荧光定量PCR引物设计要求

荧光定量PCR引物设计要求

荧光定量PCR引物的具体设计要求：

1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。

2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。

3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。

4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳。

5.碱基要随机分布，尽量均匀。

6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8.引物5′端可以修饰。

9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。

10. 引物3′端要避开密码子的第3位。

11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于

9KJ/mol。

可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。

12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.

13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。

14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。

15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。

16.TM值在58-62度之间。

17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。

ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAA GTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGG CTGGGGC TGACTTTGTGGTC GAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAA GGAATACACACCCGAGC TTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGC CAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCAC TCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG

5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'

5' GACCACAAAGTCAGCCCCAG3'

ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAA GTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGC TGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAA GGAATACACACCCGAGC TTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGC CAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGG CTGCCAC TCAAAAGACTGTTG ATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG

5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC3'

5' CAACAGTCTTTTGAGTGGCAG3'

5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3'

5' GCACAGTTGTCA TAAGACCCTCAAC 3'

5' GAGAAGGAATACACACCCGAGC 3' 5' GACCCTCAACAATGCCAAACC 3'

5' CAACGAGAAGGAATACACACC 3' 5' ACCCTCAACAA TGCCAAAC 3'

TKGAPDH内参qRT-PCR引物的设计如下：

1.119bp

ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTAT GACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGT GAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGAC TTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCA AAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGT GTCAACGAGAAGGAA TACACACC CGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAG GTCATAAACGACAG GTTTGGCATTGTTGAGGGTCT TATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAA AAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG

TKGAPDH-qF 5' GTCAACGAGAAGGAATACACACC3'

TKGAPDH-qR 5' AGACCCTCAACAATGCCAAAC3'