荧光定量PCR引物设计要求
荧光定量PCR引物设计
荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件：beacon Designer有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。
个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高，适当降低反响退火温度，看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。
看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，〔1〕设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率〔2〕尽量跨越含子，这样可以保证检测有无基因组污染〔3〕两条引物的Tm值不要相差太大〔4〕产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。
.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。
保证在产物Tm80以上〔一般T m=80以下的峰都是引物二聚体〕，对于水稻等GC含量比拟高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。
如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与参产物的Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。
〔3〕相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大〔当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在一样位置或者比产物峰还高的错配就死了〕，引物的3'端不要有错配。
〔5〕一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右适宜的位置手动搜索有没有适宜和它配对的评分也比拟高的引物，一般5分钟之可以搞定一个基因。
实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。
最好位于编码区5'端的300-400bp 区域，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。
荧光定量引物设计原则
荧光定量引物设计原则 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020引物的具体设计要求：1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构（自由能小于mol）。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。
假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 有专门针对荧光的。
用染料做荧光定量不如探针特异性好，具体操作一下就知道了！可以多定几对引物，免得摸条件浪费时间和金钱！试剂很贵的！荧光定量PCR引物设计原则设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。
引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。
设计引用有一些需要注意的基本原理：① 引物长度一般引物长度为18~30碱基。
总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。
实时荧光定量PCR国际化标准(二)2024
实时荧光定量PCR国际化标准（二）引言概述实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物研究等领域。
为了实现方法和数据的国际标准化，国际上制定了实时荧光定量PCR的国际化标准。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的主要内容。
正文内容一、技术要求1.1 具备规范的实验室条件，包括洁净、无尘、无RNA酶污染的实验环境。
1.2 使用具有良好稳定性、一致性和可追溯性的荧光探针和引物。
1.3 验证实验室使用的仪器设备，确保其精确、重复性和灵敏度符合国际标准。
二、质量控制2.1 建立质量控制体系，包括核酸提取、反转录、荧光探针标记等各个环节的质量控制。
2.2 使用合适的内部参照基因或内质控，用于验证试剂盒、仪器设备和实验操作的稳定性和可靠性。
2.3 建立监控样本和质控品的库存管理系统，确保其有效性和可追溯性。
三、方法标准化3.1 设计标准化的实验操作流程，包括样品制备、反转录、PCR 扩增和数据分析等。
3.2 使用适当的PCR引物和荧光探针，根据模板序列设计合理的引物和探针。
验证其特异性和灵敏度。
3.3 建立标准曲线和基准值体系，用于测定目标基因的定量结果，并进行结果的准确性评估。
四、数据分析和结果解释4.1 使用统一的数据分析软件，对实时荧光定量PCR的原始数据进行操作和分析。
4.2 建立标准化的数据处理流程，包括定量结果的计算、统计学分析和差异性评估。
4.3 结果的解释应基于严谨的科学依据和合理的统计学方法，避免主观性和片面性的评价。
五、结果报告和数据共享5.1 根据实验结果的重要性和可信度，及时撰写实验报告，并以适当的形式进行存档和备份。
5.2 结果报告应明确标注实验过程、方法参数、核心数据和评估结果，以便他人能够验证和复现实验结果。
5.3 鼓励将实验结果和数据共享，提供底层数据和分析工具的访问权限，促进实时荧光定量PCR的进一步发展和应用。
荧光定量PCR引物设计
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Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围， 则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 2 设计引物
3 qPCR引物特异性验证
1、 进入网页： 2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
The end ! Thank you!
荧光定量PCR引物设计（SYBR@Green）
引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域
1. NCBI Primer blast
选择1 - 无所谓 选择2 - 必须跨不同Exon 选择3 - 可以不跨Exon
勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron （当以基因组DNA为模板时）
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Primer blast
勾选时表示要检测引 物的特异性
填入要比较的物种 （可输入通用名，如 human/mouse/rat/rab bit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
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pcr引物设计的基本要求
pcr引物设计的基本要求
PCR（聚合酶链式反应）引物设计的基本要求如下：
1. 引物长度：PCR引物通常由20至30个碱基对组成，较短的引物可以提高PCR反应的有效性。
2. 引物富含GC碱基：GC碱基对形成的氢键比AT碱基对更强，因此引物中富含GC碱基可以提高PCR引物与模板DNA 的互补性。
3. 引物的熔解温度（Tm）：引物的Tm值应该在50～65°C之间，以确保合适的PCR反应条件。
4. 引物特异性：引物应该具有高度的特异性，能够区别目标序列与其他可能存在的类似序列。
5. 避免互相补合：引物应该避免互相补合，以防止引物之间的非特异性扩增。
6. 引物3'末端应该避免由于引物自身的互补性引起的引物二聚体和剪切子聚合物。
7. 引物的末端应该避免带有互补性，以避免在扩增反应中自身剪切。
以上是PCR引物设计的一些基本要求，不同实验目的下可能还会有其他特殊要求。
荧光定量PCR引物设计要求
荧光定量PCR引物设计要求
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引物设计
荧光定量PCR引物的具体设计要求：
1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。
假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
16.TM值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。
用染料做荧光定量不如探针特异性好，具体操作一下就知道了!
可以多定几对引物，免得摸条件浪费时间和金钱!试剂很贵的!。
荧光定量pcr引物设计原理
荧光定量pcr引物设计原理荧光定量PCR（qPCR）引物设计的原理是基于PCR技术和荧光探针技术相结合。
PCR是一种从一小段DNA模板扩增特定DNA序列的技术，而荧光探针则是一种特殊的DNA探针，带有荧光物质，可以用来检测PCR反应过程中特定DNA序列的累积量。
荧光定量PCR的引物设计主要包括前向引物（forward primer）和反向引物（reverse primer）。
这两个引物被设计成具有与目标序列的两个不同区域互补的DNA序列。
在PCR反应中，这两个引物会结合到模板DNA上，并在酶的催化下引发DNA链的扩增。
为了确保引物能够选择性地结合到目标序列，需要注意以下几个原则：1. 引物长度：引物的长度通常在18-25个碱基对之间。
引物过短可能导致非特异性结合，引物过长则可能导致扩增效率降低。
2. GC含量：引物的GC含量通常在40-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物结合不稳定或影响扩增效率。
3. 互补性：前向引物和反向引物应该在目标序列的不同位点，且二者之间不应有显著的互补性。
否则将导致引物之间的非特异性结合和产生副产物。
4. 特异性：引物应该能够特异性地结合到目标序列，而不结合到其他非目标序列。
为了确保特异性，可以使用计算软件进行序列比对和BLAST分析。
此外，为了进行荧光定量PCR，还需要引入荧光探针。
荧光探针是一种特殊设计的DNA或RNA探针，通常带有一个荧光物质和一个荧光耦合的荧光素（quencher）。
在PCR反应中，荧光探针与目标序列的靶标区域互补结合。
当荧光探针结合到目标序列时，荧光物质和荧光素之间的空间距离会增大，导致荧光物质释放出荧光信号。
这个信号可以被PCR仪器检测到，并用于测量PCR反应过程中目标序列的累积量。
总之，荧光定量PCR引物设计需要考虑引物的长度、GC含量、互补性和特异性。
同时，还需要设计荧光探针来检测目标序列的累积量，以实现定量PCR的功能。
qPCR引物设计
填入要比较的物种 （可输入通用名，如 human/mouse/rat/rab bit 当需要同时比较多物 种时，点击”Add more organisms”
勾选”show results in a new window”--》点击”Get Primers”
Primer blast – 结果
qPCR引物设计
荧光定量PCR
荧光定量PCR引物设计（SYBR@Green）
引物要求： （1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率 （2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染 （3）两条引物的Tm值不要相差太大 （4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。 （5）避开保守区域
3 qPCR引物特异性验证
1、 进入网页： 2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 1 搜索引物保守序列（与转录组比较）
黄色区域为相对保守序列，设计引物是要尽量避开
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 2 设计引物
1. NCBI Primer blast
NCBI 设计引物网址：
Primer blast
输入基因号或FASTA序列
定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围， 则可填入
Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于测量DNA分子数量的技术。
在进行定量PCR实验时，合理设计引物和探针非常重要，下面将探讨一些定量PCR引物和探针设计的原则。
1.引物设计原则：1.1引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物可能导致扩增效率降低。
1.2引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能导致非特异性扩增。
1.3引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间，可以通过计算引物序列的碱基组成和长度来预测引物的Tm值。
1.4引物的特异性：引物的特异性是设计引物时最关键的考虑因素之一、引物的特异性可以通过检查与该引物匹配的靶标序列在基因组或转录组中的唯一性来评估。
可以使用生物信息学工具，如BLAST（基本局部序列比对）来分析引物的特异性。
此外，还可以使用引物的3'末端碱基序列的特异性来提高引物的特异性。
2.探针设计原则：2.1探针的长度：探针的长度一般在20-30个碱基对之间。
2.2探针的熔解温度（Tm）：与引物类似，探针的Tm值也应在50-60摄氏度之间。
2.3探针的特异性：与引物一样，探针的特异性也是设计探针时需要考虑的重要因素。
探针的特异性可以通过生物信息学工具来分析，如BLAST。
此外，还可以设计探针的3'末端碱基序列来提高其特异性。
2.4探针的化学修饰：在实验中，通常使用荧光标记的探针来实现定量PCR。
探针可以通过荧光基团，如FAM、VIC、HEX等进行标记。
此外，还可以在探针的两端引入磷酸酯键或磷酸二酯键等化学修饰，以提高探针的稳定性和特异性。
总结起来，定量PCR引物和探针的设计需要考虑引物长度、GC含量、熔解温度和特异性等因素。
在设计引物和探针时，可以使用生物信息学工具来分析其特异性，并通过化学修饰来提高其稳定性和特异性。
荧光pcr引物设计要求
荧光PCR引物设计要求主要包括以下几个方面：
引物长度：一般为15-30碱基之间，具体取决于所使用的聚合酶和上下游引物的相对位置。
引物特异性：引物应具有特异性，能够特异性的扩增目的基因，避免与基因组DNA或cDNA中的其他序列发生非特异性结合。
引物GC含量：引物的GC含量应适当，一般在40%-60%之间，以保持PCR反应的稳定性。
引物3’端：引物的3’端不应是连续的嘌呤或嘧啶，以避免引物自扩增和增加PCR产物。
引物间互补性：引物之间不应存在互补序列，以避免引物二聚体的形成。
引物位置：上游引物应位于目的基因的保守区内，下游引物应位于目的基因的变异区内，以保证PCR产物的大小合适。
引物温度：上下游引物的Tm值应接近，以使复性温度最佳。
一般而言，PCR产物大小为85-300bp。
引物修饰：根据需要，可以对引物进行修饰，如荧光标记、生物素标记等，以提高PCR 检测的灵敏度和特异性。
避免使用密码子简并性高的区域：引物设计的区域应尽量避开密码子具有较高简并性的区域，以免影响PCR产物特异性。
总的来说，荧光PCR引物设计需要综合考虑以上因素，以达到最佳的扩增效果。
同时，还需要通过实验验证引物的特异性、灵敏度和重复性等指标，以确保荧光PCR检测的准确性和可靠性。
pcr引物设计的基本要求
PCR引物设计的基本要求PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因测序、基因克隆、突变分析等领域。
PCR引物是PCR反应中的关键组成部分，其设计合理与否直接影响PCR反应的成功与否。
下面将介绍PCR引物设计的基本要求。
引物长度和碱基组成PCR引物的长度一般应在18至30个碱基之间，最好控制在20至25个碱基。
过短的引物容易引起非特异性扩增，而过长的引物则会影响PCR反应的效率。
此外，引物的碱基组成也是需要考虑的因素。
引物的GC含量应在40%至60%之间，过高或过低的GC含量可能会导致PCR扩增的特异性下降。
引物序列的选择引物序列的选择应能特异性地与待扩增的DNA片段结合，避免与其他非目标DNA 相互结合。
为了实现引物的特异性，我们可以采用以下策略： - 使用特异性引物：合理设计引物序列，确保其只能与目标序列配对。
- 避免引物间的互补性：引物间的互补性会导致二次结构的形成，影响PCR的效率和特异性。
在引物设计时，应避免引物间存在互补性。
引物的熔解温度引物的熔解温度是指引物与模板DNA结合和解离的温度。
引物对应的熔解温度应相似，避免其中一个引物比另一个引物先解离，导致PCR扩增效率降低。
一般来说，引物的熔解温度应在50℃至70℃之间，熔解温度应尽量接近，通常相差不超过5℃。
引物的其他要求除了以上的基本要求外，还有一些其他需要考虑的因素： - 引物设计时避免富含多个同样的碱基，以免引发偏位扩增。
- 引物两端避免富含GC二聚体和AT二聚体，以避免引物之间的二级结构影响PCR效果。
- 引物两端可以设计一些匹配模板上的特异性区域，以增强引物的特异性。
在设计PCR引物时，需要根据实验要求仔细考虑上述基本要求。
一个好的引物设计能够提高PCR反应的特异性和效率，确保实验结果的准确性和可靠性。
以上为PCR引物设计的基本要求，希望对您有所帮助！。
荧光定量PCR技术的使用中常见问题
荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。
然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。
一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。
引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。
引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。
- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。
- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。
- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。
2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。
这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。
二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。
选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。
TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。
2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。
以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。
- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。
三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。
其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。
荧光定量引物设计原则
荧光定量引物设计原则1. 引子设计的基础知识引子（或称引物）在荧光定量PCR中就像是厨师做菜时用的调料，缺了它，成品可就大打折扣了。
想象一下，您要做一碗美味的番茄汤，调料不到位，味道就差了。
荧光定量引物的设计也是这个道理，必须精细入微，才能达到预期的效果。
引物的作用就是帮助你找到特定的DNA片段，进而进行放大和检测。
简单来说，引物的好坏直接影响到实验结果的准确性和灵敏度。
1.1 引物的基本特性好的引物一般要有合适的长度，通常在18到25个核苷酸之间，太长了容易出现非特异性结合，太短了则不容易稳定地附着在目标DNA上。
简而言之，就是“短小精悍”才行。
另外，GC含量也是个关键因素，通常在40%到60%之间为佳。
GC含量高的引物会更稳定，因为GC配对有三条氢键，而AT配对只有两条，这就像是把你的“火锅”加了足够的底料，汤才好喝嘛！1.2 特异性与灵敏度引物设计的特异性就好比是你的探险指南，指引你找到真正的“宝藏”，如果不够特异，那你可就可能挖错地方，浪费时间和精力。
在设计引物时，要确保它能专门结合到目标序列上，而不会去“攀附”那些不相关的序列。
灵敏度则是另一回事，好的引物要能在低浓度的DNA样本中也能成功扩增，正所谓“无中生有”，有时甚至要能“柳暗花明又一村”。
2. 设计原则好的引物设计有一些原则，咱们来聊聊那些“黄金法则”。
2.1 避免二聚体在设计引物的时候，要特别注意避免二聚体的形成。
想象一下，你和朋友一起玩，“捉迷藏”，你们两个躲在同一个地方，那就很容易被找到了。
在引物设计中，二聚体就像那两个躲在一起的朋友，导致PCR失败。
所以，设计时要避免引物之间的互补区域，尽量让它们各自“独立行动”，这样才能最大限度地提高扩增效率。
2.2 合适的熔解温度（Tm）熔解温度（Tm）也是一个重要的参数，简单说就是引物在什么温度下才能牢牢地结合到目标DNA上。
通常，前引物和后引物的Tm值要相近，这样可以确保它们能在相同的温度下“工作”，就像两个舞者在同一个节奏下跳舞，才不会出现“踩脚”的情况。
定量PCR引物设计原则
定量PCR引物设计原则定量PCR是一种准确测量目标序列在样本中的数量的分子生物学技术。
与定性PCR不同，定量PCR能够提供目标序列的数量信息，因此在许多实验和临床应用中具有重要意义。
在进行定量PCR时，引物的设计是非常重要的因素之一、下面是一些定量PCR引物设计的原则：1.引物长度：引物的长度通常在18-25个碱基对之间。
较短的引物容易形成非特异性产物，而较长的引物则往往会降低PCR的效率。
2.引物序列选择：引物的序列应尽量选择在目标序列中的特异性区域，以确保引物能够特异性地结合目标序列而不结合其他非特异性序列。
可以通过比对目标序列与相关序列数据库来寻找特异性区域。
3.引物的GC含量：引物的GC含量通常应在40-60%之间。
较高的GC含量可以增加引物与目标序列的特异性结合，但同时也会增加引物之间的二聚体形成；较低的GC含量则可能会导致较差的引物与目标序列的匹配。
4.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度是指引物和目标序列形成稳定双链结构的温度。
引物的Tm应该尽可能接近PCR反应的最佳温度，一般在50-65摄氏度之间。
可以使用在线工具来预测引物的Tm值。
5.引物之间的互补性：引物之间的互补性会导致引物二聚体的形成，从而降低PCR效率。
因此，在设计引物时，应该避免引物之间互补性的存在。
6.引物的扩增效率：在定量PCR中，引物的扩增效率是非常重要的。
扩增效率低的引物会导致不准确的目标序列定量结果。
可以通过序列分析或前期实验来评估引物的扩增效率，并选择高效的引物进行反应。
7.引物与非特异性产物的区别：引物设计时应尽量避免与非特异性产物的区域重叠，以减少非特异性扩增的可能性。
可以通过序列比对和预测工具来评估引物与非特异性产物的区别。
8.引物的检测精度：定量PCR的精度取决于引物的特异性。
应尽量选择能够特异性地放大目标序列的引物，以避免误差的积累。
总之，定量PCR引物的设计原则是尽可能选择特异性序列作为目标，并且要注意引物长度、GC含量、熔解温度、互补性、扩增效率、与非特异性产物的区别以及检测精度。
定量PCR引物探针设计原则
定量PCR引物探针设计原则1.引物长度：最好控制在18-25个碱基对之间。
过短的引物会导致特异性降低，而过长的引物则会增加杂交的机会，影响PCR的特异性。
2.引物序列：引物应与目标基因序列高度匹配，避免引物与非特异性DNA结合。
引物的GC含量应在40-60%之间，以确保适当的结合力。
3.引物互补性：引物设计时，互补性不应超过3个碱基对。
互补性太高可能会导致杂交产物增多，影响PCR的特异性。
4.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）应在55-65°C之间。
Tm值过高可能导致引物与非特异性DNA杂交，而Tm值过低可能导致引物无法精确结合目标DNA。
5.引物的位置：引物应设计在目标基因的保守区域，避免设计在多态性位点或重复序列区域。
1.引物-探针互补性：引物和探针应该具有很高的互补性，以确保探针与引物结合后能够产生一个稳定的引物-探针结合物。
2.探针设计：探针通常由一个荧光染料和一个QSY抑制剂构成。
荧光染料的选择应是稳定的、不受PCR反应条件的影响的。
QSY抑制剂充当了探针的标记基团，它通过修饰荧光染料对荧光信号进行猝灭。
3.探针-引物适配性：探针和引物之间应该是完全互补的，以确保引物和探针都能够准确结合目标DNA，并且防止任何非特异性杂交的发生。
4.简并位点：在设计探针时应避免引物和探针设计在简并位点上，这样可以确保在PCR过程中特异性扩增。
5.荧光信号强度：探针设计时还应考虑荧光信号的强度。
一般而言，较强的荧光信号会导致更高的检测灵敏度，但较低的信号可能会增加误差。
总而言之，定量PCR引物和探针的设计需要遵循一系列原则，以确保可靠性和准确性。
这些原则包括引物长度、序列、互补性和Tm值的控制，引物的位置选择以及荧光染料和QSY抑制剂的合理选择和设计。
通过遵循这些原则，可以提高定量PCR的特异性和灵敏度，并准确测量样本中的目标基因表达水平。
荧光定量PCR(qPCR)对基因表达的分析
荧光定量PCR（qPCR）对基因表达的分析一、实验试剂SYBR Green premix（Takara，RR420A）二、试验设备和材料无RNase的离心管、PCR管、枪头。
三、操作步骤（一）引物设计原则（1）设计引物的长度一般为18–28个核苷酸。
（2）扩增产物长度80-150 bp最好，最长是300 bp。
（3）避免重复核苷酸延伸段。
（4）目标为50% GC含量，有助于防止错配稳定化。
（5）选择Tm值匹配的引物（相差在5°C范围内），60℃左右最好。
（6）避免一个Assay中采用的所有引物之间以及各引物内出现序列互补。
（二）总RNA提取（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，9767）准备工作：Buffer RL中加入50×DTT；Buffer RWB中加入无水乙醇；配制70%DEPC乙醇。
1. 动物培养细胞的 RNA 提取（1）细胞的裂解。
①倒出培养液，使用 1×PBS清洗一次。
②向培养细胞中加入适当量（Table 1 中推荐的使用量）的裂解 Buffer RL（使用前请确认已加入 50×DTT Solution），水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落。
（6 孔细胞培养板每孔加入 350μL）③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
（2）裂解液室温静置2 min。
注：对于基因组含量较多的材料或者材料起始量较大时，可以直接按步骤 7 进行（否则 DNA 含量过高可能造成 gDNA Eraser Spin Column 堵塞），如基因组含量较低或材料起始量较少时，可以按步骤 3-6 进行。
（3）将gDNA Eraser Spin Column放到2 mL 的Collection Tube（试剂盒提供）上。
（4）将裂解液转移入到gDNA Eraser Spin Column中。
荧光定量PCR引物设计
荧光定量PCR引物设计1.靶基因序列选择：首先，需要选择靶基因的序列。
基于目标基因的功能和研究目的，可以选择编码区、非编码区或拷贝数多的部分作为靶基因序列。
同时，需要确保选择的靶基因序列在目标样品中具有适当的表达量。
2.引物长度：荧光定量PCR引物一般设计为20-30个核苷酸长，较短的引物长度可以提高反应的特异性和效率。
引物序列末端应避免过多的二聚体形成，为此通常会避免引物末端的连续相同碱基序列。
3.引物序列选择：引物序列的选择对荧光定量PCR引物设计至关重要。
具体来说，引物序列应遵循以下几个原则：(a)引物互补性：引物序列应该与模板DNA的互补序列完全匹配，以确保引物与模板的特异性结合。
(b)GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。
高GC含量有助于提高引物与模板DNA的互补性，但过高的GC含量可能导致二聚体形成和偏爱结合到AT丰富区域。
(c)引物交叉杂交：引物序列应避免与其他非特异模板DNA序列的交叉杂交，以防止假阳性结果的产生。
(d)引物长度和Tm值：引物的长度和熔解温度（Tm）应该适当。
较长的引物长度和高Tm值可以提高引物与模板DNA的特异性，但过长的引物可能影响PCR反应的效率。
4.引物间的距离：在设计荧光定量PCR引物时，引物间的距离也要考虑。
一般情况下，引物之间的距离应保持在100-200个碱基对之间，以确保引物能够同时与目标序列结合。
5.引物校正：荧光定量PCR使得可以通过相对或绝对定量来测量靶分子的数量。
为了实现准确的定量，荧光定量PCR反应中通常需要一个内部引物或基准品来作为校正。
内部引物可以校正PCR反应过程中的变异性和效率差异，提高定量结果的准确性。
总之，荧光定量PCR引物设计需要综合考虑靶基因序列的选择、引物长度和序列的合适性，以及引物间的距离和校正方法的选择等因素。
合理设计的引物可以提高荧光定量PCR的特异性和效率，实现准确的分子生物学分析结果。
PCR和定量PCR的引物和探针设计
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）和定量PCR（实时荧光定量聚合酶链反应）是现代分子生物学中常用的实验技术，用于扩增和检测DNA序列。
在 PCR和定量 PCR 中，引物（primers）和探针（probes）的设计是非常重要的，因为它们直接影响到实验的灵敏度和特异性。
引物是一对短的DNA分子，通常由15-30个核苷酸组成，它们会被限制性酶切割出位于目标序列两端的DNA片段。
引物的设计需遵循以下几个原则：1.引物的碱基组成：引物应具有合适的碱基组成。
GC含量较高的引物有更强的互补性和比特性，但也更容易形成二聚体，影响PCR反应的特异性和效率。
通常引物的GC含量应在40%-60%之间。
2.引物的长度：引物的长度应在18-28个碱基对之间。
引物过短会导致扩增产物的非特异性，引物过长会降低扩增效率。
3. 引物的 Tm 值： Tm 值（熔解温度）是指引物与模板 DNA 结合时解链的温度。
引物的 Tm 值应保持一致，一般在55°C - 65°C 之间。
在设计扩增子（amplifier）时，引物的 Tm 值差异应在1°C 以内，以确保扩增的特异性。
探针是一种特殊的分子，它包含一个与目标序列完全互补的引物序列和一个荧光染料分子。
探针的设计需遵循以下几个原则：1. 荧光染料的选择：选择一个与实验设备所能感测的波长相适应的荧光染料。
常见的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、荧光素异硫氰酯（FITC）以及羧基甲基罗damine（ROX）等。
2. Quencher 的选择：设定探针的Quencher。
一般使用的Quencher是BHQ1，或者参考其他文献上的Quencher的讯息。
3.引物和探针的序列：引物和探针的序列应与目标序列完全互补。
引物和探针的设计应尽量避免任意位置出现连续的鸟嘌呤（G）或者鸟嘧啶（C），以避免互结和三聚体的形成。
4.引物和探针的位置：引物和探针的位置非常重要。
定量PCR 引物、探针设计原则
精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。
当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。
一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→的DNA保持GC典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。
整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
PCR反应引物设计基本要求
PCR反应引物设计基本要求PCR反应引物设计基本要求PCR反应中有两种引物，即 5'端引物与 3'端引物。
5'端引物是指与模板 5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指与模板 3'端序列互补的寡核苷酸。
对引物的基本要求有：1. 引物的长度过短会影响 PCR的特异性，要求有 16-30bp，因为4^16=4.29x10^9，已⼤于哺乳动物基因组 3x10^9bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过 Taq DNA聚合酶的最适温度(74度)，亦会影响产物的特异性。
2. G+C的含量⼀般为 40％-60％。
3. 四种碱基应随机分布，不要有连续 3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。
尤其是引物 3'端，不应有连续 3个G或 c，否则会使引物与核酸的 G或 c富集区错误互补，⽽影响 PCR的特异性。
4. 引物⾃⾝不应存在互补序列⽽引起⾃⾝折叠，起码引物⾃⾝连续互补碱基不能⼤于 3bp。
5. 两引物之间不应互补，尤其是它们的 3'端不应互补。
⼀对引物之间不应多于 4个连续碱基有互补性，以免产⽣引物⼆聚体。
6. 引物与⾮特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致⾮特异性扩增。
7. 引物 3'端是引发延伸的点。
因此不应错配。
由于 ATCG引起错配有⼀定规律，以引物 3'端 A影响最⼤，因此，尽量避免在引物 3'端第⼀位碱基是 A。
引物 3'端也不要是编码密码⼦的第三个碱基，以免因为密码⼦第 3位简并性⽽影响扩增特异性。
8. 引物 5'端可以修饰，包括加酶切位点，⽤⽣物素、荧光物质、地⾼⾟等标记，引⼊突变位点，引⼊启动⼦序列，引⼊蛋⽩质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑软件进⾏指导。
反应体系中，引物浓度⼀般要求在 O.1-0.5µmol之间。
浓度太⾼，容易⽣成引物⼆聚体，或⾮特异性产物。
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荧光定量PCR引物设计要求
荧光定量PCR引物的具体设计要求：
1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于
9KJ/mol。
可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。
假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
16.TM值在58-62度之间。
17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。
ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAA GTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGG CTGGGGC TGACTTTGTGGTC GAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAA GGAATACACACCCGAGC TTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGC CAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCAC TCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'
5' GACCACAAAGTCAGCCCCAG3'
ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAA GTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGC TGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAA GGAATACACACCCGAGC TTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGC CAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGG CTGCCAC TCAAAAGACTGTTG ATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'
5' CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG3'
5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3'
5' GCACAGTTGTCA TAAGACCCTCAAC 3'
5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3' 5' GACCCTCAACAATGCCAAACC 3'
5' CAACGAGAAGGAATACACACC 3' 5' ACCCTCAACAA TGCCAAAC 3'
TKGAPDH内参qRT-PCR引物的设计如下：
1.119bp
ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTAT GACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGT GAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGAC TTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCA AAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGT GTCAACGAGAAGGAA TACACACC CGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAG GTCATAAACGACAG GTTTGGCATTGTTGAGGGTCT TATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAA AAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
TKGAPDH-qF 5' GTCAACGAGAAGGAATACACACC3'
TKGAPDH-qR 5' AGACCCTCAACAATGCCAAAC3'
2. 156bp ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTAT GACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGT GAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGAC TTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCA AAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAAGGAA TACACACCCGAGC TTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAG GTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTAT GGCTGCCACTCAA AAGACTGTT GATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
TKGAPDH-QF 5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'
TKGAPDH-QR 5' AACAGTCTTTTGAGTGGCAGCC3'。