土壤蛋白酶测定
土壤酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN 的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL 置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内在分光光度计上于578nm处比色。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法（一）方法原理本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。
用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。
（二）试剂1）1%精胶2）甲苯3）铜-磷酸盐溶液：① 27.3g CuCl2·H2O溶于1 L水；②64.5g Na2HPO4·12H2O 溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀释至1L；③57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合。
4）甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至1 L （1mL含50μg NH3-N）。
（三）操作步骤（1）标准曲线绘制取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的铜-磷酸盐溶液。
显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。
（2）土壤蛋白酶活性测定称取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。
培养结束后，将悬液过滤，取10mL 滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。
显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。
以每克土壤在37℃下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（μg）表示蛋白酶活性。
土壤蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水杨酸比色法分析意义：对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。
（一）方法原理蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
土壤五种酶的测定方法
参考文献：1、关松荫等，编著. 土壤酶及其研究法[M].农业出版社，1986.2、周礼凯，编著. 土壤酶学[M].科学出版社关松荫等，1986蔗糖酶：比色法(1) P274-276脲酶：比色法P294-297蛋白酶：比色法9(1) P302-304磷酸酶：磷酸苯二钠法(2) P312-313过氧化氢酶：容量法P323蔗糖酶比色法1、试剂(1) 苯甲酸溶液0.25%(2) 3,5-二硝基水杨酸(3) pH5.5磷酸缓冲液(4) 8%蔗糖溶液(5) 甲苯2、操作步骤5克风干土→50mL三角瓶→15mL 8%蔗糖溶液→5mL pH5.5磷酸缓冲液→5滴甲苯→摇匀放入恒温箱→37℃培养24h →取出迅速过滤→吸取滤液1mL →流水冷却3min →蒸馏水稀释至50mL →508nm比色3、结果计算蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。
葡糖糖（毫克）= a×4式中a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数4——换算成1g土的系数标准曲线：以光密度为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标。
Y=0.229×（－0.0209）R２=0.9961注意：Y值为吸光度值，相当于表中的A平均X值为根据上述公式计算的结果，相当于a值葡萄糖含量为a* 4 （毫克）蛋白酶比色法（1）1.试剂（1）1%酪素溶液（2）0.1N硫酸（3）20%硫酸钠（4）2%茚三酮液（5）甲苯（6）甘氨酸标准溶液2.操作步骤4g风干土→50ml三角瓶→20ml1%酪素液→1ml甲苯→30℃恒温箱24h→2ml0.1N硫酸→12ml20%硫酸钠液→15min(6000转/min)离心→上清液2ml 50ml容量瓶→1ml茚三酮→沸水浴10min→蒸馏水稀释至刻度→500nm比色3.结果计算蛋白酶活性，以24h后1g土壤中氨基氮的毫克数表示。
NH2-N(mg)=a*5式中 a——从标准曲线查得氨基氮毫克数b——换算成1g土的系数标准曲线：以光密度为纵坐标，以氨基氮浓度为横坐标。
土壤酶的测定方法
参考关松萌等编制的土壤酶及其研究法一、土壤蔗糖酶3，5- 二硝基水杨酸比色法：1、试剂的配制①3，5- 二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，加30g的酒石酸钾钠，用水稀释至100ml.（不超过七天）②pH5.5磷酸缓冲溶液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2HPO4.2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成。
③8%蔗糖溶液。
④甲苯。
⑤标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50—58℃条件下，真空干燥至恒重。
然后取500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5ml还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液。
再用标准溶液制成1ml含0.01—0.05mg葡萄糖工作溶液。
标准曲线绘制：取1ml不同浓度的工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。
2、操作步骤称5g风干土，置于50ml的三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5ml pH5.5磷酸缓冲溶液和5滴甲苯。
摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
到时取出，迅速过滤。
从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml3，5- 二硝基水杨酸溶液,并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个实验需做无土对照。
无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。
无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。
3、结果计算蔗糖酶活性以24小时后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。
葡萄糖（毫克）=a×4式中：a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数4——换算成1g土的系数二、土壤淀粉酶3，5- 二硝基水杨酸比色法:1、试剂配制①1%淀粉。
脲酶、蛋白酶和L-天冬酰胺酶活性测定方法
一、脲酶活性测定方法（苯酚钠-次氯酸钠比色法）1.称取5g过100目筛的风干土样于50ml容量瓶中，加入1ml甲苯使其与土样充分混匀静置15min，使土壤中微生物被完全杀死；2.往瓶中加入10ml 100g/L的尿素溶液和20ml柠檬酸盐缓冲液，仔细混匀后置于37℃恒温下培养24h；3.用加热至38℃的蒸馏水稀释至刻度线（甲苯应浮在刻度线之上），摇匀，过滤；4.每一土样都设置用水代替基质的对照；对整个实验，设置无土壤的对照，以检验试剂的纯度；5.吸取3ml滤液到50ml容量瓶中，用水稀释至15ml，然后加入4ml苯酚钠溶液，并加入3ml次氯酸钠溶液，每次加完试剂都要摇匀；6.静置20min后，使其充分显色，定容显色液，于分光光度计578nm处比色，脲酶活性以24h后1g土壤中铵态氮的mg数表示。
1.取25ml酪氨酸基质溶液于100ml三角瓶中，于30℃水浴保温；2.加入5g鲜土，1ml甲苯，混匀后，30℃恒温箱中培养48h；3.取出三角瓶，加入25ml蛋白质沉淀剂，静置30min，待蛋白质沉淀后用干滤纸过滤；4.取2ml滤液于试管中，加入0.55mol/L Na2CO35ml，33% Folin试剂1ml，立即振荡；5.将试管放入30℃恒温水浴中，显色30min；6.用分光光度计在波长680nm处测定光密度，由标准曲线查出酪氨酸含量。
1.称取5g鲜土（过10目）于50ml刻度试管中，加0.2ml甲苯和9ml Tris缓冲液，混匀后加入1ml 0.05mol/L L-天冬酰胺溶液，混匀，37℃下培养2h后，加入35ml KCl-Ag2SO4混合溶液，混合均匀，静置冷却至室温（约5min），用KCl-Ag2SO4混合溶液定容，混匀；2.吸取20ml L-天冬酰胺溶液前，加入KCl-Ag2SO4混合溶液。
蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定
蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定
称取29过lm二筛的风干土样置于IOOml三角瓶中。
往三角瓶中加入0.5ml甲苯，摇匀后放置15分钟。
再加入10ml用pH7.4磷酸缓冲液配制的白明胶溶液，将瓶塞紧，小心摇荡。
将三角瓶置于30℃恒温箱中，培养24h。
培养结束后，将瓶中悬液用致密滤纸过滤至另一三角瓶中。
吸取sml滤液于一试管中，加 0.5ml0.IN硫酸和 3ml20%硫酸钠以沉淀蛋白质，然后再过滤到另一试管中。
于上述试管中加入lm120/0荀三酮溶液，将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴上
加热 10min。
将着色液转移到50ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度。
用光电比色计于56Onm处进行比色测定。
实验设无土对照和无基质对照。
蛋白酶活性以24h后19土壤中酶促反应后生成的甘氨酸毫克数表示。
中性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定
取10.00g新鲜土壤(<lmm)于 100ml容量瓶中，加入1.5ml甲苯，室温下静置15min，然后加 10ml磷酸苯二钠溶液和ZOml柠檬酸缓冲溶液，盖上瓶塞，充分混匀后，37’C下培养3h，用38.C去离子水定容至IOOml，摇匀后迅速过滤。
同时做空白对照，用10ml去离子水代替磷酸苯二钠溶液。
三次重复。
取上述滤液卜4ml于 50ml容量瓶中，加 2.5ml缓冲液，混匀后用去离子水稀释至大约4Oml，再加0.5m12，6一二滇2424酮氯亚按溶液，室温下20一3Omin，定容至50ml，在 600nm处比色测定。
结果以24h后19土壤中释放出的酚的mg数表示。
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【摘要】从海南土壤中筛选得到一株高产蛋白酶的菌株,并对其进行菌种鉴定、产蛋白酶发酵条件优化及蛋白酶分子质量测定.经筛选,得到一株高产蛋白酶的菌株,编号为CAUH83,蛋白酶活力达到126 U/mL.通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,鉴定菌株CAUH83为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).通过单因素试验优化,确定该菌株产蛋白酶的最优发酵条件:大豆粉3.0％、蔗糖3.0％、初始pH 6.0、培养温度30 ℃、培养时间48 h.在此优化发酵条件下,该菌株产蛋白酶酶活力达到1 932.3 U/mL,较优化前提高15.3倍.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶谱分析表明该蛋白酶分子质量约51 kDa.%A strain with high yield protease was isolated from soil sample of Hainan. The identification, fermentation conditions optimization and molecular mass of the strain were determined. After screening, a strain CAUH83 with high yield protease was obtained and the enzyme activity was 126 U/ml. Through morphological observation, physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis, strain CAUH83 was identified asSerratia marcescens. The optimal fermentation conditions were optimized by single factor experiments as follows: soybean flour 3.0％, sucrose 3.0％, initial pH 6.0, culture temperature 30 ℃ and time 48 h. Under the optimal conditions, the highest protease activity of the strain was 1 932.3 U/ml, which increased 15.3 times higher than that of before optimization. The molecular mass of the protease was about 51 kDa by SDS-PAGE and protease zymogram analysis.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】6页(P66-71)【关键词】粘质沙雷氏菌;筛选鉴定;蛋白酶;发酵条件优化【作者】耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学工学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文【中图分类】TS201.3蛋白酶(protelytic enzymes,EC 3.4)是催化肽键水解的一类酶,在食品、饲料、医药、化工等行业有着广泛的应用［1］。
土壤酶活性测定的实验步骤
土壤酶活性测定的实验步骤土壤酶的测定1．三角瓶用稀HNO3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。
2．土样研磨精细后分袋装好。
土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5某2=29g。
一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）1．试剂配制：(1)0.3%过氧化氢溶液：①（1：10030%的H2O2和水）②（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水）③（1ml30%H2O2+99ml蒸馏水）(2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）(3)0.1N 高锰酸钾溶液：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）2．操作步骤：2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色3．结果计算过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1NKMnO4的毫升数表示：M=（A－B）某T式中：A：空白消耗的0.1NKMnO4毫升数B：滤液消耗的0.1NKMnO4毫升数T：KMnO4滴定度的校正值备注：以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。
此法根据H2O2与土壤相互作用时，未分解的H2O2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H2O2）测定H2O2的酶活2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用二、蔗糖酶（P278）滴定法1.试剂配制：(1)20％蔗糖：（20g蔗糖＋80ml水或12.5g蔗糖＋50ml水）(2)甲苯(分析纯)(3)PH5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液0.5ml磷酸氢二钠·12H2O(1/15M)+9.5ml磷酸二氢钾（1/15M）磷酸氢二钠·12H2O(1/15M)：23.88gNa2HPO4,，加H2O溶解，定容至100ml。
土壤蛋白酶测定-ZQX
土壤蛋白酶测定（专用）吴金水Folin-Ciocalteu比色法测定—Sunny1 方法原理其基本原理是酪蛋白酸钠在蛋白酶作用下，水解为酪氨酸。
释放的数量和速率与酶活性之间存在线性关系。
2 主要仪器：离心管（100 ml），试管（25 ml），分光光度计，可调式恒温水浴锅，离心机。
3 试剂和材料3.1 Tris缓冲液[c（C14H11NO3）=50 mmol/L，pH 8.1]: 6.05 g三羟甲基氨基甲烷溶于700 ml去离子水，用稀HCl调节pH值至8.1，用去离子水稀释至1 L。
3.2 酪蛋白酸钠（2%）：10 g酪蛋白酸钠溶于50℃的去离子水，在搅拌下稀释至500 ml。
如果只有酪蛋白（干酪素），可用10 g酪蛋白溶于上述Tris缓冲液，用稀NaOH溶液调节pH至8.1，再用Tris缓冲液稀释至500 ml。
3.3 三氯乙酸（15%）：75 g三氯乙酸（TCA，C2HCl3O2）溶于300 ml去离子水，再稀释至500 ml。
3.4 NaOH-NaCO3溶液：50 g无水Na2CO3溶于60 ml 1 mol/L NaOH溶液，用去离子水稀释至1 L。
3.5 硫酸铜溶液（0.5%）：0.5 g CuSO4.5 H2O溶于少量去离子水。
稀释至100 ml。
3.6 酒石酸钾钠溶液（1%）：1 g酒石酸钾钠（C4H4KNaO6.4H2O）溶于少量去离子，稀释至100 ml。
3.7 碱性试剂：将上述NaOH-NaCO3溶液、0.5%硫酸铜溶液、1%酒石酸钾钠溶液按100:2:2（V）比例混合即可。
3.8 福林（Folin）试剂（33%）：167 ml Folin试剂用去离子水稀释至500 ml。
此稀释液不稳定，应在使用前配制并置4℃下存放。
3.9 酪氨酸标准溶液[p（C9H11NO3）=500 ug/ml]：50 mg酪氨酸（预先于105℃干燥至恒重）溶于Tris缓冲液，并定容至100 ml。
土壤酶活活性测定方法
土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。
（二）试剂1）甲苯）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。
毫升。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水使用前将2溶液各20毫升混合，溶液保存在冰箱中。
使用前将毫升水（（B）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
毫升。
用蒸馏水稀释至100毫升。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。
氮的标准液。
（三）测定步骤）标准曲线绘制（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。
将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
（2）土壤中脲酶活性的测定）土壤中脲酶活性的测定称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。
用2mL甲苯处理15分钟。
往瓶中加土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法（一）方法原理本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。
用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法土壤酶活性测定方法一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法1. 试剂配制（1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。
（2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超过7天）。
（3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O 溶于1000mL蒸馏水中。
（4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。
（5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。
（7）甲苯。
（8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。
然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄糖母液（10mg还原糖/ml）。
取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准葡萄糖液（1mg/ml）；2. 操作步骤（1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。
用蒸馏水补足至10mL。
加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。
最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。
比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。
（2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。
摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
一种土壤蛋白酶测定方法的探究
一种土壤蛋白酶测定方法的探究摘要：蛋白酶测定常用方法是茚三酮比色法，然而普通的茚三酮比色法测定氨基酸浓度的灵敏性不高，稳定性不好，从而影响了测定土壤蛋白酶活性的准确度，因此，本研究在前人研究的基础上，进行了茚三酮试剂的活化，改进了茚三酮比色法，达到了以更高的精度测量蛋白酶活性的目的。
关键词：土壤酶蛋白酶活性变更茚三酮比色法土壤中存在着很多酶类，主要来源于动植物、微生物的细胞分泌物以及残体的分解物，它们是土壤的重要组成部分之一[1]。
而蛋白酶属于是土壤中基本都有的的酶类，蛋白酶可以将土壤中的各种蛋白质以及肽类等化合物水解使之变成氨基酸，因此土壤中蛋白酶的活性与土壤中氮素营养的转化状况有极其重要的关系，所以研究蛋白酶的测定方法十分有意义[2]。
测定土壤蛋白酶的方法有铜盐比色法、茚三酮比色法和三氯化铁滴定法，常用的基质有酪素、明胶等[3]。
本文使用酪素为基质，茚三酮比色法测定土壤蛋白酶活性。
使蛋白酶酶促蛋白质水解成为氨基酸，并与茚三酮反应形成蓝紫色的化合物，颜色的深浅与试液中氨基酸含量符合朗伯-比尔定律，呈正比，因此可通过测定试液的吸光度，求得试液的氨基酸含量（每克土壤中氨基氮毫克数），用此表示蛋白酶的活性。
本研究在加勒斯江法测量土壤中蛋白酶活性的基础上，重点对其中的茚三酮显色液的配制方法进行改进，以此来提高茚三酮比色法测量氨基酸的灵敏度和稳定性。
1实验方法1.1实验原理蛋白酶能够使蛋白质水解后得到肽，进一步水解就会生成氨基酸[4]，具体水解过程是蛋白质、蛋白朊、蛋白胨、多肽、二肽、氨基酸。
先准备好含有一定浓度的蛋白酶溶液，之后加入蛋白质，使它们反应一段时间，最后测量生成的氨基酸的含量，以此来测定蛋白酶的活性[5]。
比色法是测定土壤中蛋白酶活性的最常用方法[6]，蛋白质水解后产生氨基酸，令氨基酸与某些物质反应生成带颜色的络合物，比如说铜盐蓝色络合物或茚三酮等物质。
根据溶液测得吸光度值大小与氨基酸含量的关系，求得氨基酸量（每克土壤中氨基氮毫克数），用此表示蛋白酶的活性。
土壤蛋白酶检测方法
土壤蛋白酶检测方法《土壤蛋白酶检测方法：超接地气的独家秘籍》嘿，宝子们！今天我要跟你们唠一唠土壤蛋白酶检测方法，这就像是挖掘土壤里的小秘密一样有趣呢！一、前期准备工作首先啊，咱得把装备都给整齐全了。
就像出门旅行得带齐东西一样，检测土壤蛋白酶也有它的一套“行李”。
1. 采集土壤样本咱得找个合适的地方去挖土。
这可不是随便挖挖就行的，就好比你找宝藏，也得有点线索。
一般来说呢，要选择有代表性的地方，比如说农田里、花园里那些植物长得比较有特点的地方。
可别去那种刚被化肥“轰炸”过的小角落啊，那数据可不准。
我有一次就犯傻，跑到农场主刚倒了一堆奇怪肥料的地方挖土，结果测出来的数据就像喝醉了酒的人走路，完全不靠谱。
用小铲子小心翼翼地把土挖出来，大概挖个10 - 15厘米深就差不多了。
然后把土放到干净的小袋子里，就像给它找个临时的小窝。
记得给这个小袋子贴上小标签，写上采集的地点和时间，这就好比给这个土宝宝办个身份证，方便咱以后知道它是从哪儿来的。
2. 准备检测试剂和器材这就像是厨师做菜得有锅碗瓢盆和调料一样。
我们需要一些特定的试剂，比如说酪蛋白溶液，这可是检测土壤蛋白酶的关键“调料”。
还有福林酚试剂，这就像个小侦探，能帮我们找到蛋白酶的踪迹。
器材呢，要有试管、移液枪、离心机这些家伙事儿。
移液枪这个东西可好玩了，就像个小注射器，但比注射器高级多了，能准确地吸取咱们需要的液体量。
试管要洗得干干净净的，要是不干净，就像穿着脏衣服去参加宴会一样，会把整个检测都搞砸的。
二、检测步骤1. 土壤样本处理把采集来的土壤从袋子里拿出来，就像叫醒正在睡觉的小土人儿。
称取一定量的土壤，这个量就像做菜放盐一样，得恰到好处，一般5 - 10克就行。
把称好的土放到试管里，然后加入适量的缓冲溶液。
这缓冲溶液就像个温柔的小保姆，能让土壤处在一个比较舒服的环境里，不至于太酸或者太碱，影响我们的检测结果。
然后把试管放到振荡器上振荡一会儿，这就像给土壤做个小按摩，让土壤里的蛋白酶能更好地和其他物质混合起来。
最新相关土壤酶测定方法(综合)
土壤蛋白酶活性测定(茚三酮比色法)实验试剂：1、pH7.6的0.05mol/L的tris—HCL缓冲液(三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液):50ml0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷与27.5ml0.2mol/L的盐酸混合,稀释成200ml。
2、2%酪酸钠溶液:称取2g 酪酸钠,加入10ml0.1mol/L的NaOH溶液,沸水浴处理5min,待膨化后加入pH7.6的tris—HCl缓冲液约80ml,继续沸水浴处理,直至完全溶解,用同样的缓冲液定容至100ml。
3、Tris—HCl—CaCl2混合溶液:用pH7.6的0.05mol/Ltris—HCl缓冲液配制的0.01mol/L的CaCl2溶液。
4、0.6mol/L乙酸铅溶液。
5、草酸钠—乙酸混合溶液:每1000ml0.26mol/L的草酸钠溶液含有240.7ml0.2mol/L的乙酸。
6、茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂:称取2g茚三酮,0.02g 抗坏血酸,溶于100ml无水乙醇。
7、0.2%KIO3溶液。
8、pH5.8乙酸—乙酸钠缓冲液:94 ml0.2mol/L乙酸钠与6ml0.2mol/L乙酸混合。
9、0.01%甘氨酸标准溶液:1g甘氨酸溶于1000ml水,再稀释10倍。
10、甲苯。
以上试剂均为分析纯。
实验仪器:基本仪器如试管、烧杯等、离心机、分光光度计、刻度试管、水浴锅、电子天平、移液管实验步骤1、标准曲线的绘制①分别吸取50 、100、150、200、250、300μl0.01%甘氨酸标准溶液,置于10 ml刻度试管中(浓度分别相当于NH2 0.107、0.213、0.320、0.426、0.533、0.639μg/ml),加入2mlpH5.8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液②加入1.5ml 茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂,混合均匀,沸水浴加热16min③取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀,用蒸馏水定容至10ml,1h内在570nm处比色测定吸光值;以氨基氮(NH2)的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。
泥土蛋白酶测定[整理版]
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土壤蛋白酶测定（加勒斯江法）1. 分析意义蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。
它们的水解产物是高等植物的氮源之一。
土壤蛋白酶在剖面中的分布与蔗糖酶相似，酶活性随剖面深度而减弱。
并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。
2. 试验原理蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽，肽进一步水解成氨基酸。
测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法，根据蛋白酶酶促蛋白质产物－氨基酸与某些物质（如铜盐蓝色络合物或茚三酮等）生成带颜色络合物。
依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的关系，求出氨基酸量，以表示蛋白酶活性。
3. 试验步骤取2g过1mm筛的风干土置于50mL容量瓶中，加入10mL 1％用pH7.4磷酸盐缓冲溶液配制的白明胶溶液和0.5mL甲苯（作为抑菌剂抑制微生物活动）；在30℃恒温箱中培养24h；培养结束后，将瓶中内容物过滤；取5mL滤液置于试管中，加入0.5mL 0.1N硫酸和3mL 20％硫酸钠以沉淀蛋白质，然后滤入50mL容量瓶，并加入1mL 2％茚三酮溶液；将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10min；将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度线；最后在560nm处进行比色。
用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质（如石英砂）作对照，方法如前所述，以除掉土壤原有的氨基酸引起的误差。
换算成甘氨酸的量，根据用甘氨酸标液制取的标准曲线查知。
4. 试剂配制a. 1%白明胶溶液（用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制）；b. 甲苯；c. 磷酸盐缓冲液（pH7.4）；d. 0.1N H2SO4;e. 20％Na2SO4；f. 2％茚三酮溶液：将2g茚三酮溶于100mL丙酮，然后将95mL该溶液与1mL CH3COOH 和4mL水混合制成工作液（该工作液不稳定，只能在使用前配制）；g. 甘氨酸标准液：浓度为1mL含100μg甘氨酸的水溶液：0.1g甘氨酸溶解于1L蒸馏水中。
再将该标液稀释10倍得10μg 甘氨酸•1mL -1溶液的甘氨酸工作液。
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。
它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。
土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。
根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。
人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。
本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g 尿素，用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。
4）苯酚钠溶液（L）:苯酚溶于少量乙醇，力口2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。
三、操作步骤称取5g 土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37C恒温箱培养24小时。
培养结束后过滤，过滤后取1ml 滤液加入50ml 容量瓶中，再加4ml 苯酚钠溶液和3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20min后显色，定容。
1h内在分光光度计与578nm波长处比色。
（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。
标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。
土壤中性蛋白酶(S-NPT)检测
土壤中性蛋白酶（S-NPT）检测
土壤中性蛋白酶（Soil neutral protease, S-NPT）是指在中性环境下催化蛋白质水解的酶，属于一种内切酶，与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。
土壤中性蛋白酶的测定原理：中性条件下，S-NPT将酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝，在680nm处有特征吸收峰，通过吸光值变化即可表征土壤中性蛋白酶活性。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测土壤中性蛋白酶活性变化。
此外，我们还提供其他土壤酶类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定土壤中性蛋白酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 土壤中性蛋白酶活性信息。
几种土壤酶的测定方法
土壤酶的测定方法（一）蔗糖酶方法：比色法1 试剂配制（1）20%蔗糖（质量分数）（2）甲苯（3）pH=5.5醋酸盐缓冲液：取120 ml 冰醋酸用水稀释至1 L（a），取164 g无水CH3COONa 溶于水并稀释至1 L（b），将（a）与（b）二液按1:8混合再用pH计校正pH。
（4）0.2 M Na2HPO4·12H2O（5）钼溶液：配制5%钼酸铵水溶液（a），再取200 ml浓硫酸加800 ml水（b）。
使用前将（a）、（b）二液按1:1混合。
（6）铜试剂：取50 g CuSO4·5H2O溶于500 ml水中（a），取25 g Na2CO3、25 g酒石酸钾钠、20 g NaHCO3和200 g Na2SO4溶于水并稀释至1 L再加几滴甲苯（b）。
使用前将（a）、（b）二液混合。
（7）葡萄糖标准溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。
然后取500 mg溶于100 ml苯甲酸溶液（饱和）中（5 mg还原糖/ml），即成标准葡萄糖溶液。
再用标准液制成1 ml含0.01-0.5 mg葡萄糖的工作溶液。
2 标准曲线绘制：将（7）所述的葡萄糖标准溶液稀释成1 mg/ml 还原糖工作液。
然后，取不同体积（0.5-50 ml）工作液移于100 ml容量瓶中，加入10 ml pH=5.5醋酸盐缓冲液，用水稀释至刻度。
吸取此液5 ml移于100 ml容量瓶中，加4 ml铜试剂。
在沸腾水浴上放置25 min，冷却至室温。
再加2 ml 0.2 M磷酸氢二钠和5 ml钼溶液，显色1 min定容，在分光光度计上于578 nm 处比色，根据光密度值和浓度绘制标准曲线。
3 操作步骤取10 g土壤（&填料）置于100 ml容量瓶中，加2 ml甲苯。
15 min后加10 ml 20 %蔗糖和10 ml pH=5.5醋酸盐缓冲液，置于37℃恒温箱中培养24 h。
培养结束后，过滤并定容，按绘制标准曲线操作步骤显色、比色。
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土壤蛋白酶测定（加勒斯江法）
1. 分析意义
蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。
它们的水解产物是高等植物的氮源之一。
土壤蛋白酶在剖面中的分布与蔗糖酶相似，酶活性随剖面深度而减弱。
并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。
2. 试验原理
蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽，肽进一步水解成氨基酸。
测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法，根据蛋白酶酶促蛋白质产物－氨基酸与某些物质（如铜盐蓝色络合物或茚三酮等）生成带颜色络合物。
依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的关系，求出氨基酸量，以表示蛋白酶活性。
3. 试验步骤
取2g过1mm筛的风干土置于50mL容量瓶中，加入10mL 1％用pH7.4磷酸盐缓冲溶液配制的白明胶溶液和0.5mL甲苯（作为抑菌剂抑制微生物活动）；在30℃恒温箱中培养24h；培养结束后，将瓶中内容物过滤；取5mL滤液置于试管中，加入0.5mL 0.1N硫酸和3mL 20％硫酸钠以沉淀蛋白质，然后滤入50mL容量瓶，并加入1mL 2％茚三酮溶液；将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10min；将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度线；最后在560nm处进行比色。
用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质（如石英砂）作对照，方法如前所述，以除掉土壤原有的氨基酸引起的误差。
换算成甘氨酸的量，根据用甘氨酸标液制取的标准曲线查知。
4. 试剂配制
a. 1%白明胶溶液（用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制）；
b. 甲苯；
c. 磷酸盐缓冲液（pH7.4）；
d. 0.1N H2SO4;
e. 20％Na2SO4；
f. 2％茚三酮溶液：将2g茚三酮溶于100mL丙酮，然后将95mL该溶液与1mL CH3COOH 和4mL水混合制成工作液（该工作液不稳定，只能在使用前配制）；
g. 甘氨酸标准液：浓度为1mL含100μg甘氨酸的水溶液：0.1g甘氨酸溶解于1L蒸馏
水中。
再将该标液稀释10倍得10μg甘氨酸•1mL-1溶液的甘氨酸工作液。
标准曲线绘制：分别吸取0、1、3、5、7、9、11mL 该工作液于50mL 容量瓶中即获得甘氨酸浓度分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2μg •mL -1的标准溶液梯度，然后加入1mL 2％茚三酮溶液。
冲洗瓶颈后将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10min 。
将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。
在560nm 处进行比色，最后绘制标准曲线。
5. 结果计算：
土壤蛋白酶的活性，以24h 后1g 土壤中甘氨酸的微克数表示。
1c 50ts g g m
μ-⨯⨯⋅甘氨酸（）＝ 甘氨酸（μg •g -1）－24小时后1g 土壤中甘氨酸的微克数；
c －标准曲线上查得的甘氨酸浓度，μg •mL -1；
50－显色液体积，mL ；
ts －分取倍数（这里是2＝10/5）；
m －土壤质量，g 。
方法来源：曹承绵, 张志明, 周礼恺. 几种土壤蛋白酶活性测定方法的比较. 土壤通报, 1982, 13(2): 39-40.。