双抗体夹心法

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双抗体夹心实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 掌握双抗体夹心法的基本原理和操作步骤。

2. 学习利用ELISA技术检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。

3. 分析实验结果，验证实验方法的有效性和准确性。

二、实验原理双抗体夹心法是一种常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，用于检测抗原。

其基本原理是将抗原与抗体结合，形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗体，通过显色反应判断抗原含量。

具体步骤如下：1. 将已知抗体包被于固相载体上，形成固相抗体。

2. 加入待测标本，若标本中含有目标抗原，则与固相抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

3. 洗涤去除未结合的标本。

4. 加入酶标记的抗体，该抗体能与抗原-抗体复合物中的抗原结合。

5. 再次洗涤去除未结合的酶标记抗体。

6. 加入底物，底物在酶的催化下发生颜色变化，颜色深浅与抗原含量成正比。

三、实验材料1. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）标准品2. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体3. 酶标记的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体）4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒5. 微孔板6. 仪器：酶标仪、离心机、移液器等四、实验步骤1. 包被抗体：将乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体稀释后，加入微孔板中，每孔100μl，37℃孵育过夜。

2. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

3. 封闭：加入封闭液，每孔200μl，37℃孵育1小时。

4. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

5. 加样：将待测标本、阳性对照、阴性对照和空白对照分别加入对应的孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。

6. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

7. 加酶标记二抗：将酶标记的二抗稀释后，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。

8. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

9. 加底物：将底物A液和B液按比例混合，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育15分钟。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法，也称为双特异性抗体结合（bispecific antibody sandwich method），是一种生物医学研究和临床应用中常用的技术手段。

它利用双特异性抗体能够同时结合两个不同抗原的特性，实现对细胞表面的目标分子的高效识别和定位。

本文将介绍双抗体夹心法的原理及其应用。

一、双抗体夹心法的原理概述双抗体夹心法原理基于单克隆抗体的特异性识别和结合，利用两个不同的单克隆抗体分别与两个不同的抗原结合，形成一个夹心结构，从而实现对目标分子的高效定位。

双抗体夹心法相较于传统的单克隆抗体法具有更强的特异性和高效性。

二、双抗体夹心法的工作原理双抗体夹心法的工作原理可以概括为以下几个步骤：1.制备双特异性抗体：首先，需要根据目标分子的特性和结构，设计并合成具有双特异性的抗体（例如，IgG1/2抗体）。

这种抗体一般由两个单克隆抗体的结合部分构成，通过基因工程技术将两个单克隆抗体的DNA片段融合，形成一个新的融合抗体。

2.融合抗体的表达和纯化：将融合抗体的DNA片段导入到特定的表达宿主细胞中，通过培养和表达，使融合抗体得以表达出来。

随后，通过一系列的纯化步骤，如离心、层析、过滤等，得到纯化的融合抗体。

3.双抗体的结合与识别：将纯化的融合抗体与目标分子进行混合，并保持一定的时间，使融合抗体与目标分子发生特异性结合。

由于融合抗体具有两个抗原结合部分，可同时与两个不同的目标分子结合，从而形成一个夹心结构。

4.检测体系的建立：为了定量检测目标分子的存在量，需要建立相应的检测体系。

一般常见的检测体系有酶联免疫吸附测定法（ELISA）、放射性测定法（RIA）等。

通过这些检测方法，可以快速、准确地测定融合抗体与目标分子的结合情况。

三、双抗体夹心法的应用双抗体夹心法由于其高效性和特异性，在生物医学研究和临床应用中得到广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：1.肿瘤治疗：利用双抗体夹心法的特点，可以设计并合成具有双靶向功能的抗体药物，如具有同时识别肿瘤细胞和免疫细胞的抗体。

双抗体夹心法名词解释(一)

双抗体夹心法名词解释(一)双抗体夹心法名词解释1. 双抗体夹心法（Double Antibody Sandwich Method）双抗体夹心法是一种常用的免疫学技术，用于检测特定蛋白质的存在和定量。

它利用两种抗体来固定待测物质，并借助酶标记物质的信号输出，实现对待测物质的检测。

2. 抗体（Antibody）抗体是一种由机体产生的免疫蛋白质，能够识别并结合特定的抗原分子。

在双抗体夹心法中，需要使用两种抗体，即固定抗体和检测抗体。

•固定抗体：固定抗体是特异性结合待测物质的抗体，通常进行固定和包被的处理，用于捕获和固定待测物质。

•检测抗体：检测抗体是与待测物质不同的抗体，常常标记有特定的酶，用于检测待测物质的存在，并通过酶的催化作用产生信号。

3. 酶标记（Enzyme Labeling）酶标记是将酶与抗体进行结合，用于产生信号输出。

在双抗体夹心法中，常用的酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。

•辣根过氧化物酶（HRP）：HRP是常用的酶标记物之一，它能够催化底物的氧化反应，产生可测定的信号，如发色反应。

•碱性磷酸酶（AP）：AP是另一种常用的酶标记物，它能够催化底物的磷酸化反应，产生可测定的信号，如荧光或发色反应。

4. 信号输出（Signal Output）信号输出是指通过酶标记物催化作用产生的可测定的信号。

在双抗体夹心法中，可以通过测定底物的颜色、荧光强度或发光强度等来获得待测物质的定量信息。

例如，双抗体夹心法可以用于检测血液中的癌症标志物。

固定抗体首先被固定在试验板上，然后样品中的待测物质与固定抗体结合。

接着，添加检测抗体标记的酶，使其结合到待测物质上，形成一个含有待测物质的夹心结构。

最后，加入底物，酶催化底物发生化学反应，产生颜色或荧光信号。

根据信号的强度，可以定量分析待测物质的含量。

通过以上解释，我们了解了双抗体夹心法的基本原理和常用术语，以及其在分析检测中的应用。

这种免疫学技术在生命科学研究和临床诊断中具有广泛的应用价值。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Dual-Antibody Sandwich Assay）是一种常用于蛋白质检测的实验方法。

该方法通过同时使用两种特异性抗体，实现对目标蛋白的夹心检测，具有较高的灵敏度和特异性。

本文将介绍双抗体夹心法的原理及其应用。

一、原理双抗体夹心法原理基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本原理发展而来。

其主要步骤包括涂覆、夹心、检测和信号检测等。

首先，实验者将一种特异性抗体沉积于固定载体（如微孔板）表面，形成抗原夹心层。

然后，待测物中的目标蛋白与夹心层中的特异性抗体结合。

接下来，实验者使用另一种与目标蛋白不同抗原冠名的特异性抗体，即“第二抗体”，来与目标蛋白结合。

第二抗体通常与酶标记有关，如辣根过氧化物酶（HRP）。

最后，通过添加特定底物，比如TMB（3,3', 5,5'-四甲基联苯胺）或BMP（2,2'-联氨苯胺），来观察信号的产生。

由于目标蛋白与第一、第二抗体同时结合，因此形成了一个夹心型结构。

这种双抗体夹心的结构能够在分析前富集目标蛋白，并增强信号的产生。

通过比较待测样品与已知浓度的标准曲线，可以确定待测物样品中目标蛋白的含量。

二、应用双抗体夹心法在生物医学及生命科学研究中得到了广泛的应用。

其主要应用领域包括药物研发、临床诊断和生物工程等。

在药物研发中，双抗体夹心法可用于药物候选分子的筛选和鉴定。

通过测定目标蛋白的含量，可以评估药物分子对目标蛋白的亲和力和选择性。

在临床诊断中，双抗体夹心法可用于检测体液中的生物标志物。

生物标志物是与疾病状态相关联的分子，如肿瘤标志物。

双抗体夹心法具有高灵敏度和特异性，可以准确、快速地检测这些生物标志物，为临床诊断提供重要依据。

另外，双抗体夹心法在生物工程领域也得到了广泛应用。

它可用于检测和定量表达蛋白。

通过测定特定蛋白的含量，可以评估蛋白表达系统的效率和纯度。

总结起来，双抗体夹心法是一种灵敏、特异、快速的蛋白质检测方法。

ELISA测定的常用模式一--测定的常用模式一--双抗体夹心法

ELISA 测定的常用模式一测定的常用模式一------双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA 模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。

具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。

3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。

4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。

在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。

最初的双抗夹心ELISA 试剂盒，均采用两步法。

后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。

目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HBsAg、。

FP 和hCG 等，基本上都采用一步法。

一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA 测定结果有严重影响。

在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a 复合物的形成将直接与在第一步中形成的b 复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S 形变化曲线(图2—2)。

而一步法双抗夹心ELISA 的反应曲线则为钟形曲线(图2—3)。

elisa双抗体夹心法临床应用

elisa双抗体夹心法临床应用ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，可以用于检测特定抗体或抗原的存在。

在ELISA实验中，常用的检测方法之一就是双抗体夹心法。

本文将介绍ELISA双抗体夹心法在临床应用中的重要性和优势。

一、ELISA双抗体夹心法原理ELISA双抗体夹心法是一种通过两种抗体反应来检测目标分子的方法。

首先，在试验板上吸附抗原，然后加入第一种对抗原特异的抗体，使其与抗原结合。

接着，加入第二种与第一种抗体不同的抗体，这第二种抗体常被标记有酶等物质，以便后续检测。

通过测量酶的底物反应程度，可以确定目标分子的存在量。

二、ELISA双抗体夹心法在临床诊断中的应用1. 疾病诊断：ELISA双抗体夹心法可以用于检测患者体液中特定抗原或抗体的存在，帮助医生进行疾病的早期诊断。

例如，在HIV感染的诊断中，ELISA双抗体夹心法有着很高的敏感性和特异性，可以快速准确地检测出HIV抗体的存在。

2. 肿瘤标记物检测：ELISA双抗体夹心法也常用于检测患者体液中的肿瘤标记物，帮助筛查和监测肿瘤患者的疾病进展。

通过检测血清中特定肿瘤标记物的水平，医生可以及早发现肿瘤的复发或转移。

3. 药物检测：在药物治疗过程中，ELISA双抗体夹心法可以帮助医生监测患者体内药物浓度的变化，确定药物的治疗效果，以及调整治疗方案。

三、ELISA双抗体夹心法的优势1. 敏感性高：ELISA双抗体夹心法可以检测非常低浓度的抗原或抗体，具有较高的敏感性。

2. 特异性好：通过选择特异性较好的抗体，可以确保ELISA双抗体夹心法对目标分子的检测具有较高的特异性。

3. 操作简便：ELISA双抗体夹心法操作简单，不需要复杂的仪器设备，适合临床快速检测的需求。

总结：ELISA双抗体夹心法作为一种重要的生物医学检测技术，在临床应用中发挥着重要作用。

其高敏感性、良好特异性和操作简便性，使其成为临床诊断和治疗中不可或缺的工具，有助于提高疾病的早期诊断率和治疗效果，促进患者的健康管理。

elisa双抗体夹心法原理

elisa双抗体夹心法原理Elisa双抗体夹心法原理引言：Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定分子。

其中，双抗体夹心法是Elisa的一种常见应用，它通过特定抗体的结合来检测目标分子的存在。

本文将详细介绍Elisa双抗体夹心法的原理和应用。

一、Elisa双抗体夹心法的原理Elisa双抗体夹心法是一种间接的免疫测定方法，它利用两种不同的抗体来夹持目标分子，从而实现对目标分子的检测和定量分析。

1. 抗原涂覆：首先，在试验板上涂覆含有目标分子的抗原。

这个抗原可以是蛋白质、多肽、病毒、细菌等。

涂覆后，将试验板放置在适当的条件下，使抗原与试验板表面结合。

2. 阻断：为了避免非特异性结合，需要在试验板上进行阻断步骤。

通常使用一种无关的蛋白质（如牛血清蛋白）来阻断未被抗原结合的表面。

3. 第一次抗体结合：将含有特异性抗体的溶液加入试验板中，使其与目标分子结合。

这种特异性抗体通常是由动物免疫产生的，可以识别并结合目标分子。

4. 第一次洗涤：为了去除未结合的第一次抗体，需要进行洗涤步骤。

洗涤可以去除非特异性结合物，提高检测的特异性。

5. 第二次抗体结合：将与酶结合的第二次抗体加入试验板中，使其与第一次抗体结合。

这种第二次抗体通常是与酶（如辣根过氧化物酶）结合的抗体，可以通过酶的催化作用来放大信号。

6. 第二次洗涤：为了去除未结合的第二次抗体，需要进行洗涤步骤。

洗涤可以去除非特异性结合物，提高检测的特异性。

7. 底物添加：将含有底物的溶液加入试验板中，底物与酶的催化作用产生可测量的信号。

常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等。

8. 反应停止：通过加入反应停止剂，停止底物的反应，并产生一个可测量的信号。

反应停止剂通常是酸性溶液，可以改变底物的颜色。

9. 信号检测：使用光谱仪或酶标仪等设备，测量底物反应产生的信号强度。

信号的强度与目标分子的浓度成正比，可以通过标准曲线来定量分析目标分子的浓度。

免疫层析双抗体夹心法原理

免疫层析双抗体夹心法原理免疫层析双抗体夹心法（sandwich ELISA）是一种常用的免疫测定方法，可以用来检测血清、尿液、细胞上清等样品中特定蛋白质的含量。

该方法利用酶标记的第一抗体与待测蛋白质结合，并用另一种与该蛋白质不同的第二抗体来结合被测蛋白质上获得的第一抗体，从而实现间接检测。

1.准备试剂：准备酶标记的第一抗体、被试蛋白质样品、第二抗体和底物等试剂。

2.将样品加入试剂：将待测样品加入微孔板中，与抗原结合。

如果需要，可以对样品进行前处理，如离心、稀释等。

3.洗涤：洗去未结合的样品成分。

这一步的目的是去除非特异结合物，以减少干扰。

4.加入酶标记的第一抗体：将酶标记的第一抗体加入微孔板中，与待测样品中的蛋白质结合。

5.洗涤：洗去未结合的酶标记的第一抗体。

6.加入第二抗体：将与酶标记的第一抗体所属物种不同的第二抗体加入微孔板中，与酶标记的第一抗体结合。

由于第二抗体与酶标记的第一抗体不同源，所以能够结合在被测蛋白质上的酶标记的第一抗体将同时与第二抗体结合。

7.洗涤：洗去未结合的第二抗体。

8.加入底物：加入酶底物，如TMB，使酶反应发生。

酶反应会产生一种可测量的产物，如染色产物。

9.反应停止：加入反应停止液停止酶反应，阻止产物的进一步形成。

10.测量：使用光谱仪或酶标仪测量样品中产物的光吸收值或荧光强度，从而得到待测蛋白质在样品中的含量。

通常，光吸收或荧光强度与蛋白质的浓度成正比。

免疫层析双抗体夹心法优点是具有较高的灵敏度和特异性。

它的原理基于两个特异性抗体固定在固相上，夹持着待测蛋白质。

通过使用两种特异性抗体，可以避免其他非特异性结合物的干扰，从而提高检测的特异性。

酶标记的抗体和酶底物使得检测结果可以通过光学或颜色变化进行定量分析，该方法因此非常适用于高通量检测。

然而，免疫层析双抗体夹心法也存在一些限制。

首先，该方法需要使用专门的抗体对待测蛋白质进行识别，因此需要事先开发特定的抗体。

其次，实验过程中存在多步酶反应，可能引入误差。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理随着生物技术的不断发展，研究人员不断努力寻找更有效的药物疗法来治疗各种疾病。

双抗体夹心法（或称抗体夹心法）作为一种新兴的治疗策略，正在受到越来越多的关注。

本文将介绍双抗体夹心法的原理和应用。

1. 基本概念双抗体夹心法是一种利用两种不同抗体与同一抗原结合的策略。

通常情况下，这两种抗体分别被称为抗原抗体和效应抗体。

抗原抗体与目标抗原结合，然后效应抗体与抗原抗体结合，形成一个“夹心”结构，从而实现对目标抗原的高度特异性识别和调控。

2. 原理解析双抗体夹心法的原理基于两种抗体结合抗原的能力和效应抗体的调控作用。

首先，抗原抗体具有高度特异性，可以选择性地识别和结合目标抗原。

其次，效应抗体具有特定的功能，例如抑制、促进或激活细胞免疫应答等。

当抗原抗体与目标抗原结合时，效应抗体可以通过结合抗原抗体来调控目标抗原的生物活性。

这可以通过以下几种方式实现：2.1. 抗体依赖性细胞毒性（ADCC）效应抗体可以结合至抗原抗体的Fc区域，激活免疫细胞，如自然杀伤细胞（NK细胞）以及单核细胞等，通过ADCC机制杀伤抗原阳性细胞。

这种机制在治疗癌症等疾病中已经被广泛应用。

2.2. 免疫调节效应抗体可以通过影响信号通路、改变细胞素产生及调节免疫细胞的功能，来调控免疫应答。

这种机制在治疗自身免疫性疾病、感染性疾病等方面具有良好的应用前景。

2.3. 抗体依赖性细胞捕获（ADCP）效应抗体不仅可以激活免疫细胞来杀伤抗原阳性细胞，同时还可以通过ADC机制让免疫细胞吞噬抗原阳性细胞。

这种机制在治疗炎症性疾病、感染性疾病等方面显示出潜力。

3. 应用前景双抗体夹心法作为一种新型的治疗策略，具有广泛的应用前景。

它可以用于治疗多种疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病等。

临床试验已经显示，双抗体夹心法在治疗某些肿瘤中取得了显著的疗效。

此外，由于效应抗体具有多样化的功能，双抗体夹心法还具有潜力用于精准医学和个体化治疗。

尽管双抗体夹心法在治疗领域中有着广阔的应用前景，但仍然面临一些挑战。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Bispecific T-cell Engagers, BiTEs）是一种新型的抗体工程技术，通过同时结合两个不同的抗原靶标，激活并增强人体免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力。

该技术的原理基于特异性结合抗原的单克隆抗体，并通过连接肿瘤细胞和T细胞，促进肿瘤细胞的杀伤作用。

1. 双抗体夹心法的结构双抗体夹心法的结构可以分为四个部分：单链Fv抗体、连接剂、单链Fv抗体、连接剂。

其中，单链Fv抗体是双抗体夹心法的关键组成部分，它可以同时结合两种不同的抗原靶标，例如肿瘤细胞上的特定抗原和T细胞上的CD3ε。

连接剂则起到连接作用，将两个单链Fv抗体相互连接在一起，形成抗体结构。

2. 双抗体夹心法的原理双抗体夹心法的原理是通过两个单链Fv抗体同时结合肿瘤细胞和T细胞，将它们紧密地连接在一起。

当双抗体夹心法与肿瘤细胞结合时，它可以释放活化信号，激活附近的T细胞。

同时，双抗体夹心法也能够增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，并促使T细胞产生细胞毒性溶解素和细胞因子等效应分子，进一步增强其杀伤作用。

3. 双抗体夹心法的应用双抗体夹心法作为一种新型的免疫治疗技术，已经在临床试验中显示出良好的疗效，并在一些特定类型的恶性肿瘤治疗中取得了显著的进展。

例如，针对B细胞淋巴瘤的双抗体夹心法已经获得了FDA的批准，并成功实现了临床应用。

此外，双抗体夹心法还可以用于其他类型的恶性肿瘤治疗，如乳腺癌、肺癌等。

4. 双抗体夹心法的优势和挑战双抗体夹心法相比传统的单克隆抗体治疗具有一些明显的优势。

首先，双抗体夹心法可以同时结合两种不同的抗原靶标，通过激活T细胞的杀伤作用，增强肿瘤细胞的杀伤效果，并减少肿瘤细胞对治疗的耐药性。

其次，双抗体夹心法可以有效地激活免疫系统，提高肿瘤治疗的整体效果。

然而，双抗体夹心法在应用过程中也存在一些挑战，如制备成本高、体内稳定性等问题，需要进一步研究和改进。

总结：双抗体夹心法是一种基于抗体工程技术的新型免疫治疗方法，通过同时结合两个不同的抗原靶标，激活并增强人体免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法是一种生物医学研究中常用的实验技术，它通过结合两种不同的抗体，能够更有效地检测或治疗特定疾病或病原体。

本文将详细介绍双抗体夹心法的原理及其应用。

一、双抗体夹心法概述双抗体夹心法（sandwich ELISA）是酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的一种类型。

它利用两种不同的抗体分别与目标分子结合，从而形成夹心复合物。

其中一种抗体被固定在试验板上，另一种抗体带有标记物，如酶或荧光染料，用于检测目标分子的存在。

通过测量标记物的信号强度，我们可以间接地评估目标物质的浓度或活性。

二、双抗体夹心法的原理基于两种抗体与目标分子的多重识别和结合。

在实验过程中，我们首先将一种抗体固定在试验板上，形成抗原捕获层。

这种抗体专门识别并结合特定的目标分子。

待固定完成后，加入待测样品，其中的目标分子会与捕获层上的抗体结合。

接下来，我们加入第二种抗体，这种抗体则与目标分子的另一个表位结合。

同时，这第二种抗体携带有标记物，例如酶。

在适当条件下，这两种抗体将形成一个“夹心”结构，即第一种抗体-目标分子-第二种抗体。

最后，我们添加染色底物或发光底物，使标记物生成可观察的信号。

标记物的性质根据实验需要而定，酶标记的双抗体夹心法一般使用酶底物产生比色反应，而荧光标记的双抗体夹心法则需要使用荧光显微镜或荧光分析仪进行检测。

通过测量信号的强度，我们可以间接地确定目标分子的浓度或活性水平。

三、双抗体夹心法的应用双抗体夹心法可广泛应用于生物医学研究、生物分析和临床诊断等多个领域。

以下列举几个常见的应用：1. 蛋白质检测：双抗体夹心法可用于检测血清中特定蛋白质的浓度，如肿瘤标志物、炎症介质等。

通过测量目标蛋白质的浓度变化，可以判断疾病的进展或治疗效果。

2. 病原体检测：双抗体夹心法可以用于检测病原体，如病毒、细菌或寄生虫等。

通过识别病原体特定的抗原或蛋白质，可以进行早期诊断和监测疾病治疗效果。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法是一种重要的治疗手段，它在抗体研究和免疫治疗领域中发挥着重要作用。

本文将介绍双抗体夹心法的原理及其应用。

一、双抗体夹心法的原理双抗体夹心法是一种通过结合多个抗体来增强其特异性和亲和力的技术。

它主要由两种抗体构成：第一种是能够选择性结合靶标的单克隆抗体（mAb1），第二种是结合到mAb1的另一种抗体（mAb2）。

mAb1和mAb2之间的结合可以增强mAb1的亲和力和特异性，从而提高治疗效果。

具体来说，双抗体夹心法的原理如下：mAb1选择性地结合到疾病相关的靶标上，如肿瘤细胞表面的特定抗原。

mAb2选择性地结合到mAb1的Fc区域，形成了一个抗体-抗体结构。

通过这种结构，mAb2可以作为受体结合在靶细胞上，从而增强了mAb1的亲和力和特异性。

这种夹心结构有效地增加了抗体与靶标的结合力，提高了治疗效果。

二、双抗体夹心法的应用双抗体夹心法在肿瘤治疗中有广泛的应用。

它可以通过增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，抑制肿瘤细胞生长和扩散。

此外，双抗体夹心法还可以降低副作用并提高治疗效果。

1. 免疫细胞介导的肿瘤治疗：通过使用双抗体夹心法，可以将免疫细胞与肿瘤细胞紧密结合，从而增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

这种方法有效地促进了肿瘤的消灭，可以作为免疫治疗的一种重要策略。

2. 靶向药物输送：双抗体夹心法可以将药物通过结合到mAb2上，从而实现药物的靶向输送。

这种方法可以减少对正常细胞的毒性作用，提高药物的疗效，并降低药物副作用。

3. 诊断影像学：利用双抗体夹心法可以选择性地结合到患者体内的病变部位，从而实现准确的诊断和影像学观察。

这种方法可以提高疾病的检测率，提供更可靠的诊断依据。

双抗体夹心法的原理和应用使其成为免疫治疗领域的研究热点之一。

随着技术的不断进步和创新，相信双抗体夹心法将在未来的医疗实践中发挥越来越重要的作用。

结语双抗体夹心法是一种利用多抗体结合的技术，通过增强抗体的特异性和亲和力来提高治疗效果。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Dual Antibody Sandwich Assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测目标分子（例如蛋白质、细胞因子等）的存在和浓度。

通过使用两种特异性抗体和标记物，该方法能够提高检测的特异性和敏感性。

一、原理概述双抗体夹心法的原理基于抗原与特异性抗体之间的结合。

该方法通过在抗原分子的上下游分别添加两种不同的特异性抗体，从而实现对目标抗原的夹心检测。

具体而言，首先将待测样本中的目标抗原与特异性抗体1结合，形成抗原-抗体复合物。

随后，另一种特异性抗体2与复合物中未结合的部分抗原结合，形成夹心结构。

最后，添加标记物，通常是荧光染料或酶，与抗体2结合，使夹心结构更容易被检测出来。

通过测量标记物的信号强度，可以确定样本中目标抗原的存在和浓度。

二、步骤详解下面将详细介绍双抗体夹心法的操作步骤：步骤1：制备试验样品从样本中提取待测分子，如蛋白质。

根据实验需要，可以对样本进行预处理，如离心、稀释等。

步骤2：涂覆固相基质将特异性抗体1固定在固相基质上，例如芯片、酶标板等。

这种固相基质具有高亲和力，可以牢固地固定抗体1，并具有不粘附非特异性分子的性质。

步骤3：孵育样品将样品添加到已涂覆抗体1的固相基质上，并进行孵育反应。

在这一步中，待测抗原与抗体1结合形成复合物。

步骤4：洗涤通过洗涤的过程，去除未结合的样品成分，以减少非特异性背景信号。

步骤5：添加抗体2添加特异性抗体2，它会与待测抗原-抗体1复合物中的未结合抗原结合。

这一步使得目标抗原被夹在两种抗体之间，形成夹心结构。

步骤6：洗涤为了去除未结合的抗体2，需要进行再次的洗涤步骤。

步骤7：添加标记物添加标记物，如荧光染料或酶，与抗体2结合。

标记物会与抗体2结合的位置产生信号，从而实现对夹心结构的检测。

步骤8：信号检测与分析使用适当的检测设备（如荧光显微镜、酶标仪等）来测量标记物所产生的信号强度。

通过与已知浓度标准曲线的比较，可以确定待测样品中目标抗原的浓度。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法（bispecific antibody sandwiching technique）是一种重要的免疫分析方法，它能够高效地检测目标分子的存在并达到极高的灵敏度。

本文将介绍双抗体夹心法的原理及其应用。

一、原理介绍双抗体夹心法利用两种不同的抗体，分别与目标分子上的两个不同的表位结合。

其中一个抗体被固定在固相载体上（如微孔板），另一个抗体与检测标记物（如酶或荧光物质）结合。

当待测样品中存在目标分子时，它会与这两种抗体同时结合，形成一个“夹心”结构。

通过测定检测标记物的信号强度，可以确定目标分子的存在与浓度。

二、实验步骤1. 表位固定：将其中一个抗体固定在微孔板上。

通常，可以通过共价键合或物理吸附的方式将抗体固定在固相载体表面。

2. 样品加入：加入待测样品，允许样品中的目标分子与固定的抗体发生特异性结合。

3. 洗涤：经过一定时间的孵育后，使用缓冲液洗涤掉非特异性结合的物质，以降低背景信号。

4. 检测标记物结合：加入另一个与目标分子结合的抗体，并与检测标记物（如酶或荧光物质）结合。

5. 洗涤：洗涤掉未结合的检测标记物，减少背景信号。

6. 信号检测：根据检测标记物的性质，可以使用相应的方法进行信号检测，如酶标记物可以通过酶促反应生成颜色或荧光，荧光物质可以通过荧光检测系统进行信号检测。

7. 结果分析：根据信号强度，可以确定目标分子的存在与浓度。

三、应用领域双抗体夹心法在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。

它在病原微生物的检测、肿瘤标志物的监测、药物残留物的测定等方面有着重要的作用。

在病原微生物检测中，双抗体夹心法可以快速、准确地确定感染的微生物种类和数量。

通过针对微生物表面的不同抗原进行双抗体夹心分析，可以提高检测的特异性和敏感性。

在肿瘤标志物监测方面，双抗体夹心法可以检测很低浓度的肿瘤标志物，帮助诊断和治疗肿瘤疾病。

它可以早期发现肿瘤的存在，并提供治疗反应的监测。

另外，在药物残留物的测定中，双抗体夹心法可以快速、准确地检测食品和环境样品中的药物残留物，保障公众健康。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Dual Antibody Sandwich Assay）是一种常用的免疫分析方法，广泛应用于生物医学和生物技术领域。

它通过结合两种不同的抗体，实现对目标物的高敏感检测和定量分析。

下文将详细介绍双抗体夹心法的原理及其应用。

一、原理介绍双抗体夹心法原理基于多抗体对目标物的特异性识别和结合。

它的核心是使用两种不同的抗体，一种被称为“捕获抗体”，另一种则是“探测抗体”。

捕获抗体主要用于固定目标物，而探测抗体则通过与目标物结合来生成信号。

这两种抗体必须同时与目标物的不同表位结合，以确保高度特异性的检测。

具体操作步骤如下：1. 准备捕获抗体：捕获抗体是专门设计用于结合目标物并固定在检测平台上的抗体。

它能够高度特异地结合目标物，从而实现后续的检测。

2. 捕获抗体固定：将捕获抗体固定在特定的检测平台上，例如酶联免疫吸附试验（ELISA）板。

固定后，捕获抗体能够将目标物紧密锁定在试验系统中。

3. 样品加入：待固定后的捕获抗体的检测平台上，将样品加入。

目标物会与捕获抗体结合，并形成“夹心”结构。

4. 探测抗体加入：同时加入与目标物不同表位结合的探测抗体。

探测抗体会与目标物的另一端结合，并形成“夹心”结构。

5. 信号产生：通过加入特定的信号发生物质，例如酶底物，可以使夹心结构中的目标物生成可检测的信号。

这些信号可以通过测量光学、电化学或荧光等方法来进行定量检测。

二、应用领域双抗体夹心法广泛应用于临床医学、生物医学研究、药物研发以及环境监测等领域。

以下是一些常见的应用案例：1. 生物标志物检测：双抗体夹心法可以用于检测血清中的特定蛋白质分子，如肿瘤标志物、病毒抗原等。

它可以为疾病早期诊断、疗效评估和疫苗研发提供重要依据。

2. 药物研发：在药物研发过程中，双抗体夹心法可用于检测药物的浓度、纯度和活性。

通过量化目标物在体内的吸附和代谢情况，可以评估新药的药效和安全性。

3. 生物传感器开发：双抗体夹心法可用于构建高灵敏度的生物传感器，用于实时监测环境中的有害物质和生物活性分子。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法（bispecific antibody sandwich）是一种用于检测分析生物样品中目标物的高度敏感方法。

它结合了双抗体结构的优势，能够同时识别并结合两个不同的抗原。

1. 引言双抗体夹心法是一种在生物医学领域中广泛应用的分析方法。

它通过结合两个不同的抗原，能够提高检测分析的灵敏度和特异性。

2. 双抗体夹心法的原理双抗体夹心法的原理基于双抗体的结构和作用机制。

双抗体由两个单克隆抗体分子连接而成，其中一个单克隆抗体能够特异性结合目标物1，另一个单克隆抗体能够特异性结合目标物2。

3. 实验步骤双抗体夹心法的实验步骤包括样品预处理、抗体标记和夹心法检测。

3.1 样品预处理首先，需要对生物样品进行预处理，以去除干扰物和提取目标物。

这可以通过离心、洗涤和溶解等步骤完成。

3.2 抗体标记接下来，需要将两个单克隆抗体分别标记上荧光染料或酶标记物。

这可以通过特定的化学方法实现，使得抗体能够与目标物结合后发出特定信号。

3.3 夹心法检测在实验过程中，首先将样品与一个特异性结合目标物1的抗体进行孵育，使得目标物1与抗体形成复合物。

然后，加入标记着目标物2的抗体，形成双抗体夹心复合物。

最后，通过流式细胞仪或酶标仪等设备检测标记物的信号强度。

4. 应用领域双抗体夹心法在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用。

它可以用于检测血清中的肿瘤标志物、病原微生物抗原、蛋白质结构等。

另外，双抗体夹心法也可以用于研究免疫治疗药物的药效评估、疫苗的效力检测等方面。

5. 双抗体夹心法的优势与传统的单抗体夹心法相比，双抗体夹心法具有以下几个优势：- 提高了检测分析的特异性和灵敏性；- 可以同时检测两个不同的目标物，减少了实验的时间和成本；- 适用于复杂的生物样品，如血清、尿液等。

6. 结论双抗体夹心法作为一种高度敏感的检测分析方法，在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。

它的原理简单，操作方便，具有广泛的应用前景。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Dual-antibody sandwich method）是一种常用于生物学研究和临床诊断的实验技术。

它的原理基于双抗体的特异性结合，通过将待检测的目标物“夹”在两个特异性抗体之间，形成一个稳定的“夹心”复合物，从而实现对目标物的定量分析。

在正式介绍双抗体夹心法原理之前，首先需要了解一些基础概念。

抗体，又称免疫球蛋白，是一种由免疫系统产生的蛋白质分子，具备高度特异性结合和识别分子的能力。

另外，抗体分为两个重要的部分：Fc区和Fab区。

Fc区是抗体的常规结构，而Fab区则是抗体的多样性区域，可特异地结合抗原。

双抗体夹心法的步骤如下：第一步，固定抗体。

在实验容器的表面（或特定载体上）固定一种特异性的抗体，这种抗体能够与待检测的目标物相互作用。

第二步，试样处理。

将待检测样品加入到固定抗体的容器中，让样品中的目标物与固定抗体结合。

第三步，第一次洗涤。

为了去除非特异性结合于固定抗体上的其他成分，进行洗涤步骤。

第四步，第二抗体结合。

加入第二个特异性抗体，这个抗体能够与目标物的不同表位结合。

这个第二抗体通常被称为“探针抗体”。

第五步，第二次洗涤。

为了去除非特异性结合于第二抗体上的其他成分，进行洗涤步骤。

第六步，信号检测。

加入一种检测物质，例如一种发光剂或酶标记物质，使得目标物对应的复合物产生可检测的信号。

这个信号可以通过光学或化学方法转化为可观察的结果。

通过以上步骤，双抗体夹心法可以实现对待检测目标物的高度灵敏和特异性检测。

这种方法的优点在于能同时使用两种特异性的抗体，大大提高了目标物与抗体结合的稳定性和准确性。

另外，这种夹心结构也可以起到一种放大信号的作用，使得产生的信号更强大更容易检测。

双抗体夹心法在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。

它可以用于检测小分子药物、病原微生物、肿瘤标志物等多种生物分子的定量分析。

同时，该方法还可以用于监测生物样品中蛋白质的表达水平，以及研究细胞信号转导和疾病机制等方面。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法（bispecific antibody sandwich assay）是一种常用的生物医学实验技术，用于检测特定蛋白质或生物分子的存在及其数量。

该方法利用两种不同的抗体，通过特异性结合目标物质，形成夹心的结构，从而实现高灵敏度和高特异性的检测。

双抗体夹心法的原理可以概括为以下几个步骤：第一步：制备特异性抗体在进行双抗体夹心法之前，需要制备两种特异性抗体，分别与待检测蛋白质或生物分子的不同表位结合。

这些特异性抗体可由动物免疫产生，或通过基因工程技术制备。

第二步：夹心结构形成首先，在待测样品中加入第一种特异性抗体（抗体A），该抗体与待测物质的一特定表位结合。

抗体A与待测物质结合后形成一个抗原-抗体复合物。

在复合物形成后，加入第二种特异性抗体（抗体B），该抗体与待测物质的另一特定表位结合。

抗体B的结构可使其同时与抗体A和待测物质结合，形成一个夹心式的结构。

这个夹心结构增大了检测的特异性和敏感性。

第三步：信号产生为了检测夹心结构的形成，一般会在其中一种特异性抗体上标记一种信号物。

例如，可以在抗体A上标记荧光染料，当夹心结构形成时，荧光信号会发出。

通过检测信号的发出情况，可以确定待测样品中待检测蛋白质或生物分子的存在与否。

如果夹心结构形成，信号就会发出；如果夹心结构未形成，信号则不会发出。

第四步：结果分析最后，通过定量或定性分析信号的强度，可以确定待测样品中目标物质的浓度或存在情况。

一般来说，信号强度与待测物质的浓度呈正相关关系。

双抗体夹心法的优势在于其高特异性和高灵敏度。

由于夹心结构只能形成在特定目标物质存在时，可以降低假阳性结果的发生。

同时，夹心结构的形成也增加了检测信号的产生，提高了检测的灵敏度。

除了在生物医学研究中应用广泛外，双抗体夹心法还可以在临床诊断中应用。

例如，可以用于检测肿瘤标志物、病原体感染和免疫相关疾病等。

双抗体夹心法在生物医学领域具有重要的应用前景，有助于更准确地进行疾病诊断和治疗。

双抗体夹心法原理

双抗体夹心法原理双抗体夹心法（Dual-Antibody Sandwich Assay）是一种常用于生物学和医学研究中的实验方法，用于检测和定量分析特定的生物分子。

该方法利用两种不同的抗体，将目标分子“夹”在两个抗体之间，形成一个稳定的夹心复合物，从而实现目标分子的定性和定量检测。

一、原理概述双抗体夹心法的原理基于特异性抗体与目标分子的高度亲和性。

该方法通常包括以下步骤：涂覆、夹心反应和检测。

1. 涂覆：首先，在固相载体上涂覆一种特异性抗体，通常是单克隆抗体。

这种抗体对目标分子具有特异性识别能力，能够与目标分子发生特定结合。

2. 夹心反应：样品（如血清或细胞培养上清液）中含有目标分子，通过与涂覆抗体的结合，将目标分子固定在固相载体上。

然后，加入第二种特异性抗体，该抗体与目标分子的另一表位结合。

3. 检测：第二种抗体通常标记有检测信号物，如酶、荧光染料或放射性同位素等。

通过检测信号物的特异性反应，可以测定目标分子在样品中的存在量。

二、优势和应用双抗体夹心法具有以下几个优势：1. 高灵敏度：双抗体夹心法利用两种不同的特异性抗体，可以大幅度提高检测灵敏度。

两种抗体的结合可以增加目标分子在固相载体上的密度，从而提高信号产生。

2. 高特异性：通过使用两种不同的抗体，双抗体夹心法可以提高目标分子检测的特异性。

不仅能够通过两种抗体的结合来确认目标分子的存在，还可以排除其他非特异性结合物的干扰。

3. 宽泛的应用范围：双抗体夹心法可以用于检测不同类型的生物分子，包括蛋白质、细胞因子、激素、病毒、细菌等。

它在生物医学研究、临床诊断、药物开发等领域有着广泛的应用。

双抗体夹心法在实际应用中具有许多重要的应用和研究价值。

它被广泛应用于以下方面：1. 临床检验：双抗体夹心法可用于检测血清或尿液中特定蛋白质的水平，用于疾病的早期诊断、治疗效果评估和疾病监测。

2. 药物开发：双抗体夹心法可以用于筛选和鉴定药物分子，评估其对特定蛋白质的结合亲和力，从而指导药物研发的方向和优化。

双抗体夹心法

1.双抗体夹心法双抗体夹心法,属于非竞争结合测定.它是检测抗原最常用的ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测.其基本工作原理是:利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物.由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内).测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值),即可确定待测抗原含量. 若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法.若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则是双抗原夹心法.操作步骤:⑴将特异性抗体包被固相载体McAb.孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体和杂质.⑵加待检标本,孵育,使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物.洗涤除去未结合酶标抗体.⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量.现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体,则受检样品和酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间.若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时的后带现象),使最终结果低于实际含量(钩状效应),甚至出现假阴性现象.因此对此类标本应适当稀释后再测定.另外,当血清中存在类风湿因子(RF)时,类风湿因子(RF)可充当抗原,而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物,从而出现假阳性结果.2.间接法此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验.其原理是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物,再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体,如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,测定加底物后的显色程度,确定待测抗体含量.操作步骤⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质.⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相.⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分结合,洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分.⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物.⑸加底物显色.间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此该法只需要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体,具有更广泛的通用性.3.竞争法竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定,也可对抗体进行检测.其方法和特点是:①酶标记抗原(抗体)与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体(抗原)结合的能力;②反应体系中,固相抗体(抗原)和酶标抗原(抗体)是固定限量,且前者的结合位点少于酶标记与非标记抗原(抗体)的分子量和;③免疫反应后,结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原(抗体)的量(酶活性)与样品或标准品中非标记抗原(抗体)的浓度成反比.操作步骤⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体.洗涤除去未结合物.⑵加入待检标本和酶标抗原,孵育,使两者与固相抗体竞争结合.洗涤除去未结合到固相上的游离酶标抗原及其他未结合物.⑶加底物显色.颜色深浅与待测抗原量成反比.同理,也可用固相抗原和酶标抗体作试剂,使固相抗原和标本中的待检抗原竞争结合酶标抗体.待检抗原竞争抑制酶标抗体和固相抗原结合,即待检抗原越多,显色越浅.以抗原测定为例,先将特异性抗体连接于固相载体,分别设置对照管和样品测定管;对照管中仅加酶标抗原,加样后,无非标记抗原竞争,酶标抗原即与固相抗体充分结合;而测定管抗原与后者的结合受到抑制而减少.加酶底物显色后,对照管因固相抗体上结合的酶标抗原多,显色深,测定管则依被检抗原和酶标抗原竞争结合固相抗体程度不同而显色深浅有异:被检抗原多,酶标抗原与固相抗体结合少,底物显色反应弱,色浅;反之呈色深.即结合于固相的酶标抗原量与样品中被检抗原浓度负相关.计算测定管与对照管颜色深度(OD值)之差,即可确定被检抗原量.4.捕获法捕获法(亦称反向间接法)ELISA,主要用于血清中某种抗体亚型成分(如IgM)的测定.以目前最常用的IgM测定为例,因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在,则后者可干扰IgM的测定.因此捕获法的工作原理设计为:先将针对IgM的第二抗体(如羊抗人IgMμ链抗体)连接于固相载体,用以结合("捕获")样品中所有IgM(特异或非特异),洗涤出去IgG等无关物质,然后加入特异抗原与待检IgM结合;再加入抗原特异的酶标抗体,最后形成固相二抗- IgM-抗原-酶标抗体复合物,加酶底物作用显色后,即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定.5.其他ELSAELSA法由于测定灵敏,特异,操作简便,易于自动化,且无放射性污染等诸多优点,使其不仅成为目前应用最广而且发展最快的一种免疫测定技术.而且在方法学上的改进和衍化,使其不断有各具特点的新测定法问世,如应用生物素-亲和素放大系统(biotin-axidin system,BAS)的ELISA;利用酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定(enzyme linked immunofluorecence assay,ELFIA),斑点-ELISA(dot-ELISA)和酶联免疫电转移印迹法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB)以及酶联免疫化学发光测定(enzyme linked immunochemiluminescence assay,ELICLA)等.新方法不仅进一步提高了测定灵敏,特异性,而且使ELISA技术在提高自动化程度的同时,也便于单份样本测定和简化设备条件,尤其试用于急诊,社区诊所及家庭化验.膜载体的酶免疫测定固相膜免疫测定(solid phase membrane-based immuoassay )与固相酶免疫测定(ELISA)相类似,其特点是以微孔膜作为固相.标记物可用酶和各种有色微粒子,如彩色乳胶,胶体金,胶体硒等,以红色的胶体金最为常用.固相膜的特点在于其多孔性,像滤纸一样.固相膜可被液体穿过流出,液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行.利用这种性能建立了两种不同类型的快速检测方法.常用的固相膜为硝酸纤维素(nitrocellulose,NC)膜.一斑点酶免疫吸附试验斑点-ELISA(dot-ELISA)实验原理与常规的ELISA相同,不同之处在于斑点-ELISA所用载体为蛋白质具有极强吸附力(近100%)的硝酸纤维素(NC)膜,此外酶作用底物后形成有色的沉淀物,使NC染色实验方法为:加少量(1~2μl)抗原于膜上,由于NC膜吸附能力强,故需在干燥后进行封闭;然后滴加样品血清,其中的待检抗体即与NC膜上抗原结合;洗涤后再滴加酶标二抗,最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液(如HRP标记物,常用二氨基联苯胺);阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点.斑点-ELISA的优点为:NC膜吸附蛋白力强,微量抗原吸附完全,故检出灵敏度可较普通ELISA高6~8倍;试剂用量教ELISA节约约10倍;操作简单,实验及结果判断不需特殊设备条件;吸附抗原(抗体)或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可长达半年),不影响其活性.二免疫渗滤实验免疫渗滤实验(IFA)的基本原理是:一硝酸纤维素(NC)膜为载体,利用微孔滤膜的可滤过性,使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成.免疫渗滤实验最初是从斑点ELISA基础上发展建立起来的,应用的结合物是酶标记的.20世纪90年代初发展了以胶体金为标记物的金免疫渗滤实验(GIFA),省却了酶对底物的反应,更加简单,快速.渗滤装置是IFA中的主要试剂成分之一,由塑料小盒,吸水塑料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分著称.塑料小盒可以是多种形状的,盒盖的中央有一直径约为0.4~0.8cm的小圆吸孔,盒内垫放吸水塑料,NC膜片安放在正对盒盖的圆孔下,紧密关闭盒盖,是NC膜片贴紧水塑料.如此即制备成一渗滤装置.整个反应过程都在渗滤装置中进行,因此又常称位扁平长方形渗滤装置为反应板.以双抗体夹心HCG为例,于小孔内滴加标本1~2滴,待完全渗入.此时标本中的HCG 与NC膜上的抗βHCG相结合.再于小孔内滴加结合物试剂1~2滴,待完全渗入,金标记的抗αHCG抗体与NC膜上的HCG形成双抗体夹心复合物.因胶体金为红色,在NC 膜上出现红色斑点.在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示者判断为阳性反应;反之,则为阴性反应,斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度.有将包被斑点由圆点式改成短线条式的:质控斑点横向包被成横线条,如"-"'反应斑点纵向包被成竖线条,如"│";两者相交成"+".这样,阳性反应结果在膜上显示红色的正号(+),阴性结果则为负号(-),目视判断直观,明了.三免疫层析实验免疫层析实验(ICA)是继IFA之后反站起来的另一种膜固相免疫测定.与IFA利用微孔膜的过滤性能不同,ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动,犹如层析一般.移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域的抗原或抗体结合而被固相化,无关物质则越过该区域而被分离,然后通过标记物的显色来判定实验结果.以胶体金为标记物的实验称为金免疫层析实验(GICA).ICA中所用的试剂全部为干试剂,它们被组合在一试剂条上.试剂条的底版为一单面胶塑料片,A,B两端粘贴有吸水材料.加样端A为样品垫,可用的材料有滤纸,多孔聚乙烯和玻璃纤维等,按分析物和试剂的不同选择合适的材料.B端为吸水垫,材料则为吸水性强的滤纸为佳.G处为结合物垫,胶体金结合物干燥固定在玻璃纤维膜等材料上.G,B之间粘贴吸附有抗原或抗体的硝酸纤维素膜,抗原或抗体往往以直线的形式包被在膜上.一双抗体夹心法测HCG为例.试条中G处为金标记的抗αHCG,NC膜上T处包被抗βHCG,C处包被抗小鼠IgG抗体.测试时在A端加尿液(或将A端浸入尿液中),通过层析做HCG-HCG复合物;移行至T区,形成金-抗α-HCG-HCG-抗βHCG复合物,在T区显示红色线条,为阳性反应.多余的金标记抗αHCG移行至C区时被抗小鼠IgG抗体捕获,而显示出红色对照线条.如尿液中不含HCG,在T区不出现红色线条,仅在C区出现红色线条,实验结果为阴性.如C区无红色线条出现,表示实验无效.双抗体夹心法⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量.双位点一步法操作步骤⑴将1个McAb与固相载体联结,形成固相McAb.洗涤除去未结合物.⑵同时加入待测标本和酶标McAb,孵育,使待检抗原和固相McAb及酶标McAb反应形成双抗体夹心复合物.洗涤除去未结合物.⑶加底物显色.间接法操作步骤⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质.⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相.⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分结合,洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分.⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物.⑸加底物显色.双抗原夹心法操作步骤⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未结合物.⑵加入待检标本,孵育,使待检抗体和固相结合.洗涤除去未结合物.⑶加入酶标抗原,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物.洗涤除去未结合物.⑷加底物显色.竞争法操作步骤⑴将已知抗体包被载体,形成固相抗体.洗涤除去未结合物.⑵加入待检标本和酶标抗原,孵育,使两者与固相抗体竞争结合.洗涤除去未结合到固相上的游离酶标抗原及其他未结合物.⑶加底物显色.颜色深浅与待测抗原量成反比.同理,也克用固相抗原和酶标抗体作试剂,使固相抗原和标本中的待检抗原竞争结合酶标抗体.待检抗原竞争抑制酶标抗体和固相抗原结合,即待检抗原越多,显色越浅.。