荧光报告载体

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人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建

ｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１，ＰＡＩ一１）、抵抗素（Ｒｅｓｉｓｔｉｎ）、白介
收稿日期：２０１２ — ｏ６ — １８
ｍｏｕｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ — ａｌｐｈａ，ＴＮＦ — ）等，统称为脂肪细胞分泌因子（Ａｄｉｐｏｋｉｎｅｓ，ＡＤＳ）。其中ＡＤ是脂肪组织表达最丰富的特异性蛋白质产物之一，能够扩大
外分光光度计测定ＤＮＡ的纯度和含量。
３．ＰＣＲ扩增ＡＤ基因启动子片段
报告基因表达载体ｐＧＬ一３ｂａｓｉｃ（Ｅ６７２１），限制
等密切相关，但其作用机制尚不明确。本课题利用ＰＣＲ技术从人全血基因组ＤＮＡ中扩增出长为１．１ｋｂ
修回日期：２０１２ —１２ — １８
★
郑州市科技公关计划项目（０９１０ＳＧＹＳ３３３９１ — １）：以脂肪细胞分泌因子为靶点的减肥中药初步筛选，负责人：宰军华。
２０１３第十五卷
第一期
＊Ｖｏ１ห้องสมุดไป่ตู้．１５Ｎｏ．１
和２．１ｋｂＡＤ启动子片段，并将其克隆到荧光素酶报告基因载体ｐＧＬ一３ｂａｓｉｃ上，为今后研究ＡＤ基因表达调控的分子生物学机制和药物筛选提供实验工具，亦为进一步阐明ＡＤ在肥胖及其相关疾病中的作用提供实验学方法。

KLF3基因3'-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

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pRL 家族海肾荧光素酶对照报告基因载体系列

pRL家族海肾荧光素酶对照报告基因载体系列产品包装目录号价格pRL-SV40 Vector 20ug E2231pRL-TK Vector 20ug E2241pRL-CMV Vector 20ug E2261pRL-null Vector 20ug E2271描述：pRL家族海肾荧光素酶(Rluc)对照报告基因载体系列是设计应用于双荧光素酶报告基因检测系统的。

pRL载体提供组成性表达的海肾荧光素酶，可与一个萤火虫荧光素酶载体联合共转染哺乳动物细胞。

海肾荧光素酶的表达为使实验的萤火虫荧光素酶报告基因正态化提供内对照值。

pRL载体包含一个编码海肾荧光素酶(Rluc)的cDNA, 这个cDNA从珊瑚虫类腔肠动物海肾(Renilla reniformis)中克隆而来。

目前有四个不同的启动子载体。

其中HSV-胸腺嘧啶核苷激酶启动子(pRL-TK)相对较弱，在提供海肾荧光素酶报告基因载体的组成性表达时特别有用。

早期SV40 增强子/启动子区域(pRL-SV40)和CMV极早期增强子/启动子区域（pRL-CMV）一般提供高水平转录，因此也许不适于应用在实验载体带有强调节因子的辅助报告基因实验中。

一般，我们建议在将要应用的目标细胞中验证一个特定辅助报告基因的性能。

与修饰过的Rluc 基因一样，所有的pRL载体都从dam-/dcm-E.coli K菌株中分离得到，允许使用对dam和dcm 甲基化敏感的限制性内切酶进行消化。

特点：●在紧靠Rluc的上游有一个T7启动子，允许进行海肾荧光素酶的体外合成。

●在Rluc的下游有一个SV40的晚期poly(A)序列，提供有效的转录终止和mRNA的聚腺苷酸化。

●原核复制起点和β-内酰胺酶基因使得pRL载体可在E.coli宿主中进行选择扩增。

●为避免DNA甲基化，所有的pRL载体均从dam-/dcm-E.coli K宿主中分离得到。

操作手册：技术公告：TB237, TB238, TB239, TB240储存条件：载体存于-20℃, 细菌菌株存于-70℃。

荧光蛋白报告载体

荧光蛋白报告载体荧光蛋白（Fluorescent Protein，FP）是一类具有自身天然荧光特性的蛋白质，能够在特定条件下发出可见光。

由于其独特的特性，荧光蛋白被广泛应用于生物学研究、医学诊断和生物工程等领域。

而荧光蛋白报告载体则是指将荧光蛋白基因与其他基因融合，使得该基因在表达时能够产生可见荧光信号，从而实现基因表达的可视化和定量化。

下面将介绍荧光蛋白报告载体的构建和应用过程。

1.荧光蛋白的选择荧光蛋白有多种类型可供选择，如绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）等。

在选择荧光蛋白时，需考虑其荧光强度、稳定性、激发波长和发射波长等因素，并根据实验需要进行合适的选择。

2.载体的构建将荧光蛋白基因与目标基因进行融合，需要使用合适的载体来实现。

常用的载体包括质粒、病毒载体等。

质粒载体是最常用的载体之一，可以通过分子克隆技术将荧光蛋白基因与目标基因连接起来，形成报告载体。

3.载体的转染将构建好的荧光蛋白报告载体导入到目标细胞内，实现基因的转染。

转染方法有多种，如瞬时转染、稳定转染等。

根据实验需要和细胞类型的不同，选择合适的转染方法。

4.荧光成像与分析转染后的细胞可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。

根据荧光蛋白的特性，可以通过激发荧光信号，观察细胞内目标基因的表达情况。

同时，可以利用图像分析软件对荧光图像进行处理和分析，实现基因表达的定量化和定位。

5.应用领域荧光蛋白报告载体在生物学研究、医学诊断和生物工程等领域有广泛的应用。

在生物学研究中，荧光蛋白报告载体可以用于研究基因的表达和调控机制，观察细胞的生理和病理过程，探究蛋白质的定位和交互作用等。

在医学诊断中，荧光蛋白报告载体可以用于检测病原体的存在和活性，实现早期诊断和治疗。

在生物工程中，荧光蛋白报告载体可以用于基因工程的监测和优化，提高基因表达的效率和产量。

总结：荧光蛋白报告载体通过将荧光蛋白基因与目标基因融合，实现了基因表达的可视化和定量化。

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。

2.有哪些海肾荧光素酶载体海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。

这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体：A pRL-SV40载体??? pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。

pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。

B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。

a pRL-TK载体pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。

b pRL-null载体pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。

3.用双报告基因有何优点一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。

将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。

海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。

在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。

4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点用双荧光素酶报告基因测试（DLR）有几个优点：•快速•DLR测试不需保温或对样品作预处理。

人IPIO启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

制的研究。

［关键词］干扰素一一诱导蛋白１０；转录启动子；红色荧光蛋白；基因，调节；基因，报告
［中图分类号］Ｑ７８
［文献标识码］Ａ
［文章编号］１０００－２７０７（２００７）０４－０３４５－０４
酶切和ＤＮＡ测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的；该表达载体在ＨＥＫ２９３细胞静息状态下表达水平很低，经ＬＰＳ刺激后，在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论：所构建的ＩＰＩＯ启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的，对生理相关刺激有很好的反应，可有效地用于ＩＰＩＯ基因表达信号调控机
维普资讯
第３２卷第４期２００７年８月
贵阳医学院
学报
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＵＩＹＡＮＧＭＥＤＩＣＡＬＣＯＬＬＥＧＥ
ＶＯ１．３２ＮＯ．４２０ｏ７．８
人ＩＰＩＯ启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达帛
Ｍｅ￣ｏｄｓ：ＨｕｍａｎＩＰＩＯｐｏｍｏｒｔｅｒｗａｓｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏａｅｄｒｌｕｆｏｒｅｓｃｅｎｔｐｏｔｒｅｉｎｖｅｃｔｏｒ，ｐＤｓＲｅｄｌ一１．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｏｒｔｗａｓｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨＥＫ２９３ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅｅｃｒｏｂｉｍｎｎｔａｐｌｓｍｉａｄｗａｓｖｅｉｆｒｉｅｄ

转染绿色荧光蛋白表达载体

• 肿瘤发病机制的应用 • GFP 与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。
转染原理
• 脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的。在水中可以自动生成闭合的双层膜，最初 ,人们只是运用脂质体模拟生物膜 ,研究膜的构造及功能 ,后来发现了膜的融合及内吞作用 ,因而可用作外源物质进入细胞的载体。 • 现商品化的脂质体通常都是阳离子脂类和中性脂类的复合体。其中以阳离子脂类起主要作用，阳离子脂质体既能与 DNA可以通过静电作用形成脂－DNA复合物，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附。从而引导DNA进入细胞。 • 本次用脂质体为invitrogen公司Lipofectamine® 2000
• 而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力，综上就产生了增强型GFP，分也是钱永健的功劳。现在有蓝色荧光蛋白（EBFP）、青色荧光蛋白（ECFP）和黄色荧光蛋白（YFP） • 于2008年获得诺贝尔奖
• 作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。 • 将GFP作为蛋白质标签，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。 • 利用GFP来检测目标蛋白的定位为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。
转染绿色荧光蛋白表达载体
• 绿色荧光蛋白（GFP)是1962年从水母中发现的一个荧光蛋白，1992年被克隆，近年得到广泛应用。其分子中的发光基团对蓝色光照特别敏感。当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。

荧光素酶报告实验

荧光素酶报告实验1 扩增目的片段扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。

主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法：第二种方法：1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。

酶切产物进行胶回收。

酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-nVector or DNA x Vector mNEB Buffer I或IV 2 DNA nSpe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1Pme I 1 T4 DNA Ligase 1Total voloume 20 Total voloume 101.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。

连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。

Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。

并扩繁阳性克隆。

重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）：pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h；5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞；A 液B液pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μlpRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μlMimic/NC 100 nM终浓度OPTI-MEM 25 μl6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞；7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate；8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀；9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据；10 用Stop & Glo® Buffer稀释Stop & Glo® Substrate至1×使用浓度；11 在第7步完成后，加入Stop & Glo® Substrate 100 μl/孔，混匀；12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。

SOCS3基因3'端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性鉴定

ｔｄｎｔａａｙｅｈｍｉｅａｄｏｎｌｓｔｅＲＮＡｓｅｕａｅｒｇｌｔｄＳＯＣＳｅｐｅｓｏｈｏｇｄｔｃｉｇｔｅｕｉｅａｅｃｉｉｏ３ｘｒｓｉｎｔｒｕｈｅｅｔｎｈｌｃｆｒｓａｔｖｔｆｙＳＯＣＳＵＴＲ．Ｍｅｈｏ３３ｔｄｓ：ＴｈＵＴＲｒｇｎｆＳｅ３－ｆａｍｅｔｏＯＣＳｅｅｗａｍｐｌｅｙＰＣＲｒｍｅｏｃＤＮＡ３ｇｎｓａｉｄｂｉｆｆｏｇｎｍｉ
体，并通过荧光素酶活性测定，步分析可能调控ＳＣ３基因表达的ｍＲＡ。方法：初ＯＳｉＮｓ采用ＰＲ方法从原代培养的小Ｃ
鼠星形胶质细胞基因组ＤＡ中扩增ＳＣ３基因３－ＴＮＯＳＵＲ序列，插入荧光素酶报告载体ｐＬ－ｒｍｔ，Ｇ３Ｐｏｏｒ获得重组载体ｅｐＬ一ｒｍｔ／ＯＳ；Ｇ３ＰｏｏｒＳＣ３通过Ｔｒｔｃｎ．、ＮｈｂｉＦＮＴＲｅａｅＳａ５２ＲＡｙｒｇｄ和ＩＤＡ３软件预测可能与ＳＣ３基因３一ＴＯＳＵＲ结合的ｍＲｉ－Ｎｓ将ｐＬ一ｒｍｏｒＳＣ３重组质粒和ｍＲＡＡ；Ｇ３Ｐｏｔ／ＯＳｅｉＮｓ共转染ＨＫ２３Ｅ９Ｔ细胞，定ＳＣ３３一Ｔ测ＯＳＵＲ荧光素酶的活性。
结果：切及核酸测序证实，功构建了ＳＣ３基因３－Ｔ序列的荧光素酶报告重组子；ＲＡ靶位点预测显示，酶成ＯＳＵＲｍｉＮ

双荧光素酶基因法载体构建

双荧光素酶基因法载体构建双荧光素酶基因法是一种常用的基因标记技术，可以在细胞或物种中标记特定基因，方便研究基因的表达和功能。

该技术将荧光素酶基因和荧光素酶底物相结合，并通过酶学反应产生强烈的荧光信号，从而实现基因标记和检测。

本文将介绍双荧光素酶基因法载体的构建方法。

1、材料双荧光素酶基因报告载体（pGL4.31）双荧光素酶基因调控元件载体（pGL4.32）限制酶EcoRI和XhoIT4连接酶琼脂糖PCR扩增产物模板PCR引物大肠杆菌DH5α感受态细胞2、方法1) 双荧光素酶基因报告载体（pGL4.31）的构建a、制备pGL4.31载体的线性质粒选取pGL4.31载体，使用限制酶EcoRI和XhoI对其进行酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化出所需大小的线性DNA片段。

b、连接荧光素酶基因将线性质粒与荧光素酶基因进行T4连接酶酶切和连接，构建成双荧光素酶基因报告载体。

a、PCR扩增产物的准备选择所需的基因调控元件序列作为PCR扩增产物的模板，设计一对前后引物，在PCR 反应条件下扩增所需大小的DNA片段。

a、验证载体的构建将构建好的双荧光素酶基因报告载体和基因调控元件载体进行测序验证，确定所构建载体序列的准确性。

将所构建好的载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行筛选和扩增。

通过测序验证构建的载体与所需载体相符，符合要求的荧光素酶基因法载体已构建成功。

二、结论通过双荧光素酶基因法载体的构建，成功将荧光素酶基因和基因调控元件结合构建成标记组合载体，为后续研究基因表达和功能提供了多种方法和途径，有助于深入探究生物学领域的多项研究内容。

大肠杆菌不同SOD调控序列红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定

ｄｉｅｙｄｆｅｅｔＳＤｒｇｌｔｒｅｕｎｅｉ．ｏｉｔｒｕｈｆｓｎｎＯ，ＦＳＤｕＺＳＤｒｖｎｂｉｆｒｎＯｅｕａｏｙｓｑｅｃｎＦｃｌｈｏｇｕｉｇＭＳＤｅＯ，Ｃ／ｎＯ
ｒｇｌｔｒｓｑｅｃａｄＦｇｎｉＬ１ｅｕａｏｙｅｕｎｅｎＲＰｅｅｎＢ２Ｆ．ｏｉ．Ｍｔｏｓ：Ｒｄｌｏｅｃｎｐｏｅｎ（ＦｃｌｅｈｄｅｆｕｒｓｅｔｒｔｉＲＰ）
ｃＣａｌｏｌｌｅｇｅ，Ｗｎｚｈｏｕ。３ｅ２５０３５
ＷＥＮＧＣｏｎｇｃｏｎｇ．ＦＡＮＧＹｉｎ．ＨＵｍｉＡＮＧ＊ＢｉｏｌｙＤｅｏｇｐａｒｔｍｅｎｔｆＷｎｚｈｏｕｏｅＭｅ－ｄｉ
Ｏｊｃｉｅ：Ｔｏｔｕｔｅｆｕｒｓｅｔｐｏｅｎ（ＦｂｅｔｖｏｃｎｓｒｃｒｄｌｏｅｃｎｒｔｉＲＰ）ｒｐｒｅｇｎｖｃｏｓｅｏｔｒｅｅｅｔｒ
ｒｐｒｅｅｅａｄＭＳＤｅＯ，Ｃ／ｎＯｅｕａｏｙｓｑｅｃｅｅｆｓｄｕｉｇｒｃｍｉａｔｅｏｔｒｇｎｎｎＯ，ＦＳＤｕＺＳＤｒｇｌｔｒｅｕｎｅｗｒｕｅｓｎｅｏｂｎｎ
ＣｏｔｃｔｎｎｄｎｓｒｕｉｏａｆｕｔｉｎａｉｄｎｔｆｉｃｔｉｎｏｒｅｄｎｃｏｌｅｉａｏｆｆｌｒｃｅｐｕｏｅｓｎｔｒｏｔｎｅｉｒｅｐｒｔｇｅｖｅｏｒｏｅｒｎｅｃｔｄｖｎｂｄｉｆｒｅｔｒｉｅｙｆｅｎＳＯｒｕａｔｒｓｑｎｅｎＤｅｇｌｏｙｅｕｅｃｉＥ．ｏｉｃｌＲｕｎｑｉａｏ．ＬＩＤｏＮｎｇｄｎｇ．ＺｏＨＡＮＧＨｏｎｇｑｉ。Ｓｉｌｎｇｒｕ．ｎｌＭｅ

双荧光素酶报告基因检测与载体构建服务说明

3. 片段获取（WT，Mut） 3. 重组构建
3. 突变引物扩增
4. 构建载体
4. 测序比对
4. 突变片段重组
5. 测序比对
5. 纯度浓度测定，去内毒 5. 测序比对
素 6. 细胞转染（默认工具细
7. 纯度浓度测定，去内毒
胞）
6. 包装，质检，发货
素
7. 双荧光素酶活性检测
6. 包装，质检，发货
电子示例图
标准化文件：uptbioVC0 双荧光素酶报告与载体构建服务说明
双荧光素酶报告基因检测与载体构建服务说明
亲爱的客户，为了给您更好的提供“U 平台—双荧光素酶报告基因检测与载体构建” 技术服务，请您阅读以下说明条款：
1. 请您在与我们签约前配合填写《双荧光素酶报告基因检测与载体构建咨询表》，我们将严格按照您填写的需求进行项目管理和成果提交。
含：载体图谱序列 .dna 文件（使用 snapgene 软件）
地址：湖南省长沙市岳麓高新区兴工国际产业园 2 栋 402
固话：0731-85572308
标准化文件：uptbioVC0 双荧光素酶报告与载体构建服务说明
含：测序峰值图文件 .ab1 文件（使用 chromas/snap基因检测与载体构建”实验内容如下，实验结束后再发送实验报告，具体流程：
表 1. 双荧光素酶报告与载体构建实验设定流程
实验名称
双荧光素酶报告
载体构建
定点突变
实验内容
1. 在线预测序列 2. 构建方案确认
1. 目的片段获取 2. 载体片段获取
1. 确认突变需求 2. 突变方案确认
3. U 平台承诺所出具的检测结果真实、可信，并可提供所有原始材料及实验报告。 4. U 平台承诺对所有客户信息、客户成果保密，未经允许绝不透露给第三方。 5. 成果提交内容

人HOXAl3-非翻译区荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

基因发现，ＨＯＸ与小细胞肺癌的耐药性密切相关ｌ。ＭｉＡ１４］ —
ＤＮＡ序列设计特异性引物，５端分别加入Ｎｏ和Ｘｈ酶切ｔＩｏＩ
位点，游引物为Ｐ５ＡＴＧＡＡＣＣ；ＧＡＧＡＡＡ上Ｆ：ＡＡＴＧＧＸＣＣＣ — ＣＧＣＧＡＴＴ３，￡物为ＰＡＣＣＡＧＣＣＣ下引Ｒ：５ＣＴ — ＣＣＣＧＡ０ＴＡＣＡＣＧ由英骏生物技术有限公ＧＡＡＣ］ＡＡＴＴ，Ａ３司合成。１２２基因组Ｄ．．ＮＡ的提取按照试剂盒说明提取Ｈ６Ａ９Ｒ细胞基因组ＤＮＡ，为ＰＲ扩增的模板。作Ｃ
剂盒进行回收，量，装，２ ℃贮存。定分－０１２４ｐｉ．．ｓＣＨＥＫ－一ＨＯＣ２ＸＡ１３ＲＲ的构建－＇－ＵＴ ① 酶切：将
上述ＰＲ扩增产物回收纯化后采用Ｎｔ和Ｘｈ双酶切；ＣｏＩｏＩ ② 连接：６１￣Ｃ将扩增片段与ｐｉｓＣＨＥＫ－接１；Ｃ２连２ｈ ③转化：将上述连接反应产物５Ｌ用热击转化法转化入５ｔＬ采Ｏ止ＤＨ５ａ感受态细胞中，取适量的上述转化菌液涂布于预热的２ ×ＹＴ培养板（含氨苄青霉素１０／）３￣平倒置培养过夜；０ｇｍ１，７Ｃ水 ④ 蓝白斑筛选克隆：取一些独立的白色的转化菌落进行小规挑模培养，挑菌环挑取白色单菌落于４ｍｌ氨苄青霉素用含（０ｇｍ１的２Ｔ液体培养基中，３￣１０／） ×Ｙ于７Ｃ条件下２０ｒｒｉ５／ｎａ振摇培养１￣１。以质粒小规模抽提试剂盒从４ｍｌ２４ｈ菌液中

【国家自然科学基金】_荧光素酶报告载体_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140802

科研热词推荐指数启动子 13 荧光素酶 6 荧光素酶报告基因 3 报告基因 3 基因表达 3 转录调控 2 转录活性 2 基因治疗 2 克隆 2 rna干涉 2 nf-κ b 2 jak-stat信号转导通路 2 骨形态发生蛋白2 1 酰基辅酶a 1 过氧化物酶体增殖因子活化受体δ 1 转染 1 转录靶向性 1 转录因子,e2f1 1 转录,遗传 1 转录 1 质粒 1 调控 1 诱导表达 1 表达 1 萤火虫荧光素酶 1 荧光素酶基因表达载体 1 腺病毒载体 1 腺病毒 1 脑炎病毒 1 脂肪肝 1 胰岛素 1 胆固醇酰基转移酶1 1 肿瘤细胞 1 肿瘤坏死因子 1 肺表面活性蛋白 1 肝癌细胞bel-7405 1 聚合酶链反应 1 缺氧诱导丝裂原因子 1 结肠癌 1 结直肠癌 1 结构与功能 1 细胞色素p450 4a11 1 组织因子 1 纯化 1 糖调节蛋白78 1 米非司酮 1 突变 1 神经元限制性沉默因子 1 神经元限制性沉默元件 1 磷酸丙酮酸水合酶 1 真核表达载体 1 真核表达 1
107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119
mapk luciferase报告基因 lcrg1 kir3dl1基因 jnk3 iκ bα flt-1 fgf e-box元件 cpne5 bcma bcl-xl alzheimer病
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荧光素酶报告基因实验步骤

荧光素酶报告基因实验步骤
荧光素酶报告基因实验是一种常用的分子生物学实验，用于检测基因表达水平。

该实验利用荧光素酶作为报告基因，通过荧光素酶催化荧光素底物的反应，产生荧光信号，从而反映基因表达水平。

下面是荧光素酶报告基因实验的步骤：
1.构建荧光素酶报告基因载体
首先需要构建荧光素酶报告基因载体，该载体包含荧光素酶基因和目标基因的启动子区域。

在构建载体时，需要选择适当的启动子区域，以确保荧光素酶基因能够被有效表达。

2.转染细胞
将构建好的荧光素酶报告基因载体转染到目标细胞中。

转染方法可以选择化学法、电穿孔法或病毒载体介导的转染等。

转染后需要进行筛选，以获得稳定表达荧光素酶的细胞株。

3.添加荧光素底物
将荧光素底物添加到细胞培养基中，荧光素底物会被荧光素酶催化产生荧光信号。

荧光素底物的选择可以根据实验需要进行调整，常用的荧光素底物有Luciferin和Coelenterazine等。

4.测定荧光信号
使用荧光显微镜或荧光分析仪等设备测定荧光信号。

荧光信号的强度反映了荧光素酶的活性，从而反映了目标基因的表达水平。

荧光信号的测定需要注意控制实验条件，如荧光素底物的浓度、荧光素酶的表达水平等。

5.数据分析
根据荧光信号的强度，可以计算出目标基因的表达水平。

数据分析需要注意控制实验组和对照组的一致性，以确保实验结果的可靠性。

荧光素酶报告基因实验是一种简单、快速、灵敏的基因表达检测方法，广泛应用于分子生物学、细胞生物学、药物筛选等领域。

在实验过程中，需要注意控制实验条件，以确保实验结果的准确性和可靠性。

双荧光素酶报告载体构建原理

这种“双重监测”法可以避免实验中出现误差。就好像你做饭的时候，有时候光看色香味，咱们不太能确定是放了多少盐、糖。可是，如果有两个人同时在厨房里看，一个管味道，一个管色彩，那结果肯定更靠谱嘛。实验也一样，两个不同的荧光素酶就能互相印证，减少不必要的“意外”，从而更清晰地了解细胞内的动态变化。
这时候你就会想，咱们要怎样才能让这两个荧光素酶同时在细胞里工作呢？嘿嘿，这就得用到一些小技巧了。通常，科学家们会把这两个荧光素酶基因分别放在不同的表达框架里，而这些框架则是通过某些“电路”相互连接。像什么启动子啊、增强子啊，这些东西就像调皮的小齿轮，默契配合才能让这两种荧光素酶有效运作。你要知道，光是把基因放进去可不行，得看它怎么在细胞里被“启动”，才真正发挥作用。
咱们要构建这样一个载体，就要把荧光素酶的基因放进一个载体里，这个载体其实就是个容器，可以让基因在细胞里面“生根发芽”。至于为什么要双荧光素酶呢？嘿，别急，接下来就有得说了。咱们知道，科学研究里面有时候得验证实验结果，看看是不是跟我们预期的一样。于是，就出现了“双荧光素酶”的想法。说白了，就是通过两种不同的荧光素酶来做双重标记。如果实验一开始你在某个细胞里面插入了第一个荧光素酶基因，然后你观察到它发光，咱们就知道这个细胞在做什么；但如果你再加上第二个荧光素酶基因，那不就更有趣了吗？你就可以对比，看看它们在同一细胞里各自发挥了什么作用。
这种原理的构建方法很像ຫໍສະໝຸດ 我们玩拼图游戏的时候，我们要把不同的碎片拼接在一起，最后形成一幅完整的图画。而这个“双荧光素酶报告载体”，就是这个拼图的核心部分。咱们得知道什么是“荧光素酶”，它就是一种能够在特定条件下发光的酶。你想象一下，就像我们常看到的萤火虫，它们的身体里就含有荧光素酶。只不过在科学研究里，咱们不是让萤火虫飞来飞去，而是让这些酶在细胞里工作，然后通过它发出来的光来告诉我们一些信息。

荧光素酶报告载体

荧光素酶报告载体
荧光素酶是一种广泛应用于生物学和医学研究中的分子探针，
可以用于检测生物学样品中特定的化合物或分子的表达和活性。

在荧光素酶应用的过程中，报告载体的选择和设计对于检测结果
的敏感度和准确性起着决定性的作用。

一、化学特性
荧光素酶因其高度特异性和灵敏度而被广泛应用，其基本结构
为蛋白质和荧光素。

荧光素酶与荧光素底物发生作用时，底物分
子被酶催化分解，从而释放光子并产生强烈的荧光信号。

荧光素
酶的荧光信号可以通过荧光显微镜或荧光光度计进行定量测量，
因此可用于监测细胞信号通路的激活、病毒感染状态、DNA合成
以及酶促反应等。

二、报告载体设计
荧光素酶报告载体是一种基因转染载体，在这种载体中，荧光
素酶基因与目的基因被连接在一起，当目的基因被激活或表达时，荧光素酶基因也随之激活或表达，从而产生荧光信号报告。

常用
的载体包括质粒和病毒载体等，具体的载体设计应根据目的基因
和实验需求进行筛选和修改。

三、应用案例
荧光素酶报告载体在生物学和医学研究中具有广泛的应用价值。

例如，在癌症研究中，荧光素酶报告载体可用于研究肿瘤细胞增
殖的机制和信号通路；在免疫学研究中，荧光素酶报告载体可用
于检测免疫细胞活性和细胞因子释放的水平；在基因治疗中，荧
光素酶报告载体可用于监测基因修饰效果和治疗效果。

综上所述，荧光素酶报告载体是一种重要的分子探针，其设计
和选择对于实验结果的准确性和敏感性具有关键性的影响。

在未
来的研究中，将会有更多的载体被设计和应用，并为生命科学和
医学领域带来更多的技术突破和创新。

基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及应用

基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及应用韩芙蓉;王令;徐坤;张智英;王昕【摘要】报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效，并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集基因组修饰的阳性细胞克隆，而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。

基于非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA双链断裂(Double strand breaks，DSBs)后，经过优化最高也只有2/3的概率实现报告基因的修复；而单链退火(Single strand annealing，SSA)修复机制在引入DSBs后，理论上可以实现报告基因100%的修复，具有更高的灵敏度，有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测，为基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。

本研究设计并构建了3套基于 SSA 修复机制的双荧光报告载体系统，并应用mRFP-eGFP系统检测了3对ZFNs的有效活性，其活性检测结果分别为8.9%、9.3%和5.0%，该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。

%Reporter vector system has become an important method for measuring activity of specific nucleas-es because of its fast construction, simple modification, easy operation, economic effectiveness as well as its role in enriching positive cells with genomic modification through mediating screen of specific nucleases positive cells. After in-troducing double strand breaks (DSBs), a reporter system based on non-homologous end joining (NHEJ)-mediated repair can only repair maximally two thirds of reporter genes after optimization, while single strand annealing (SSA)-mediated repair can repair all reporter genes theoretically which has higher sensitivity and facilitates the de-tection ofspecific nuclease with low activity and provides an effective way to detect specific nuclease activity in genome modification studies. In this study, we designed and constructed three sets of dual-fluorescence reporter systems based on SSA repair mechanism and applied the mRFP-eGFP system in measuring the effective activity of three pairs of ZFNs, which was 8.9%,9.3%and 5.0%, respectively. Our study provides an effective way to detect the activity of nucleases.【期刊名称】《遗传》【年(卷),期】2015(000)010【总页数】8页(P1053-1060)【关键词】SSA;双荧光报告载体系统;特异性核酸酶【作者】韩芙蓉;王令;徐坤;张智英;王昕【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100;西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100; 陕西理工学院生物科学与工程学院，汉中 723000;西北农林科技大学动物科技学院，杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100;西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100【正文语种】中文基因组编辑的传统方法有自发同源重组和逆转录病毒介导法，但应用效果不佳。