烟草遗传转化实验
烟草遗传转化实验
烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。
实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。
配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。
实验材料：烟草叶片愈伤组织。
实验方法：1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。
打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。
3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。
4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。
每次更换新鲜培养基时称取重量。
5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。
6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
烟草遗传转化实验实验目的烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。
本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。
实验原理根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。
农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
转化技术体系, 为分子生物学和植物基因工程的研 究提供较好的技术基础。
1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 植物 材料 四 倍 体烟 草 ( Nicotiana tabacum ) 品系 NT12 的无 菌 试 管 苗, 以 MS 为 基 本 培 养 基[ 3] , 附加 3% 蔗糖, pH 5. 8, 于 24 e 、自然光下培
平均阳性 植株数 ( 株/ 块)
阳性植株 频率 ( %)
1. 5 cm @ 1. 5 cm
23
7
30. 4
1. 0 cm @ 1. 0 cm
20
11
55. 0
0. 5 cm @ 0. 5 cm
4
2
50. 0
2. 2 预培养对转化率的影响 实验结果表明, 无论是经过 3 d 预培养的烟草
叶盘, 还是 未经预培养而直接 侵染的叶盘, 都约在 1421 d 后从表面创伤处及边缘出现芽点, 并逐渐长 大成为有几片幼叶的小芽。二者的分化时间、再生 芽的频率没有明显差异。所以, 为了缩短转化时间, 烟草叶盘转化可省去预培养。 2. 3 侵染时间对转化率的影响
图 2 部分转基因植株 PCR 检测结果 M: DNAmarker,K- EcoT 14I digest( TakaRa) ;
叶盘法转基因烟草技术
叶盘法转基因烟草技术实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。
二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。
农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。
土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。
这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。
三. 试剂及设备1.试剂：MS培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导Kan：卡那霉素Cb：羧苄青霉素NAA：萘乙酸6-BA：细胞分裂素T1培养基：MS培养基T2培养基：MS培养基+6-BA2.0mg/L+NAA0.5 mg/L+Kan100 mg/L+Cb500 mg/LT3培养基：MS培养基+ Kan100 mg/L+Cb500 mg/L（T2：生长培养基；T3：生根培养基）2.仪器：光照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等四.实验步骤：1 农杆菌培养1）从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3 ml YEB 液体培养基中（Str 25 μg/ml、Rif 50 μg/ml、Kan 80 μg/ml）于恒温摇床上27℃，180 rpm 摇培过夜至OD 600 为0.6-0.8。
2）摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的YEB 培养基中，在与上述相同的条件下培养6 h左右，OD600 为0.2-0.5 时即可用于转化。
或：将按上述方法培养的OD 600 为0.6-0.8 的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000 rpm 离心10 min，去掉上清液，菌体用1/2 MS液体（pH 5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600 为0.2 左右，用于转化。
烟草转化及CoIP方法
CoIP protocol From Guo Siyi烟草转化体系将含有正确构建质粒的阳性农杆菌克隆在YEB 液体培养基中培养过夜，到OD600 约 1.5 左右（大约20h），同时摇菌P19，它能有效抑制植物对外源导入载体表达的沉默效应，提高表达量。
然后收集菌体，5000 rpm 5min 常温离心，将菌体用侵染缓冲液（10 mM MES，100 μM AS-乙酰丁香酮，50 mM MgCl2）重悬，用紫外分光光度仪测定OD600 值；根据实验要求将含有不同载体组合的菌液混合，同时在每一个组合中也加入P19，最终使得每种菌液成分的OD600 在0.8 左右；然后将混合的菌液在28 ℃下以200 rpm 的转速再培养至少3 h，然后注射合适大小的烟草叶片。
尽可能多的注射烟草叶片，并标记下注射的叶片及对应区域；之后用保鲜膜封闭，在暗中培养2 d，然后再转入光下培养2-3 d，并取材在荧光显微镜下观察GFP 的荧光已确定烟草叶片中外源载体的表达情况，视情况取材做后续的实验。
免疫共沉淀（CoIP）将VER2，TaGRP2 与不同的标签蛋白融合如FLAG-VER2，TaGRP2-GFP，将该载体转化农杆菌获得阳性克隆，然后共同用农杆菌侵染的方法转化烟草。
至少设定两组样品：即FLAG-VER2/TaGRP2-GFP 以及FLAG-VER2/GFP。
检测目的蛋白是否表达：用Bradford 法测定提取蛋白的浓度，然后用SDS-PAGE 分离蛋白（15-30 μg protein/lane）做Western Blot 用（WB）标签抗体FLAG，GFP 检测融合蛋白是否在烟草中表达。
并根据WB 的结果估算实验组（FLAG-VER2/TaGRP2-GFP）与对照组（FLAG-VER2/GFP）的蛋白相对表达量。
Pre-clear：（所有步骤尽量在冰上进行）取两份30 μL protein A/G beads 到EP 管中放于冰上，用600 μL 的蛋白提取buffer 重悬beads，4 ℃离心1000 g 1 min。
烟草培养方法以及转基因方法
烟草转基因准备工具：EP管灭菌无菌水Ms培养基75%的酒精（蓝口小瓶）升汞(要回收)1ml枪枪头EP管架计时器一、转基因(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；(4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天。
25℃光照培养20-30天。
MS培养基pH5.8(5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。
(6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。
(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。
侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。
将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。
以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；(9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。
烟草遗传转化实验
实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。
实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。
配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇+3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。
实验材料：烟草叶片愈伤组织。
实验方法：1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。
打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。
3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。
4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。
每次更换新鲜培养基时称取重量。
5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。
6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。
烟草遗传转化实验实验目的烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。
本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。
实验原理根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
烟草CHS基因RNA干扰载体的构建及其遗传转化
78 中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 2013-10，34（5）烟草CHS基因RNA干扰载体的构建及其遗传转化李尊强1,2，杨爱国1，常爱霞1，张长静1，郑吉云1,2，冯全福1*（1.中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）摘要：类黄酮化合物是烟草香气形成的重要前体物质，其形成需要多个调控基因的参与，查尔酮合成酶基因（CHS）是类黄酮物质合成途径中的关键基因，它的突变或沉默可能影响香气物质的形成。
为了探讨CHS基因的下调表达对烟草香气的影响以及为选育优良的高香气品种提供技术，采用GATEWAY技术经BP反应和LR反应将CHS基因片段重组到表达载体pH7GWIWG2(I)上，成功构建了具有反向重复序列的CHS基因的RNAi表达载体，并通过农杆菌介导法转染烟草‘大白筋599’，以期为研究CHS基因在烟叶香气物质方面的作用奠定基础。
经过鉴定，获得24株阳性转基因‘大白筋599’。
关键词：烟草；查尔酮合成酶；CHS；基因；RNAi载体；遗传转化中图分类号：S572.01 文章编号：1007-5119（2013）05-0078-05 DOI：10.3969/j.issn.1007-5119.2013.05.016 Construction of RNAi Vectors of CHS Gene and its Transformation in Tobacco LI Zunqiang1,2, YANG Aiguo1, CHANG Aixia1, ZHANG Changjing1, ZHENG Jiyun1,2, FENG Quanfu1*(1. Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China;2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)Abstract：Flavonoid are important aroma precursors, which are controlled by many regulatory genes. Chalcone synthase gene (CHS), as one of the key gene of the flavonoid pathway, plays an important role in the synthesis of aroma precursors. The function missing or mutation of the CHS would affect the aroma formation. To explore the effects of CHS down regulatory expression and to provide technical information for breeding high aroma tobacco, we constructed the RNAi expression vectors by Gateway technology. Then the vectors were transformed into the ‘Dabaijin599’ by Agrobacterium-mediated method to form basis for further study in the aroma of CHS gene. Thirty of tobacco plants were obtained and 24 of them were identified as transgenic plants.Keywords：tobacco; Chalcone synthase; CHS; gene; RNAi vectors; transformation烟草香气是评价烟叶和卷烟制品内在质量的重要指标[1-2]。
烟草实验实训目的和要求
烟草实验实训目的和要求
烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。
本实验以烟草为实验材料，使同学们了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
烟草叶片，LBA4404质粒载体，摇床，培养皿（带滤纸），移液枪，镊子，手术刀，无菌水。
根癌农杆菌介导转化的方法已经比较成熟，易于在植物细胞和组织培养实验室进行。
具体操作程序如下：
（1）根癌农杆菌质粒的保存：构建好的根癌农杆菌质粒接种在YEP固体培养基上，YEP固体培养基的成分为每100mL含NaCl 0.5g，酵母1 g，水解酪蛋白1g，琼脂1.5g，pH值7.0，在冰箱中冷藏，一个月换一次培养基，保证菌种正常生长。
（2）配制YEP液体培养基：成分同上，只是不添加琼脂，分装于试管中，每试管加入5mL左右的液体培养基，包好后高压灭菌，放置于冰箱中待用。
（3）摇菌：用灭菌后的牙签或者火柴棍等挑出一些菌液，一起放入上述YEP液体培养基中，然后置于振荡器上摇菌16—17h（180r ／min），直至溶液变浑浊，即有大量菌丝长出。
（4）用消毒后的0.5mm打孔器从叶片上切出叶盘，然后将叶盘投入农杆菌悬液中培养5min。
（5）用滤纸吸干多余的菌液，叶片放在MS+6—BA 1.0 mg/L 十IAA 0.1 mg/L培养基上共培养2d，随后转至附加卡那霉素
100mg/L，羧苄青霉素500 mg/L的培养基上筛选培养，（25±1）℃，16h光周期。
（6）2周后分化出卡那霉素抗性芽（应为绿色），从基部将芽切下，转至含100mg/L卡那霉素和500 mg/L羧苄青霉素的MS+0.1 mg/LIAA上生根培养，生根后的植株移入温室内栽培。
《黄花苜蓿MfDREB1和MfDREB1s基因转化烟草的研究》范文
《黄花苜蓿MfDREB1和MfDREB1s基因转化烟草的研究》篇一一、引言黄花苜蓿作为一种重要的农作物，具有丰富的营养价值和生态价值。
近年来，基因工程技术的不断发展为黄花苜蓿的遗传改良提供了新的途径。
本研究以黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因作为研究对象，通过基因转化技术将其导入烟草中，以期提高烟草的抗逆性和耐旱性。
二、材料与方法2.1 材料实验材料包括黄花苜蓿、烟草、MfDREB1和MfDREB1s基因等。
其中，黄花苜蓿为实验材料提供基因资源，烟草作为转化对象进行基因工程改造。
2.2 方法2.2.1 基因克隆与表达载体构建通过PCR扩增和序列测定获得MfDREB1和MfDREB1s基因的序列信息，然后构建表达载体。
2.2.2 烟草的遗传转化采用农杆菌介导法将表达载体导入烟草中，通过组织培养和筛选获得转基因烟草。
2.2.3 转基因烟草的鉴定与分析对转基因烟草进行PCR鉴定和RT-PCR分析，验证基因是否成功导入并表达。
同时，对转基因烟草进行抗逆性和耐旱性分析。
三、实验结果3.1 基因克隆与表达载体构建通过PCR扩增和序列测定成功获得了MfDREB1和MfDREB1s基因的序列信息，构建了相应的表达载体。
经测序验证，表达载体中的基因序列与黄花苜蓿中的基因序列一致。
3.2 烟草的遗传转化采用农杆菌介导法成功将表达载体导入烟草中，经过组织培养和筛选，获得了转基因烟草。
PCR鉴定结果显示，转基因烟草中成功导入了MfDREB1和MfDREB1s基因。
3.3 转基因烟草的鉴定与分析RT-PCR分析表明，转基因烟草中的MfDREB1和MfDREB1s基因得到了表达。
抗逆性和耐旱性分析显示，转基因烟草的抗逆性和耐旱性得到了显著提高。
与未转化的烟草相比，转基因烟草在干旱条件下的生长状况更好，叶片颜色更绿，生长速度更快。
四、讨论本研究成功将黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因导入烟草中，并通过转基因技术获得了转基因烟草。
ARF基因导人烟草的遗传转化研究
Ｖ ｏ ． Ｎ Ｏ．５ Ｉ ２７ ０ Ｃ ． ２０ ｔ ０７
２０ 年 １ 月 ０７ Ｏ
文章 编 号 ：１ ７ —９ ３ ２ ０ ） ５ ０ ６ ７ ６ ３ ２ Ｘ（ ０ ７ ０ —０ ０ —０
ＡＲ Ｆ基 因导人烟草 的遗传转化研究
徐 刚标 卢孟 柱 陆 ， ， 燕
（． １ 中南 林 业 科 技 大 学 ， 湖南 长 沙 ４ ０ ０ ；． 国林 业 科 学 研 究 院 林 业 研 究 所 ， 京 １ ０ ９ ） １０４２中 北 ０ ０ １
ｘｕ ｎ ｂ ａ ， Ｇａ ｇ— ｉｏ ＬＵ ｅ — ｈｕ ＬＵ ｎ Ｍ ｎｇ ｚ ， Ｙａ
（ ． ｎ ｒ ｌ ｕ ｈ Ｕｎ ｖ ｒ ｉｙ ｏｆＦ ｒ ｓ ｒ ｎ ｃ ｏ ｏ ｙ，Ｃｈ ｎ ｓ ａ ４ ０ ０ １ Ｃｅ ｔ ａ Ｓｏ ｔ ｉｅ ｓｔ ｏ ｅ ｔ ｙ ａ ｄ Ｔｅ ｈｎ ｌ ｇ ａ ｇ ｈ １ ０ ４，Ｈｕ ａ ｎ ｎ，Ｃｈ ｎ ｉ ａ；
维普资讯
第 ２ ７卷
第 ５期
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＣ ｎ ｒ ｌ ｏ ｔ ｎ ｖ ｒ ｉ ｆＦｏ ｅ ｔｙ ＆ Ｔｅ ｈ ｏ ｏ ｙ ｏ ｒ ａ ｏ ｅ ｔａ Ｓ ｕ ｈＵ ｉｅｓｔ ｏ ｒ ｓｒ ｙ ｃ ｎ ｌｇ
ｆ ｌ ｗｓ Ｔｈ ｄ ｅ ｔｔｏ ｓ ｓ ｏ ｔ ｒ ｎ ｕ ｅ ｒ ｍ ｅ ｆｅ ｐｌ ｎ ｓ ｏ ｏ ａ ｃ ａ ｅ ｎ Ｍ Ｓ ｍｅ ｉ ｍ ｕ ｐ ｅ ，ｔ ｄ ｗｉ ． ｏｌ ｏ ． ｅ ａ ｖ ｎ ｉｉ ｕ ｈ ｏ ｓ ｗｅ ｅ ｉ ｄ ｃ ｄ ｆｏ ｌ ａ ｘ ａ ｔ ｆ ｔ ｂ ｃ ｏ ｂ ｓ ｄ ｏ ｄ ｕ ｓ ｐ ｌ ｍｅ ｅ ｔ ０ ８ ｍｇ ・Ｌ一 ｎ ｈ
烟草农杆菌转化实验步骤1
烟草农杆菌转化实验实验配方：1LRMOP: 20×大量元素50ml200×微量元素5ml200×有机5ml200×铁盐5ml3%蔗糖30g0.8%琼脂（国产）4g/500ml灭菌后，每500ml培养基加入:0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μLYEB:液体培养基：1L酵母提取物1g牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4•7H2O 0.5gpH7.0 高压灭菌。
固体培养基：每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml利福平（Rif）储液：50mg/mlYEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
一．农杆菌感受态细胞的制备（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。
二．质粒DNA导入农杆菌①电转法：1.取农杆菌感受态在冰上冻融；2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。
烟草瞬时转化实验步骤
烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。
通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。
三、材料的准备1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5M MES 200ul 0.976g1M MgCl2100ul 2.03g100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。
《黄花苜蓿MfDREB1和MfDREB1s基因转化烟草的研究》范文
《黄花苜蓿MfDREB1和MfDREB1s基因转化烟草的研究》篇一一、引言近年来，随着分子生物学技术的快速发展，基因转化成为了研究植物抗逆机制及遗传改良的重要手段。
黄花苜蓿作为一种具有较强抗逆性的植物，其MfDREB1和MfDREB1s基因在逆境响应中发挥着重要作用。
本研究旨在通过将这两个基因转化烟草，探究其在烟草中的表达情况及其对烟草抗逆性的影响。
二、材料与方法2.1 材料实验材料包括黄花苜蓿、烟草植物、MfDREB1和MfDREB1s基因、相关酶、载体等。
2.2 方法（1）基因克隆：从黄花苜蓿中克隆出MfDREB1和MfDREB1s基因，并进行序列分析。
（2）载体构建：将克隆的基因连接到表达载体上，构建出可用于基因转化的载体。
（3）烟草转化：采用农杆菌介导法将构建好的载体转化到烟草中，获得转基因烟草。
（4）表达分析：通过RT-PCR等方法检测转基因烟草中MfDREB1和MfDREB1s基因的表达情况。
（5）抗逆性分析：对转基因烟草进行逆境处理，观察其生长状况及抗逆性变化。
三、结果与分析3.1 基因克隆与序列分析成功从黄花苜蓿中克隆出MfDREB1和MfDREB1s基因，并进行了序列分析。
结果表明，这两个基因具有较高的保守性，与已知的DREB家族成员具有较高的相似性。
3.2 载体构建与烟草转化将克隆的基因连接到表达载体上，构建出可用于基因转化的载体。
采用农杆菌介导法将载体转化到烟草中，获得了转基因烟草。
3.3 表达分析通过RT-PCR等方法检测转基因烟草中MfDREB1和MfDREB1s基因的表达情况。
结果表明，这两个基因在转基因烟草中得到了有效表达，且表达量较高。
3.4 抗逆性分析对转基因烟草进行逆境处理，观察其生长状况及抗逆性变化。
结果表明，转基因烟草在干旱、低温等逆境下的生长状况明显优于非转基因烟草，表明MfDREB1和MfDREB1s基因的转化提高了烟草的抗逆性。
四、讨论本研究通过将黄花苜蓿的MfDREB1和MfDREB1s基因转化到烟草中，探究了其在烟草中的表达情况及其对烟草抗逆性的影响。
烟草瞬时转化
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本氏烟草（N.benthamian ）瞬时表达及相关实验方法：
一、 农杆菌介导的烟草瞬时转化：
A 、实验步骤：
1、 根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、 将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP 中，28℃，200rpm 过夜。
*3
4、用菌液。
5678、测9、
*B MgCl 20.2MAS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C 、关于表达时间：
烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D 、关于侵染液浓度：
推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。
过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
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实验八植物细胞悬浮培养
实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。
实验器材：
超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。
配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。
实验材料：烟草叶片愈伤组织。
实验方法：
1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等
放入工作台。
打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入
150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。
3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速
100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。
4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。
每次更换新鲜培养
基时称取重量。
5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。
6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：
鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，
绘制鲜重增长曲线。
烟草遗传转化实验
实验目的
烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。
本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。
实验要求：
掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。
实验原理
根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。
p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。
β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。
实验器材
摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。
实验材料
植物材料：烟草无菌苗
农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121
YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0
烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA
烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA
卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。
实验步骤
1. 农杆菌感受态的制备：
1)接菌于5 ml YEB液体培养基(Rif 50 mg/L)中，28℃，200转/分钟，培养1～2天；
2)取1mL活化的菌液接种于50mlYEB液体培养基中，同样条件下培养至OD600值为
0.4～0.6左右。
3)将菌液倒入50mL的离心管中，冰浴20分钟。
4)4℃，5000g离心10分钟，收集菌体。
5)用0.15M NaCl /0.1M CaCl2中悬浮细胞。
6)5000 rpm离心5分钟，去上清；
7)用冰预冷20mM CaCl2重悬沉淀，如不是马上使用，加入甘油分装，液氮速冻后，-70℃
保存。
2. 农杆菌感受态细胞的转化：
1)取200 μl感受态细胞于Eppendorf管；
2)加入1 μg质粒DNA，混匀，冰浴30分钟；
3)立即放入液氮中冰冻5分钟；(-70℃放置10min)
4)取出Eppendorf管，立即放入37 o C水浴5分钟；
5)加入YEB培养基l ml，28o C，150 rpm摇床培养2～3小时；
6)离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEB培养基中。
7)在YEB固体培养基(Kan 50 mg/L, Rif 50 mg/L)涂板；
8)28 o C下暗培养2～3天；
9)挑单菌落，提取质粒，酶切，电泳检查。
10)取转化菌株培养液于1.5 ml的离心管中，加15%的无菌甘油，贮存在-70 o C长期保存。
3. 农杆菌活化
1）挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在3～5ml含50mg/L rif 和50mg/L Kan 的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜,直至对数生长OD600为0.6-0.8。
2）活化过夜的农杆菌按1：100～1：50的比例接种在相同的20-50ml YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。
4. 外植体的侵染及共培养
1）取烟草无菌叶片，切成4～6mm的叶盘到无菌瓶中，加入农杆菌菌液，感染10min，期间轻微振荡，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。
2）将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养2d~4d。
5．筛选培养
将共培养的外植体转移到含cef 300mg/l和50mg/L Kan分化培养基上，25℃，光照培养。
每隔3-4周继代一次,，待转化后的外植体长出大量丛生芽。
6．生根培养：培养筛选的抗性芽长1～1.5cm时，从基部将芽切下，并转入含有300mg/L Cef 和50mg/L Kan的生根培养基上诱导生根，获得具有卡那霉素抗性的转基因植株。
思考题
1.利福平、卡那霉素、头孢青霉素在培养过程中各起什么作用？
2.简述农杆菌介导途径进行基因转化的机理及操作步骤。