧光强度逐渐递减，形成类似“五指峰”样图谱，说明抗CD3/28抗体可以显著促进淋巴细胞分裂和增殖.且在0.125～1.5 μg/mL剂量范围内，抗CD3/28抗体诱导的“五指峰”图几乎重叠.对其增殖指数和分裂指数进行统计，如图2(C)～(D)所示，0.125～1.5 μg/mL 的抗CD3/28抗体诱导淋巴细胞增殖百分比基本可达到75%(P≤0.001)，其诱导淋巴细胞分裂指数可达3倍(P≤0.001).但随着抗CD3/28抗体质量浓度的增加，1.5 μg/mL的抗CD3/28抗体诱导淋巴细胞分裂指数反而有所下降.因此，在诱导淋巴细胞增殖实验中，选用终质量浓度为0.125 μg/mL的抗CD3/28抗体即可.3.3 PHA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PHA是一种有丝分裂原，主要用于激活淋巴细胞.对PHA的不同质量浓度进行分析表明，PHA可以剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖.1 μg/mL的PHA促进淋巴细胞增殖和分裂指数分别为40.9%和0.69倍.当质量浓度为10 μg/mL 时，PHA促进淋巴细胞增殖的效果最为明显，淋巴细胞增殖和分裂指数为85.7%和4.7倍(如图3所示).3.4 PMA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PMA是PKC信号的激活物，PKC信号在T淋巴细胞活化中占据重要地位.所以PMA也是T淋巴细胞活化常用刺激剂之一.对PMA的不同质量浓度进行分析表明，虽然PHA也可剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖，但其诱导淋巴细胞增殖能力较弱，5 ng/mL和10 ng/mL的PMA诱导淋巴细胞增殖指数才到达20%，此剂量下的分裂指数才达到0.2倍(如图4所示).3.5 不同刺激剂对淋巴细胞IFNγ分泌的影响收集不同刺激剂培养淋巴细胞72h后的上清液，采用ELISA法检测IFNγ的质量浓度.如图5所示，0.125 μg/mL抗CD3/28抗体、10 μg/mL PHA和10 ng/mL PMA均可显著增加淋巴细胞IFNγ的分泌(P≤0.001).但其增加淋巴细胞IFNγ分泌量的顺序是抗CD3/28抗体>PHA>PMA.淋巴细胞增殖实验是评价机体免疫功能的常用方法.CFSE染色法是近年来广泛代替3H-TdR掺入法和MTT显色法的一种快速、无污染的检测淋巴细胞增殖的方法.CFSE染色结合流式细胞术技术能在不同淋巴细胞亚群及单个细胞水平上动态的分析淋巴细胞增殖情况[9-11].小分子药物单独作用在体外几乎不刺激淋巴细胞增殖，需要在淋巴细胞活化的基础上，进一步评价小分子药物调节淋巴细胞增殖的作用.因此，采用CFSE法，寻找不同刺激剂活化淋巴细胞的最佳剂量，是评价调节淋巴细胞增殖的小分子药物的必要前提.本实验采用人外周血提取获得淋巴细胞，在不同剂量的抗CD3/28抗体、PHA和PMA作用下，观察淋巴细胞的增殖和分裂指数.实验中发现，比以往报道用量更低的抗CD3/28抗体(0.12 5μg/mL)即可高效的刺激T淋巴细胞的分裂与增殖[12].5 μg/mL的PHA促进淋巴细胞增殖和分裂指数分别为75%和3倍，这与Fulcher D等研究者的报道一致[7].由于PHA可以剂量依赖性地增加淋巴细胞增殖与分裂，可根据需要活化的淋巴细胞的强弱选择合适的PHA的剂量，同时，PHA 又便宜.因此，PHA可用于调节淋巴细胞增殖的化合物的大量筛选.相比之下，PKC 信号的激动剂PMA促进淋巴细胞增殖的能力较弱.可能是因为T淋巴细胞的活化需要PKC信号和Ca2+信号共同参与，因此单一的PMA对淋巴细胞的活化作用较弱，需要与离子霉素联用(Ca2+激动剂)可能对显示出更强的促进淋巴细胞增殖的活性.这与Castagna M等人的研究相一致[13].IFNγ是T淋巴细胞活化的重要指标[14-15].实验发现抗CD3/28抗体、PHA和PMA都能显著增加淋巴细胞IFNγ的分泌，也证明了这三类刺激剂对T淋巴细胞的活化作用.并且这三种刺激剂增加IFNγ的分泌的程度与其诱导淋巴细胞分裂与增殖的程度相对应.后续将进一步研究这些刺激剂对不同亚群T淋巴细胞的促增殖作用.【相关文献】[1] LANITIS E, POUSSIN M, KLATTENHOFF A W, et al. Chimeric antigen receptor T Cells with dissociated signaling domains exhibit focused antitumor activity with reduced potential for toxicity in vivo [J]. Cancer immunology research, 2013, 1(1): 43-53.[2] YAO S, ZHU Y, CHEN L. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation [J]. Nature reviews Drug discovery, 2013, 12(2): 130-146.[3] NIRSCHL C J, DRAKE C G. Molecular pathways: coexpression of immune checkpoint molecules: signaling pathways and implications for cancer immunotherapy [J]. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2013, 19(18): 4917-4924.[4] BOCHAROV G, LUZYANINA T, CUPOVIC J, et al. Asymmetry of Cell Division in CFSE-Based Lymphocyte Proliferation Analysis [J]. Front Immunol, 2013, 4(264): 1-7.[5] 王玲, 王宏, 刘越坚, 等. 利用CFSE标记检测CD8+淋巴细胞增殖[J]. 大连医科大学学报, 2004, 26(4): 262-264.[6] 季宇彬, 冯小燕, 高世勇, 等. 甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版, 2008, 24(4): 385-388.[7] FULCHER D, WONG S. Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory[J]. Immunol Cell Biol, 1999, 77(6): 559-564.[8] POPMA S H, KRASINSKAS A M, MCLEAN A D, et al. Immune monitoring in xenotransplantation: the multiparameter flow cytometric mixed lymphocyte culture assay [J]. Cytometry, 2000, 42(5): 277-283.[9] VENKEN K, THEWISSEN M, HELLINGS N, et al. A CFSE based assay for measuringCD4+CD25+ regulatory T cell mediated suppression of auto-antigen specific and polyclonal T cell responses [J]. J Immunol Methods, 2007, 322(1-2): 1-11.[10] GANUSOV V V, MILUTINOVIC D, DE BOER R J. IL-2 regulates expansion of CD4+ T cell populations by affecting cell death: insights from modeling CFSE data[J]. J Immunol, 2007,179(2): 950-957.[11] 包晶晶, 林海霞, 马璟, 等. CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响[J]. 中国药理学通报, 2010, 26(6): 828-831.[12] THOMAS A K, MAUS M V, SHALABY W S, et al. A cell-based artificial antigen-presenting cell coated with anti-CD3 and CD28 antibodies enables rapid expansion and long-term growth of CD4 T lymphocytes [J]. Clin Immunol, 2002, 105(3): 259-272. [13] CASTAGNA M, TAKAI Y, KAIBUCHI K, et al. Direct activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase by tumor-promoting phorbol esters [J]. J Biol Chem, 1982, 257(13): 7847-7851.[14] 严俊, 姚堃, 周瑶玺. T细胞活化、活化信号和IFN-γ诱生的关系研究[J].免疫学杂志, 1992,8(2): 95-98.[15] MCNANARA M J, HILGART-MARTISZUS I, BARRAGAN E D M, et al. Interferon-gamma production by peripheral lymphocytes predicts survival of tumor-bearing mice receiving dual PD-1/CTLA-4 blockade [J]. Cancer Immunol Res, 2016, 4(8): 650-657.。
cfse法检测细胞增殖的原理
cfse法检测细胞增殖的原理嗨，宝子！今天咱们来唠唠CFSE法检测细胞增殖这个超有趣的事儿。
CFSE呢，它的全名有点长，不过咱不用纠结那个。
这CFSE就像是一个超级小的彩色标签，专门给细胞准备的。
细胞啊，就像一个个小小的生命精灵，在我们身体里或者在实验室的培养皿里忙活着它们自己的事儿。
CFSE这个小标签是怎么和细胞增殖联系起来的呢？你想啊，细胞要增殖的时候，那就是一个变两个，两个变四个这样的过程。
CFSE这个聪明的小标签呢，它可以很轻松地进入细胞内部。
一旦进入细胞，它就像是和细胞签订了一个特殊的契约。
当细胞还没有开始增殖的时候，每个细胞都带着自己的CFSE小标签，这个小标签会发出一种特定的荧光信号。
就像每个细胞都戴着一个独特的会发光的小帽子一样，特别酷。
然后呢，细胞开始增殖啦。
这时候可就好玩儿了。
在细胞分裂的过程中，这个CFSE小标签可不是一成不变的哦。
它会像分蛋糕一样，平均地分配到新产生的细胞里面。
比如说，原来一个细胞里有一份CFSE，那分裂成两个细胞的时候呢，这两个新细胞就各自带着半份CFSE。
随着细胞不断地增殖，每分裂一次，细胞里面的CFSE就会被再分一次。
这样一来，经过几次分裂之后，细胞里面的CFSE就越来越少啦。
那这个和检测细胞增殖有啥关系呢？关系可大了去了。
因为CFSE的量和它发出的荧光强度是有关系的。
一开始，细胞带着满满的CFSE，荧光就很强。
随着细胞增殖，CFSE被不断地分来分去，荧光就会越来越弱。
我们通过专门的仪器去检测这些细胞的荧光强度，就能够知道细胞增殖了多少次啦。
这就好比是在数一群小动物的繁殖情况。
每只小动物出生的时候都戴着一个特殊的铃铛，随着它们不断繁殖后代，铃铛就会被分成更小的部分给新出生的小动物。
我们只要看看铃铛的大小或者铃铛发出声音的大小（就像CFSE的荧光强度），就能知道小动物繁殖了多少代了。
而且呢，CFSE法特别的精准。
它就像一个超级细心的小侦探，不会放过任何一个细胞增殖的小细节。
细胞增殖实验实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞增殖的基本原理和方法。
2. 观察细胞在不同条件下增殖情况，分析影响细胞增殖的因素。
3. 提高细胞培养技术操作水平。
二、实验原理细胞增殖是指细胞通过分裂和生长，使细胞数目增加的过程。
细胞增殖是生命活动的基本特征之一，对于生物学、医学等领域的研究具有重要意义。
本实验通过观察细胞在不同条件下的增殖情况，分析影响细胞增殖的因素，为后续研究提供基础。
三、实验材料1. 人类肺癌细胞株（A549）2. 细胞培养液：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素3. 试剂：胰蛋白酶、CCK-8试剂盒、0.25%戊二醛4. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、酶标仪、离心机、超净工作台等四、实验方法1. 细胞培养：将A549细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后进行传代培养。
2. 细胞增殖实验：（1）实验分组：将细胞分为实验组和对照组，实验组添加不同浓度的药物，对照组添加等体积的生理盐水。
（2）细胞处理：将实验组和对照组细胞分别加入相应药物，处理时间为24小时。
（3）细胞计数：采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况，计算细胞增殖抑制率。
（4）数据统计分析：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析。
3. 影响细胞增殖的因素：（1）温度：将细胞分别置于37℃、42℃、25℃的培养箱中培养，观察细胞增殖情况。
（2）CO2浓度：将细胞分别置于5%CO2、10%CO2、0%CO2的培养箱中培养，观察细胞增殖情况。
（3）血清浓度：将细胞分别接种于含有0%、10%、20%胎牛血清的培养基中，观察细胞增殖情况。
五、实验结果1. 细胞增殖实验：（1）实验组细胞增殖抑制率随着药物浓度的增加而升高。
（2）对照组细胞增殖抑制率为0。
2. 影响细胞增殖的因素：（1）温度：细胞在37℃培养箱中增殖情况最好，42℃和25℃培养箱中细胞增殖情况较差。
（2）CO2浓度：细胞在5%CO2培养箱中增殖情况最好，10%CO2和0%CO2培养箱中细胞增殖情况较差。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告随着肿瘤研究的不断深入，传统的体内实验已经难以满足对肿瘤细胞增殖的准确检测，因此体外实验成为了肿瘤学研究的重要手段之一。
体外实验可以通过模拟人体内不同的环境来检测细胞在不同条件下的生长和增殖情况，以评估化合物或药物对细胞增殖的影响。
本文将从体外检测肿瘤细胞增殖的方法、优点及缺点、应用以及发展趋势等方面进行综述。
一、体外检测方法1. MTT法MTT法是一种较为简单、高通量的体外检测肿瘤细胞增殖的方法。
MTT试剂被还原为紫色的甲基溴化四唑，可通过分光光度计读取细胞数量和代谢活性，进而评估细胞增殖。
该方法适用于多种肿瘤细胞，包括淋巴瘤、乳腺癌、慢性髓性白血病等。
2. SRB法SRB法是一种将孵育细胞暴露于固定试剂（如三甲基硫醇盐）的体外细胞增殖测试方法。
三甲基硫醇盐会在细胞内与酸性物质结合，形成具有吸光度的紫色络合物。
该方法通常测量细胞种植密度、药物浓度和孵育时间等参数对细胞增殖的影响。
3. CFSE染色法CFSE染色法是一种流式细胞术，它使用一种绿色荧光素酰氯，可标记细胞的染色体。
当染色的细胞进入体内时，它们在短时间内通过复制遗传物质而散发出增加的荧光。
该方法适用于检测细胞核分裂、增殖速度和细胞寿命等方面的变化。
二、优点与缺点1. 优点（1）能评估化合物或药物对肿瘤细胞生长的影响，但不需进行动物实验。
（2）与体内实验相比，体外实验具有时间和成本优势。
（3）体外实验结果容易重复，从而提高结果的可靠性。
2. 缺点（1）不如体内实验直接评估药物治疗的效果。
（2）细胞生长环境和体内情况不同，在实验室条件下模拟体内情况会受到一些限制。
（3）细胞在体外环境下不可避免地发生异常。
三、应用体外实验在肿瘤学研究中被广泛应用，主要包括以下方面：1. 药物筛选体外实验可用于筛选具有抗肿瘤活性的化合物或药物，以确定哪些化合物或药物更有可能进入进一步的临床试验。
2. 分子机制研究体外实验可以通过检测肿瘤细胞的生长速率、形态和分化来验证分子机制假设。
CFSE细胞增殖实验
准备：1.20ml 预冷5%FBS(HI)-PBS2.50ml 预冷MACS buffer3.70um滤网4.2.5ml RBC lysis5.LS column6.50ml 37度预热PBS7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat InactivatedFBS+10 mM HEPES+1 mM penicilline streptomycin+ 50 mM2-mercaptoethanol)（一）CD3抗体包被?取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml?anti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。
（二）淋巴细胞获取1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。
2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度5min离心后弃上清。
3.2.5ml RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度5min 离心后弃上清，10ml?MACS buffer重悬，计数。
留取105个细胞进行FACS。
（三）磁珠分选na?ve CD8a+ T细胞1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. ?2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells. ?3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells. ?4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (2?8 °C). ?5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells. ?6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (2?8 °C).8.Wash cells by adding 10ml of MACS buffer per 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS buffer.10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.11.Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer. ?12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through containingunlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction. ?13.Wash column with 3 mL of MACS buffer. Collect unlabeled cells that passthrough, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and combine with the flow-through from step 3. ?14.Determine cell number. 留取105个细胞进行FACS。
流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应_王敏
生, 主要从事细胞免疫 学方面的 研究。现在安 徽淮北市 疾病控 制中 心 工 作, 淮 北 235000。( Tel ) 0561 3335620; ( E mail) lrk lv@ sina. com * 通讯作者
图 1 PBMC 刺激后不同 T 细胞亚群扩增的比例 Fig 1 Proportion of expanded T cell subsets activated by PHA
and CD3mAb
a1, a2)
PBMC stimulated with PHA for 5 d; b1, b2) PBM C st imulated with CD3 mAb for 5 d; c1, c2) PBMC st imulat ed wit h Mtb Ag for 8 d 图 2 不同刺激剂激活 PBMC 后 T 细胞各亚群细胞的扩增比例
WANG Min, ZHANG Lin jie, HE Jin sheng, GE Xiao song, CHEN Yong, LI Bai qing( Department of Immunology , Anhui Medical University , Hef ei 230001, China)
69pbmc经phacd3mab或mtb2ag激活后增殖不同天数用检测cd分子或tcr的荧光抗体染色后在流式细胞仪上测定获得数据再用modfit软件中的增殖分析模块进行分析可得到cd3细胞的增殖动力模型即可计算出大量相关指数包括各代细胞所占百分率增殖指proliferationindexpi即增殖后的细胞总数与增殖前的细胞总数的比值图
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1.20ml预冷5%FBS(HI)-PBS
2.50ml 预冷MACS buffer
3.70um滤网
4.2.5ml RBC lysis
5.LS column
6.50ml 37度预热PBS
7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat
Inactivated FBS+10 mM HEPES+1 mMpenicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol)
（一）CD3抗体包被
取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml anti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。
（二）淋巴细胞获取
1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。
2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度5min离心后弃上清。
3.2.5ml RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。
4.500g 4度5min 离心后弃上清，10ml MACS buffer重悬，计数。
留取105
个细胞进行FACS。
（三）磁珠分选naïve CD8a+ T细胞
1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.
2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells.
3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells.
4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (2−8 °C).
5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells.
6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells.
7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (2−8 °C).
8.Wash cells by adding 10ml of MACS bufferper 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely.
9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS bu ffer.
10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.
11.Prepare column by rinsing with 3 mL of MACS buffer.
12.Apply cell suspension onto the column. Collect flow-through
containing unlabeled cells, representing the enriched naive CD8a+ T cell fraction.
13.Wash column with 3 mL ofMACS buffer. Collect unlabeled cells that
pass through, representing the enriched naive CD8a+ T cells, and
combine with the flow-through from step 3.
14.Determine cell number.留取105个细胞进行FACS。
（四）CFSE预处理
1. Remove supernatant from the cell pellet.
2. Add CellTrace™ CFSE (1:1000 dilution in PBS) staining solution and gently resuspend the cells to 1*106/ml.
3. Incubate at 37°C for 20 minutes, protected from light.
4. Add 4 volumes complete culture medium and mix.
5. Incubate at 37°C for 5 minutes.
6. Pellet the cells and remove the supernatant.
7. Resuspend the cell pellet in fresh, pre-warmed complete culture mediumto 1*107/ml.
8.均分两份，其中一份加入2ug/ml anti-CD28，一份不加抗体。
9.包被板使用PBS洗涤一次，按105 -106个细胞／孔梯度接种，培养3天后上机。