酶工程重点

酶工程第一章：绪论1、基因工程（genetic engineering ）以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

2、细胞工程(Cell engineering)应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。

3、发酵工程(Fermentation Engineering)指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。

发酵工程的内容包括菌种的选育、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。

4、酶工程（Enzyme Engineering）将酶或者微生物细胞，动植物细胞，细胞器等在一定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。

它包括酶制剂的制备,酶的固定化,酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。

酶工程的应用，主要集中于食品工业，轻工业以及医药工业中。

5、基因工程：DNA 细胞工程：细胞水平酶工程：蛋白质发酵工程：微生物工业6、1777年，意大利物理学家斯巴兰沙尼（Spallanzani）的山鹰实验。

1822年，美国外科医生博蒙特（Beaumont）研究食物在胃里的消化。

19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。

1926年,美国康乃尔大学的“独臂学者”Sumner（萨姆纳）博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质。

1890年，Fisher——锁钥学说。

1902年，Henri——中间产物学说。

1913年，Michaelis 和Menten——米氏学说。

1958年，Koshland——诱导契合学说。

1960年，Jacob 和Monod——操纵子学说。

1982年，Thomas R.Cech等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶—Ribozyme。

1983年，Altman等人发现核糖核酸酶P的RNA组分具有加工tRNA前体的催化功能。

而RNase P中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构象的作用。

1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶，开创了酶技术走向商业化的先例。

1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。

1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。

1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。

1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。

1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。

Buchner兄弟的试验：用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液不含活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二氧化碳。

证明：发酵与细胞的存活无关，但是活细胞产生的。

1969年，日本，千畑一郎，固定化氨基酰化酶，从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，首次工业规模应用固定化酶，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱离出来;7、酶（enzyme）：活细胞产生的，能在细胞内外起作用的（催化）生理活性物质。

8、单体酶：只有单一的三级结构蛋白质构成。

寡聚酶：由多个（两个以上）具有三级结构的亚基聚合而成。

多酶复合体：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合体。

9、酶的分类：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，合成酶，核酶10、酶活力：又称为酶活性，酶催化一定化学反应的能力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。

11、酶的比活力是每单位（一般是mg）蛋白质中的酶活力单位数（如：酶单位/mg蛋白），实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示（如：酶单位/mL（液体制剂），酶单位/g（固体制剂）），对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂质越少），所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。

第二章：酶的生物合成与发酵生产1、酶生物合成的调节：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。

2、调节基因(regulator gene)：可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein)，通过与效应物(effector)的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。

调节基因常位于调控区的上游。

3、启动基因（promotor gene）（启动子）：有两个位点：（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。

4、操纵基因（Operator gene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。

5、结构基因（Structural gene）:决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。

6、酶的诱导：乳糖操控子是大肠杆菌中控制β半乳糖苷酶诱导合成的操纵子。

包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因)，以及结构基因lacZ(编码半乳糖苷酶)、lacY(编码通透酶)和lacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。

（1）、无乳糖时，调节基因lacI 编码阻遏蛋白，与操纵基因O 结合后抑制结构基因转录,不产生代谢乳糖的酶。

（2）、只有乳糖存在时,乳糖可与lac阻遏蛋白结合，而使阻遏蛋白不与操纵基因结合，诱导结构基因转录，代谢乳糖的酶产生以代谢乳糖。

（3）、葡萄糖和乳糖同时存在时，葡萄糖的降解产物能降低cAMP含量，影响CAP（cAMP受体蛋白）与启动基因结合，抑制结构基因转录，抑制代谢乳糖的酶产生。

7、色氨酸操纵子——酶的阻遏：无色氨酸存在时，调节基因编码阻遏蛋白（无活性），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达；有色氨酸存在时，结构基因编码阻遏蛋白（无活性），阻遏蛋白与色氨酸结合使其构型改变与操纵基因结合，结构基因不能表达。

8、分解代谢阻遏：在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。

待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）又称葡萄糖效应。

葡萄糖的分解代谢产物能能抑制腺苷酸环化酶的活性使cAMP不能形成，并激活磷酸二酯酶使cAMP转化为5’-AMP，降低胞内的cAMP水平，使CAP呈失活状态，RNA聚合酶不能与启动子结合。

当葡萄糖分解完以后，cAMP与CPA 结合成cAMP-CAP，CAP激活，并结合在cAMP-CAP的结合位点，RNA与启动子结合，结构基因进行表达。

9、在分批培养(batch culture)过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。

（填空）10、根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式：生长偶联型（同步合成型、中期合成型），部分生长偶联型（延续合成型），非生长偶联型（滞后合成型）11、生长偶联型（又称同步合成型）：酶的生物合成与细胞生长同步。

特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。

当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。

12、生长偶联型中的特殊形式——中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。

特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。

所对应的mRNA是不稳定的。

13、部分生长偶联型（又称延续合成型）酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。

14、非生长偶联型（又称滞后合成型）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。

许多水解酶的生物合成都属于这一类型。

特点：受分解代谢物的阻遏作用。

所对应的mRNA稳定性高。

15、酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。

细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。

对于：同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度。

滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。

中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。

16、固定化细胞：又称固定化活细胞、固定化增殖细胞，用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。

17、固定化细胞发酵产酶的特点：（1）提高产酶率：细胞密度增大使生化反应加速导致产酶率提高（2）可在高稀释度下连续发酵：不影响固定化细胞;（3）基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；（4）发酵稳定性好：细胞受载体保护，pH和T适应性宽；（5）缩短发酵周期，提高设备利用率；（6）产品容易分离纯化；（7）适于胞外酶等胞外产物的生产。

18、在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。

不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。

再适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株第三章：酶的提取与分离纯化1、酶的提取：把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。

提取目标：a. 将目的酶最大限度地溶解出来。

b. 保持生物活性。

提取原则：a. 相似相溶。

b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。

提取方法：（一）盐溶液提取常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大，最常用。

（二）酸、碱溶液提取（有些酶在酸或碱溶液中溶解度比较大且比较稳定）（三）有机溶剂提取（提取难溶于水的蛋白）2、沉降系数（sedimentation constant）：指单位离心力下颗粒的沉降速度（sedimentation velocity）,用S表示。

3、差速离心（differential centrifugation）：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。

4、密度梯度离心（density gradient centrifugation）：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。