烟草遗传转化实验

实验八植物细胞悬浮培养

实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。

实验器材：

超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。

配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。

实验材料：烟草叶片愈伤组织。

实验方法：

1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等

放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。

2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入

150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。

3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速

100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。

4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养

基时称取重量。

5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。

6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：

鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，

绘制鲜重增长曲线。

烟草遗传转化实验

实验目的

烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求：

掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。

实验原理

根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。

p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。

实验器材

摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。

实验材料

植物材料：烟草无菌苗

农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121

YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0

烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA

烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA

卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

实验步骤

1. 农杆菌感受态的制备：

1)接菌于5 ml YEB液体培养基(Rif 50 mg/L)中，28℃，200转/分钟，培养1～2天；

2)取1mL活化的菌液接种于50mlYEB液体培养基中，同样条件下培养至OD600值为

0.4～0.6左右。

3)将菌液倒入50mL的离心管中，冰浴20分钟。

4)4℃，5000g离心10分钟，收集菌体。

5)用0.15M NaCl /0.1M CaCl2中悬浮细胞。

6)5000 rpm离心5分钟，去上清；

7)用冰预冷20mM CaCl2重悬沉淀，如不是马上使用，加入甘油分装，液氮速冻后，-70℃

保存。

2. 农杆菌感受态细胞的转化：

1)取200 μl感受态细胞于Eppendorf管；

2)加入1 μg质粒DNA，混匀，冰浴30分钟；

3)立即放入液氮中冰冻5分钟；(-70℃放置10min)

4)取出Eppendorf管，立即放入37 o C水浴5分钟；

5)加入YEB培养基l ml，28o C，150 rpm摇床培养2～3小时；

6)离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEB培养基中。

7)在YEB固体培养基(Kan 50 mg/L, Rif 50 mg/L)涂板；

8)28 o C下暗培养2～3天；

9)挑单菌落，提取质粒，酶切，电泳检查。

10)取转化菌株培养液于1.5 ml的离心管中，加15%的无菌甘油，贮存在-70 o C长期保存。

3. 农杆菌活化

1）挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在3～5ml含50mg/L rif 和50mg/L Kan 的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜,直至对数生长OD600为0.6-0.8。

2）活化过夜的农杆菌按1：100～1：50的比例接种在相同的20-50ml YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。

4. 外植体的侵染及共培养

1）取烟草无菌叶片，切成4～6mm的叶盘到无菌瓶中，加入农杆菌菌液，感染10min，期间轻微振荡，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。

2）将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养2d~4d。

5．筛选培养

将共培养的外植体转移到含cef 300mg/l和50mg/L Kan分化培养基上，25℃，光照培养。每隔3-4周继代一次,，待转化后的外植体长出大量丛生芽。