小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法(超详细~)
小鼠腹腔巨噬细胞的快速提取及培养
小鼠腹腔巨噬细胞的快速提取及培养范仕郡;刘鑫;黄敏;王宁;郑江【期刊名称】《局解手术学杂志》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】目的：建立一种小鼠腹腔巨噬细胞快速提取的方法，为细胞实验提供便捷。
方法用生理盐水灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，转入高糖DMEM培养液中培养。
采用台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度，倒置显微镜观察细胞形态。
结果获得较高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。
结论本方法是一种简便实用的提取小鼠腹腔巨噬细胞的方法。
%Objective To establish a rapid method for the isolation of murine peritoneal macrophages. Methods Abdominal lavage was performed with NS and the peritoneal macrophages was purified from the lavage,which was later transferred into high glucose DMEM cul-ture medium. Cell viability was measured via the typan blue staining. Purity was observed via Wright's stain. Results High purity macropha-ges with typical morphology were obtained. Conclusion A simple and realistic method was set up for the isolation of murine peritoneal mac-rophages.【总页数】2页(P130-131)【作者】范仕郡;刘鑫;黄敏;王宁;郑江【作者单位】第三军医大学西南医院中心实验室，重庆400038;第三军医大学西南医院中心实验室，重庆400038;第三军医大学西南医院中心实验室，重庆400038;第三军医大学西南医院中心实验室，重庆400038;第三军医大学西南医院中心实验室，重庆400038【正文语种】中文【中图分类】Q813.1【相关文献】1.小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养 [J], 李海涛;肖丹;屈学民;刘渊声;马长升;杨继庆2.B16F10黑素瘤细胞培养上清液对脂多糖刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α和一氧化氮的影响 [J], 齐海花;胡云才;兰天飞;孙立新;段昕所;陆洁;宋有鑫;杨晓峰;杨新宏3.黑灵芝多糖对体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 [J], 张莘莘;李文娟;聂少平;谢明勇4.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 [J], 张淑莉;李素芬5.布氏锥虫伊氏亚种体外培养的研究——用小鼠腹腔巨噬细胞作滋养层培养布氏锥虫伊氏亚种 [J], 聂海洋;方元;叶万祥;王元伦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
步骤一、实验材料准备1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。
2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。
碘酒绵球和酒精绵球。
3. 器械：一次性注射器、手术器械。
二、实验方法如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。
不采用刺激物，直接开始下面的步骤。
1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。
用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。
2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。
3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。
台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。
4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。
三、结果巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。
巨噬细胞提取方法
我是按照经典的方法，注射淀粉肉汤3天后腹腔灌洗得来的，培养3小时除去上清液后纯化了巨噬细胞然后加药的，培养24小时后可以看到细胞已经贴壁了，但是我发现加了LPS的组细胞悬浮的比阴性组多，这个就很奇怪了，我的LPS浓度从10ng一直到20ug/mL都有设置，但是吞噬率无一超过阴性组的。
(1) 小鼠2 ml/只腹腔注射3%巯基乙醇酸钠，三天后颈椎脱臼处死小鼠，用75%乙醇浸湿3 min消毒，置超净台中；(2)用镊子将小鼠下腹部皮肤提起，剪开一个小口，将皮肤撕开，完全暴露腹膜；(3)用镊子提起腹膜，用10ml注射器向小鼠腹腔中注入6ml PBS缓冲液,针尖向上，避开肠和脂肪,反复回抽腹腔液，不同的方向冲洗数次，最后吸出腹腔液；(4)将细胞悬液1000r/min条件下离心10min，用PBS液洗涤l次，用含10%的胎牛血清RPMIl-1640将细胞悬起，台盼蓝染色，当活细胞数达到95%以上时调整细胞浓度至2×106个/ml。
(5)将细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，把细胞培养板放置于37℃5%CO2的培养箱中培养3h；(6)3h后取出细胞培养板，清洗1次，去除未贴壁的细胞，弃去上清液，然后每孔加入100mL RPMI-1640完全培养液,此时细胞培养板孔内的贴壁细胞即为纯化以后的小鼠腹腔巨噬细胞。
按照以上述制备和纯化腹腔巨噬细胞方法处理细胞后，200μL/孔加入不同浓度的阳性药LPS，阴性对照孔加200μL培养基，放置于培养箱中，培养24 h后取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗3遍，加0.1%中性红溶液200μL/孔，继续于培养箱中孵育3h。
取出细胞板，弃上清，用PBS液200μL/孔洗两遍后加细胞裂解液(醋酸与无水乙醇等体积混合) 200μL/孔，将96孔板放在微型振荡器上振荡10 min后，放在4℃冰箱12h过夜。
将细胞板520 nm 波长处测定吸光度。
按下式计算吞噬中性红增加率%=(给药孔A值一对照孔A值)/对照孔A值×100%。
巨噬细胞分离方法[汇总]
![巨噬细胞分离方法[汇总]](https://img.taocdn.com/s3/m/6ebbd0e54793daef5ef7ba0d4a7302768e996f76.png)
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
小鼠腹腔巨噬细胞的提取与鉴定
小鼠腹腔巨噬细胞的提取与鉴定
张淑莉;张琪;景晓红
【期刊名称】《国际检验医学杂志》
【年(卷),期】2015(036)002
【摘要】目的探讨小鼠腹腔诱导和提取巨噬细胞的简便方法.方法以5％淀粉肉汤刺激诱导小鼠产生炎性腹腔巨噬细胞,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含有10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养,显微镜观察细胞形态,台盼蓝染色鉴定细胞活力,体内吞噬鸡红细胞测定其吞噬率、吞噬指数,瑞氏染色、免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度.结果获得高纯度、高细胞活性的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征.结论该研究采用的方法简单实用,可提取大量巨噬细胞.
【总页数】3页(P174-175,178)
【作者】张淑莉;张琪;景晓红
【作者单位】西安医学院医学技术系检验中心,陕西西安710021;陕西省核工业417医院,陕西西安710600;西安医学院医学技术系检验中心,陕西西安710021【正文语种】中文
【相关文献】
1.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 [J], 张淑莉;李素芬
2.快速振荡法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞研究 [J], 徐尤年;刘桂林;蒙臣;张诗海
3.3％巯基乙酸盐肉汤诱导法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞 [J], 耿田欣;臧光耀;严金川
4.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 [J], 尹美珍;李世普;袁琳;戴红莲
5.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定 [J], 尹美珍;李世普;袁琳;戴红莲
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠腹腔巨噬细胞培养详细方法
小鼠原代腹腔巨噬细胞培养一．实验用品：器材：眼科镊，眼科剪，Pe铝箔，离心管（50ml两个），针管（5ml和1ml），酒精灯，移液枪，枪头，酒精棉球，75％酒精，酒精喷壶，烧杯。
器械：显微镜，细胞计数版，计数器。
试剂：PBS（磷酸盐缓冲液），TF,TG(巯基乙醇酸钠），含10％TBS的RPMI-1640培养液（重悬细胞）。
二．实验步骤：1.提取小鼠巨噬细胞前3-5天：向每只小鼠腹腔注射2ml-2.5ml的3％的TG(诱导巨噬细胞向M1型转化），充分酒精消毒。
2.前1天：高压器械（剪刀，镊子，铝箔纸，烧杯）3.提取巨噬细胞：三．结果：巨噬细胞：刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。
巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养的应用：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因治疗研究。
*注意：1. 巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖。
2. 很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。
3. 严格无菌操作，在超净台内进行。
4. 为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器。
5. 吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。
换液：培养液从4度取出回温，超净台中操作，用移液枪换液即可。
分离巨噬细胞的方法
分离巨噬细胞的方法巨噬细胞是免疫系统中重要的成分之一，其功能是吞噬和消化细菌、病毒、细胞残骸等病原体或异常细胞。
为了研究巨噬细胞的生理和病理功能，科学家需要从体内或体外分离出巨噬细胞。
下面将介绍几种常用的分离巨噬细胞的方法。
1. 腹腔巨噬细胞分离法这是一种常用的方法，适用于小鼠或大鼠的巨噬细胞分离。
首先，用适当的方法将小鼠或大鼠的腹腔打开，将腹腔洗液抽取出来。
洗液中含有大量的巨噬细胞。
然后，将洗液经过离心，将沉淀中的巨噬细胞收集起来。
最后，用适当的培养基培养巨噬细胞，使其继续生长和分化。
2. 骨髓巨噬细胞分离法这种方法适用于从小鼠或大鼠的骨髓中分离巨噬细胞。
首先，将小鼠或大鼠的骨髓从骨骼中取出，并用适当的方法将骨髓细胞洗涤干净。
然后，将洗液经过离心，将沉淀中的骨髓巨噬细胞收集起来。
最后，用适当的培养基培养骨髓巨噬细胞，使其继续生长和分化。
3. 化学法分离巨噬细胞这种方法利用化学试剂的特定性质，使巨噬细胞与其他细胞分离。
例如，可以利用巨噬细胞表面特定的受体，使用特定的抗体标记巨噬细胞，并通过离心或磁珠分离得到纯净的巨噬细胞。
此外，还可以利用化学试剂的特殊性质，如巨噬细胞对特定染料的亲和性，来分离巨噬细胞。
4. 细胞排序分离巨噬细胞细胞排序是一种高级的细胞分离技术，可以根据细胞的特定性质，如大小、形状、表面标记等，将巨噬细胞从混合细胞中分离出来。
这种方法可以高效地分离出纯净的巨噬细胞群体，但设备和技术要求较高。
总结起来，分离巨噬细胞的方法有腹腔巨噬细胞分离法、骨髓巨噬细胞分离法、化学法和细胞排序法。
这些方法各有优缺点，科学家可以根据实验需求选择适合的方法。
通过分离巨噬细胞，科学家可以更好地研究巨噬细胞的生理和病理功能，为疾病的治疗和预防提供理论基础。
分离巨噬细胞的方法
分离巨噬细胞的方法分离巨噬细胞是研究巨噬细胞功能和特性的重要步骤。
以下是十种常用的巨噬细胞分离方法，并对每种方法进行详细描述。
1. 腹腔巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠或大鼠。
实验动物首先经过局部消毒，然后腹腔被切开，并用含有PBS和酶的缓冲液灌洗腹腔，酶可包括胰酶或胃蛋白酶。
灌洗液收集并离心，上清液中含有的巨噬细胞可被采集。
2. 骨髓巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠或大鼠的骨髓。
动物被解剖并骨髓被收集，随后经过红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最后巨噬细胞被采集。
3. 足垫巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠。
小鼠足垫被切下，然后用酶解液处理，最终得到含有巨噬细胞的悬液。
4. 肝巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠。
小鼠肝脏被解剖切片，随后用酶解液处理使细胞解离，最后巨噬细胞被离心收集。
5. 肺巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠。
小鼠肺脏被灌洗，利用冰冷的灌洗缓冲液反复灌洗肺组织，然后收集悬液中的巨噬细胞。
6. 脾巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠或大鼠。
动物脾脏被解剖切片，然后用酶解液处理，经过红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最终得到含有巨噬细胞的悬液。
7. 血液巨噬细胞分离法：此方法适用于人或动物。
血液被抽取并用红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最后巨噬细胞被离心收集。
8. 胎盘巨噬细胞分离法：此方法适用于人或动物。
胎盘被解剖并切碎，随后用酶解液处理，经过红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最终得到含有巨噬细胞的悬液。
9. 巨噬细胞树突状细胞混合分离法：此方法适用于人或动物。
细胞混合悬液经过抗体标记和磁珠分离，然后通过磁珠分选系统将巨噬细胞和树突状细胞分离。
10. 巨噬细胞分选细胞器结合法：此方法适用于人或动物。
细胞混合悬液经过抗体标记和细胞器结合分选，利用流式细胞术或显微镜观察巨噬细胞的特定标记，并进行分选。
以上十种方法是常用的分离巨噬细胞的方法，每种方法有其适用范围和特点。
研究人员可以选择合适的方法根据研究需求进行巨噬细胞的分离，以获得纯净的巨噬细胞用于后续的实验和研究。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。
方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。
采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。
结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。
【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定0.引言巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。
有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。
本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。
1.材料与方法1.1实验对象清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。
1.2实验方法1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。
轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。
再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。
用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。
倒置显微镜观察细胞形态。
1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定（1）台盼蓝染色计算存活率。
4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。
小鼠腹腔巨噬细胞 提取量
小鼠腹腔巨噬细胞提取量
小鼠腹腔巨噬细胞的提取量可以根据实验所需的具体目的和方法来确定。
以下是一种常用的提取方法：1. 将小鼠处死后，用70%乙醇消毒小鼠腹部。
2. 用剪刀将小鼠腹部的皮肉切开，暴露腹腔。
3. 使用无菌吸管或针头，注入预冷PBS缓冲液到腹腔内，轻轻摇动或用力揉搓腹部几分钟，以充分洗涤腹腔巨噬细胞。
4. 用吸管或注射器将洗涤液吸取出来，转移到离心管中。
5. 对洗涤液进行离心，速度和时间要根据巨噬细胞的大小和沉降速度来确定。
通常，离心速度为
300-400 g，离心时间为5-10分钟。
6. 将上清液去除，留下含有巨噬细胞的沉淀。
7. 再次加入适量的预冷PBS缓冲液进行洗涤，重复上述离心步骤。
8. 最后，根据实验要求，将沉淀溶解或悬浮于适合的细胞培养液中，用于后续实验。
需要注意的是，提取量的多少受到小鼠体内巨噬细胞的数量以及实验处理步骤的差异等因素的影响。
因此，在每个实验中，都需要根据具体实验要求进行优化和调整。
《小鼠腹腔巨噬细胞的快速提取及培养》.pdf
小鼠腹腔巨噬细胞的快速提取及培养范仕郡,刘㊀鑫,黄㊀敏,王㊀宁,郑㊀江㊀(第三军医大学西南医院中心实验室,重庆400038)㊀㊀[摘㊀要]㊀目的㊀建立一种小鼠腹腔巨噬细胞快速提取的方法,为细胞实验提供便捷㊂方法㊀用生理盐水灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,转入高糖DMEM 培养液中培养㊂采用台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度,倒置显微镜观察细胞形态㊂结果㊀获得较高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征㊂结论㊀本方法是一种简便实用的提取小鼠腹腔巨噬细胞的方法㊂㊀㊀[关键词]BALB /c 小鼠;巨噬细胞;提取;培养;鉴定㊀㊀[中图分类号]Q813.1㊀[文献标识码]A㊀[文章编号]1672-5042(2015)02-0130-02㊀doi:10.11659/jjssx.11E014005㊀[基金项目]国家自然科学基金项目(81171781)㊀[收稿日期]2014-11-12㊀㊀[修回日期]2014-12-20Establishment of a rapid method for the isolation of murine peritoneal macrophagesFAN Shi-jun,LIU Xin,HUANG Min,WANG Ning,ZHENG Jiang㊀(Central Laboratory,Southwest Hospital,Third Military Medi-cal University,Chongqing 400038,China)㊀㊀Abstract :Objective ㊀To establish a rapid method for the isolation of murine peritoneal macrophages.Methods ㊀Abdominal lavagewas performed with NS and the peritoneal macrophages was purified from the lavage,which was later transferred into high glucose DMEM cul-ture medium.Cell viability was measured via the typan blue staining.Purity was observed via Wright's stain.Results ㊀High purity macropha-ges with typical morphology were obtained.Conclusion ㊀A simple and realistic method was set up for the isolation of murine peritoneal mac-rophages.㊀㊀Keywords :BALB /c mice;macrophage;extraction;culture;identification㊀㊀巨噬细胞是一类重要的天然免疫细胞,来源于外周血中的单核细胞,具有吞噬降解细菌㊁释放炎症介质㊁介导炎性细胞趋化㊁抗原提呈等活性,在抗感染㊁抗肿瘤免疫中发挥着非常重要的作用[1-2]㊂因此研究巨噬细胞的功能,对于深入理解机体免疫防御和免疫调节机制具有重要意义㊂获取原代细胞是体外研究巨噬细胞功能的重要方法㊂巨噬细胞在肺㊁肝㊁脑等实质器官以及腹腔等空腔部位以不同的形式分布㊂国内外已有不少文献报道从多种组织器官中成功分离和纯化巨噬细胞[3-5]㊂然而在实质脏器中的巨噬细胞,往往受到环境介质中各种理化和生物刺激因素的影响,已发生炎性活化或产生了定向分化,为其体外研究造成了干扰㊂而腹腔中存在大量静息状态的巨噬细胞,且腹腔中细胞种类较少简单,易于分离,是获取巨噬细胞的常用部位[6-9]㊂目前有关腹腔巨噬细胞的分离方法较为复杂,且操作耗时较长㊂本方法在既往文献报道基础上,对小鼠腹腔巨噬细胞提取方法加以改良,建立了一种更为简便实用的小鼠腹腔巨噬细胞的提取方法㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料及实验设备㊀㊀实验用材料及试验设备有:8周龄BALB /c 雌性小鼠(由北京华阜康生物科技股份有限公司提供)㊁生理盐水㊁胶头滴管㊁75%乙醇㊁眼科剪㊁眼科镊㊁10mL 一次性注射器㊁50mL 离心管㊁台盼蓝㊁瑞氏染液㊁奥林巴斯IX71倒置显微镜㊁奥林巴斯E400显微镜㊁细胞培养箱等㊂1.2㊀实验方法1.2.1㊀实验准备㊀㊀将眼科剪㊁眼科镊㊁胶头滴管高压灭菌;离心管辐照消毒;BALB /c 小鼠3只禁食8h;实验前将超净台紫外线消毒30min㊂1.2.2㊀细胞提取㊀㊀将小鼠脱颈椎处死,并浸入75%乙醇中10s㊂然后取出小鼠,沥干,将其仰卧于不锈钢方盘上㊂用注射器吸6mL 生理盐水液注入腹腔中,轻揉小鼠腹部2min,使液体在腹腔内充分流动㊂用眼科镊提起下腹皮肤,使动物微倾向一侧㊂剪开腹部皮肤后在肌肉层剪1个小口,用胶头滴管将腹腔液吸出转入离心管中㊂每只吸出量约为4~5mL㊂1.2.3㊀细胞培养㊀㊀在4ħ条件下,将收集的腹腔灌洗液在1000r /min 条件下离心10min,去上清,加入高糖DMEM 细胞培养液用细胞计数板计数㊂显微镜下(10ˑ100倍)计数巨噬细胞㊂调整细胞浓度至所需,接种至细胞培养瓶,37ħ培养箱孵育4h,充分贴壁后,弃上清,除去非粘附细胞再加入高糖DMEM 细胞培养液,放回培养箱中培养备用㊂2㊀结果2.1㊀台盼蓝染色㊁瑞氏染色结果㊀㊀分别用台盼蓝染色计数(图1a)㊁瑞氏染色计算纯度(图1b)㊂台盼蓝染色后,3min 内,镜下分别计数活细胞和死细胞㊂死细胞被染成蓝色,而活细胞呈无色透明状㊂细胞活力(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)ˑ100%>95%㊂瑞氏染色后,在镜下通过细胞形态计数巨噬细胞和细胞总数㊂巨噬细胞获得率(%)=巨噬细胞细胞总数/细胞总数ˑ100%>90%㊂a:台盼蓝染色;b:巨噬细胞瑞氏染色,箭头指示为瑞氏染色后巨噬细胞图1㊀提取细胞台盼蓝染色㊁瑞氏染色(ˑ1000)2.2㊀细胞形态观察㊀㊀培养12h 后,在倒置显微镜下可观察到细胞呈椭圆形㊁多角形或不规则形,部分贴壁(图2a)㊂培养24h 后观察可以观察到细胞贴满培养瓶,大部分出现伪足㊂部分细胞伸展开并牢固粘附在培养瓶表面(图2b)㊂a:培养12h 后细胞形态;b:培养24h 后细胞形态图2㊀培养后细胞形态3㊀讨论㊀㊀在鉴定细胞方面,采用台盼蓝染色其原理是活细胞的胞膜结构完整,台盼蓝不能够进入胞内,不能着色㊂反之死细胞的细胞膜通透性增加,台盼蓝进入后被染成蓝色㊂因此,采用台盼蓝染色计数死细胞和活细胞非常简便快捷,是组织和细胞培养中经典的鉴定染色方法㊂瑞氏染液为中性染料,它使细胞核及胞浆着色㊂染液中含有缓冲液来调节酸碱度,因此细胞染色后,蓝色和红色都比较适中,细胞核㊁胞浆显色都非常清楚,是目前在细胞染色中最简单和常用的方法㊂在细胞的提取过程中要注意无菌操作,注意器械和实验环境的消毒㊂选用雌性小鼠是因其肠壁脂肪较少,方便腹腔液的收集㊂周龄较大的小鼠腹腔巨噬细胞数量较少,最好选用6~8周龄小鼠㊂㊀㊀巨噬细胞广泛分布于体内,它不仅在非特异性免疫反应中发挥重要作用,而且也是机体特异性免疫中的一类关键细胞[10-11]㊂由于腹腔巨噬细胞多游离存在,易于获得,因此,许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系㊁或筛检免疫增强药物和探讨其作用机制时,往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象[12-13]㊂本方法在提取时,和其他方法一样,均是灌洗腹腔后,吸出含有巨噬细胞的灌洗液,然后离心培养㊂但传统方法中均采用淀粉肉汤㊁无菌液体石蜡等腹腔注射预刺激几天,以提高其获得率㊂预刺激处理一方面增加了操作的复杂程度,另一方面可影响分离巨噬细胞的静息特征㊂本方法实验前不需预刺激,减少了污染概率,大大缩短了细胞获取的准备时间,所得的巨噬细胞活力和获得率均大于90%㊂因此,此方法是一种简便实用的小鼠腹腔巨噬细胞的提取方法,为巨噬细胞的相关实验研究奠定了基础㊂[参考文献][1]Classen A,Lloberas J,Celada A.Macrophage activation:classical versus alternative[J].Methods Mol Biol,2009,531(6):29-43.[2]Bayne LJ,Beatty GL,Jhala N,et al.Tumor-derived granulocyte-macro-phage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and Tcellimmunity in pancreatic cancer[J].Cancer Cell,2012,21(6):822-835.[3]Kitani H,Takenouchi T,Sato M,et al.A novel isolation method for mac-rophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat livercells[J].J Immunol Methods,2010,360(1-2):47-55.[4]Neng L,Zhang W,Hassan A,et al.Isolation and culture of endothelialcells,pericytes and perivascular resident macrophage-like melanocytes from the young mouse ear[J].Nat Protoc,2013,8(4):709-720.[5]Zhang X,Goncalves R,Mosser DM.The isolation and characterization of murine macrophages[J].Curr Protoc Immunol,2008,83(14):1-14.[6]Schon Hegrad MA,Holt PG.Improved method for the isolation of puri-fied mouse peritoneal macrophages [J ].J Immunol Methods,1981,43(2):169-173.[7]黄㊀琼,李志场,杏㊀芬,等.流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能[J].中国药理学与毒理学杂志,2007,21(2):140-146.[8]张㊀华,钟英英,方廖琼,等.羊胎盘免疫调节因子对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响[J].中国生化药物杂志,2005,26(2):70-72.[9]李海涛,肖㊀丹.鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养[J].现代生物医学进展杂志,2008,8(4):638-639.[10]Biswas SK,Mantovani A.Macrophage plasticity and interaction withlymphocyte subsets:cancer as a paradigm [J].Nat Immunol,2010,11(10):889-896.[11]Mantovani A,Biswas SK,Galdiero MR,et al.Macrophage plasticity andpolarization in tissue repair and remodelling [J].J Pathol,2013,229(2):176-185.[12]Davies JQ,Gordon S.Isolation and culture of murine macrophages[J].Methods Mol Biol,2005,290(8):91-103.[13]Ghosn EE,Cassado AA,Govoni GR,et al.Two physically,functional-ly,and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets [J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(6):2568-2573.(编辑:周小林)。
小鼠腹腔巨噬细胞收集及形态观察
小鼠腹腔巨噬细胞收集及形态观察引言：巨噬细胞是免疫系统中的重要成员，能够吞噬和分解各种病原体，清除损伤组织，参与炎症反应等。
研究巨噬细胞的形态和功能对于了解它们的生物学特性以及炎症反应等方面具有重要意义。
本实验旨在收集小鼠腹腔巨噬细胞并观察它们的形态特征。
材料与方法：1.小鼠2.工作台、显微镜、离心管3.生理盐水、PBS、各种培养基4.细胞培养试剂：DMEM培养基、FBS、青霉素/链霉素溶液5.腹腔巨噬细胞培养培养基：RPMI1640培养基、FBS、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）步骤：1.准备培养基：将适量的DMEM培养基倒入离心管中，添加相应比例的FBS和青霉素/链霉素溶液，配置成完整的培养基。
2.预备小鼠：将小鼠按照实验需要进行麻醉。
3.收集巨噬细胞：在小鼠的腹腔注射适量的生理盐水，轻轻按摩腹部，使细胞悬浮在生理盐水中。
4.过滤：将悬浮液通过过滤网过滤，以去除大部分红细胞和细胞碎片。
5.离心：将过滤后的悬浮液离心10分钟，以沉淀巨噬细胞。
6.培养：将离心沉淀中的巨噬细胞重新悬浮在腹腔巨噬细胞培养基中，将细胞转移至培养皿中，放置于培养箱中，37℃、5%CO2梯度培养。
7.形态观察：将巨噬细胞转移至载玻片上，使用显微镜观察其形态特征。
结果：收集的巨噬细胞呈现典型的悬浮生长，细胞核呈圆形或椭圆形，胞质丰富，颗粒较少，呈现相对均匀的染色。
巨噬细胞的大小约为10-30μm。
讨论：巨噬细胞是免疫系统中的重要成员，在免疫防御作用中扮演着关键角色。
通过本实验，我们成功地收集了小鼠腹腔巨噬细胞，并对其进行了形态观察。
巨噬细胞细胞核呈圆形或椭圆形，胞质丰富，颗粒较少，这与其吞噬和分解病原体的功能密切相关，说明巨噬细胞的形态结构与其功能密切相关。
总结：本实验收集了小鼠腹腔巨噬细胞并观察了其形态特征。
巨噬细胞是免疫系统中的重要组成部分，了解其形态特征以及功能对于进一步研究免疫调节以及炎症反应等方面具有重要意义。
小鼠腹腔巨噬细胞提取方法
小鼠腹腔巨噬细胞提取方法
操作步骤
一、将小鼠以颈椎脱臼法处死，仰卧，固定四肢。
二、依次用碘酒及酒精棉球消毒腹部，以镊子提取腹壁，剪去小块皮肤，继以镊子提取腹腔。
剪一小口，以注射器注入少量冲洗液。
用滴管吸出，再注入冲洗液并吸出，滴管在腹腔内各个位置吸取液体，冲洗每只小鼠腹腔约5ml。
三、将腹腔细胞悬液滴于干净载玻片上，置37度湿盒内，1-2小时后倾去玻片上的液体，
并用腹腔冲洗液轻洗玻片，即可见玻片上有毛玻璃样的单层巨噬细胞粘附，巨噬细胞含量可达90%
四、在显微镜下计算巨噬细胞的百分比，检测分离结果。
小鼠腹腔巨噬细胞的提取与鉴别方法探讨。
3％巯基乙酸盐肉汤诱导法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞
3％巯基乙酸盐肉汤诱导法高效提取小鼠腹腔巨噬细胞耿田欣;臧光耀;严金川【摘要】目的:比较不同方法提取小鼠腹腔巨噬细胞的生物学特性并筛选出高效的提取方法.方法:选取32只健康昆明小鼠,随机分为4组,每组8只,分别采用以下4种不同方法获得腹腔巨噬细胞:PBS直接灌洗小鼠腹腔(PBS组);含10％血清的RPMI 1640培养液注入小鼠腹腔,30 min后灌洗小鼠腹腔(培养液组);6％淀粉肉汤注入小鼠腹腔,每天1次,3 d后以PBS灌洗腹腔(淀粉肉汤组);3％巯基乙酸盐肉汤注入小鼠腹腔,每天1次,3 d后以PBS灌洗腹腔(巯基乙酸盐组);将各组所获细胞分别转入含10％血清的RPMI 1640培养基中贴壁培养,比较细胞形态、数量、吞噬能力、纯度以及活性.结果:4组巨噬细胞的形态无明显差异;与其他3组相比,巯基乙酸盐组诱导所得的细胞数量最多(t=16.685,9.361,3.199,P均<0.01),且吞噬能力最强(t=5.675,3.712,3.026,P均<0.01);4组巨噬细胞的F4/80、CD68表达率以及活性均相似且高于95％,差异无统计学意义(F=0.696,0.647,0.341,P均>0.05).结论:3％巯基乙酸盐肉汤诱导小鼠腹腔巨噬细胞后灌洗,是一种获取大量小鼠腹腔巨噬细胞的高效方法.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2019(029)001【总页数】5页(P45-48,53)【关键词】腹腔巨噬细胞;巯基乙酸盐;小鼠【作者】耿田欣;臧光耀;严金川【作者单位】江苏大学附属医院心内科,江苏镇江 212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江 212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江 212001【正文语种】中文【中图分类】R393动脉粥样硬化病灶的形成是一个慢性连续的过程,脂质沉积在局部动脉内膜进而形成粥样斑块，巨噬细胞在此过程中发挥了重要作用[1-2]。
腹膜巨噬细胞提取
腹膜巨噬细胞提取腹膜巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，它们存在于腹膜腔内，具有吞噬和清除病原体、细胞垃圾、细胞凋亡产物等功能。
本文将从腹膜巨噬细胞的提取方法、特征和功能等方面进行介绍。
腹膜巨噬细胞的提取方法有多种，其中一种常用的方法是腹腔注射法。
具体操作时，首先将小鼠或大鼠按照实验需求进行处理，比如给予某种刺激物。
随后，在消毒条件下，将小鼠或大鼠的腹腔用注射器注入适量的缓冲盐水，轻轻按摩腹部，使腹腔内的细胞混合均匀。
然后，用注射器吸取腹腔内的混合液，将其转移到离心管中，并进行离心分离。
最后，将上清液中的腹膜巨噬细胞收集起来，即可得到腹膜巨噬细胞。
腹膜巨噬细胞具有一些独特的特征。
首先，它们是一类大型细胞，形状呈椭圆形或不规则形状。
其次，腹膜巨噬细胞具有丰富的胞质，含有大量的溶酶体和吞噬体，这使得它们能够进行吞噬和降解病原体。
此外，腹膜巨噬细胞表面具有多种受体，可以识别和结合多种病原体，从而发挥其免疫功能。
此外，腹膜巨噬细胞还能够分泌多种细胞因子，如肿瘤坏死因子和白细胞介素，参与调节免疫反应。
腹膜巨噬细胞在机体的免疫防御中起着重要的作用。
首先，它们是机体的第一道防线，当病原体侵入腹腔时，腹膜巨噬细胞能够迅速识别和吞噬这些病原体，从而阻止其进一步传播。
其次，腹膜巨噬细胞能够分泌多种细胞因子，如干扰素和肿瘤坏死因子，这些细胞因子能够激活和招募其他免疫细胞，如自然杀伤细胞和T淋巴细胞，共同抵抗病原体的侵袭。
此外，腹膜巨噬细胞还能够清除细胞垃圾和细胞凋亡产物，维持组织的正常功能。
除了在免疫防御中的作用外，腹膜巨噬细胞还具有其他重要的生理功能。
例如，研究表明腹膜巨噬细胞参与了脂质代谢的调节，能够调控血脂水平和胆固醇代谢。
此外，腹膜巨噬细胞还参与了肿瘤的发生和发展过程，可以诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤的生长。
因此，对腹膜巨噬细胞的研究不仅对于了解机体的免疫防御机制有重要意义，还对于疾病的预防和治疗具有潜在的临床应用价值。
小鼠原代巨噬细胞提取
小鼠原代巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，它们在体内发挥着重要的免疫调节作用。
在提取小鼠原代巨噬细胞的过程中，需要遵循一定的步骤和注意事项，以确保细胞的完整性和活性。
材料准备：1. 小鼠整体麻醉；2. 培养皿、培养瓶等细胞培养用具；3. 胰酶、EDTA等细胞消化试剂；4. 抗生素、血清等细胞培养基添加剂；5. 记号笔、显微镜等工具。
提取步骤：1. 小鼠整体麻醉后，打开胸腔，暴露出肺组织，剪取一定量的肺组织，放入无菌的培养瓶中；2. 向培养瓶中加入适量细胞培养基，清洗肺组织中的血液和杂质；3. 使用胰酶将肺组织中的巨噬细胞消化并转移到另一个容器中；4. 向容器中加入含有EDTA的细胞培养基，以终止胰酶的作用；5. 使用细胞刮器将细胞刮成单细胞悬液；6. 将细胞悬液转移到另一个无菌的培养瓶中，加入适量细胞培养基进行培养；7. 在培养过程中，需要定期更换培养液，并观察细胞的生长情况。
注意事项：1. 整个操作过程需要在无菌的环境中进行，以避免污染；2. 在消化和转移细胞时，要确保细胞的完整性，避免细胞损伤；3. 使用的试剂和工具需要严格消毒，避免交叉污染；4. 在观察细胞生长情况时，需要使用显微镜进行观察，并做好记录。
提取成功标志：当小鼠原代巨噬细胞成功培养后，可以看到细胞贴壁生长，并且呈现出典型的单核细胞形态，如圆形的多突起状。
同时，可以通过观察细胞密度、生长速度和活性等指标来判断提取是否成功。
如果细胞生长良好，密度适中，生长速度快，活性高，则说明提取成功。
总之，小鼠原代巨噬细胞的提取需要一定的技术和经验，但只要严格按照步骤操作，并注意细节问题，就可以成功提取出高质量的细胞。
这些细胞在免疫学研究、药物筛选等方面具有非常重要的应用价值。
小鼠腹腔巨噬细胞提取流程
小鼠腹腔巨噬细胞提取流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!小鼠腹腔巨噬细胞的提取流程如下：1. 实验材料准备- 实验动物：C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重18-22g。
巨噬细胞培养操作方法
巨噬细胞培养操作方法
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分
子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代
培养，难以长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、 S774A.1、RAW 309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代
和瓶壁分离，但难以建株。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材
法最为实用，其法如下：
1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。
2、引颈处死小鼠。
3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中 3－5秒。
4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及
腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时
用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。
6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取
入针管内。
7、小心拔出针头，把液体注入离心管。
8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。
9、计数细胞。
每只鼠可产生20一30×106细胞，其中 90%为巨噬细胞。
10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。
11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1一2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。
实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。
注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。
（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。
（3）固定小鼠，暴露腹腔。
（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。
（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。
（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。
（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。
（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。
（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。
（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。