烟草农杆菌转化实验步骤1

烟草农杆菌转化实验

实验配方：1L

RMOP: 20×大量元素50ml

200×微量元素5ml

200×有机5ml

200×铁盐5ml

3%蔗糖30g

0.8%琼脂（国产）4g/500ml

灭菌后，每500ml培养基加入:

0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL

1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μL

YEB:

液体培养基：1L

酵母提取物1g

牛肉膏5g

蛋白胨5g

蔗糖5g

MgSO4•7H2O 0.5g

pH7.0 高压灭菌。

固体培养基：

每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。

卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml

利福平（Rif）储液：50mg/ml

YEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。

一．农杆菌感受态细胞的制备

（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；

（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；

（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；

（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；

（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。二．质粒DNA导入农杆菌

①电转法：

1.取农杆菌感受态在冰上冻融；

2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；

3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；

4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；

5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；

6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。

②冻融法：

1、在200µl感受态细胞中加入2－6µl质粒DNA，冰浴5min，液氮中速冻5min；

2、迅速转入37℃水浴中，热激5min；

3、加入1ml YEB（不含抗生素）液体培养基，28℃慢速振荡培养2－4小时；

4、3000rpm离心4min，去一部分上清，留取200µl菌液涂布于含有50mg/l Kan 和50mg/l Rif的YEB平板；

5、放置约0.5h，待水份干后，28℃培养约24小时至长出菌落。

6、挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。

三．烟草遗传转化实验

①准备农杆菌

（1）将农杆菌在平板上划线，从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素（kan 50mg/L, Rif 50mg/L）的YEB液体培养基中，在恒温摇床上，于28℃下以180r/min培养至OD600为0.6~0.8（约需17h）。

（2）将OD600为0.6~0.8的菌液，按1%~2%的比例，转入新配制的无抗生素（含Rif）的YEB液体培养基中，可同时加入100~500µmol/L的乙酰丁香酮。在上述相同的条件下再培养6h左右，待OD600为0.2~0.5时即可用于转化。

②侵染烟草实验

（1）4℃，2500r/min 离心沉淀菌体，在超净工作台上，用40ml MS重悬，将重悬好的菌液倒入玻璃平板中，将切成5×5mm大小的烟草叶片（萌发一个月左右的烟草）放入菌液中，浸泡5-30min（通常10min左右），取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

（2）将浸染过的叶片放在RMOP上，在28℃暗培养条件下共培养2-4天（3天即可）。

（3）将经过共培养的外植体移到加有抗生素（100mg/L kana ）的RMOP（附加500mg/L的羧苄青霉素，抑制农标菌生长）上，在光照为25 μmol•m-2▪s-1、25℃条件下进行选择培养。

（4）选择培养2－3周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基（RMOP+100mg/L kana+500mg/L Cb）中进行继代培养。

（5）待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压的烟草生根培养基（MS+0.1mg/L NAA+100mg/L kana+500mg/L Cb）上进行生根培养，两周左右长出不定根，稍长大后可做分子鉴定。