《分子生物实验技术》PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
A260/A280 : 是衡量蛋白质污染程度的指标，通常在1.7-1.8之 间较好； A260/A230：衡量腐殖酸污染程度的指标，一般在1.72.0 之间较好。
常用试剂盒品牌
MP Bio公司Fast-Prep SPIN Kit（for soil） Mo Bio公司ultra clean soil DNA kit
2、加978ul的sodium phosphate buffer 到样品管中 3、加122ulMT buffer (保持管中有250~500ul剩余空间） 4、在振荡器中充分振荡混匀 5、13000rpm离心10min 6、将上清液转入到一个新的无菌2ml离心管中，加250ul PPS(蛋白质
沉淀剂），手动混合10次 7、13000rpm离心5min，将上清液转入到一个无菌15ml离心管中（可用
分子生物实验技术原理
污染控制与资源化研究国家重点实验室 20120319
一、DNA提取原理和方法
核酸的理化性质 ：DNA、RNA和核苷酸都是极性化合 物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解 度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性 溶液中较稳定。
DNA提取原理
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中 提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白除去，再除去细胞中的糖，RNA 及 无机离子等，从中分离DNA。
步骤
1、细胞破碎 三种方法 ➢ 机械方法：超声破碎法、研磨法、匀浆法； ➢ 化学试剂法：SDS处理； ➢ 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，使细胞壁破碎。
power clean soil DNA kit Qiagen公司：QIAamp DNA Stool Mini Kit Omiga 公司 国产试剂盒 按试剂盒操作说明提取样品DNA，置-20℃保存备用
Fast-Prep SPIN Kit（for soil） 操作说明
1、称量500mg土样（离心适量活性污泥）到一个Lysing Matrix E管 中，冰上静置2min。
10ml管代替） 8、摇匀Binding Matrix suspension，加1ml到15ml管的上清液中
9、振荡离心管2min使DNA充分结合，再静置3min来沉淀Si化 合物
10、小心的弃去700ul的上清液 11、重新悬浮剩余的上清液中的混合液，吸取700ul混合液到
SpinTM Filter中，13000rpm离心1min，倒空收集管，再 将剩余的混合物加入到SpinTM Filter中，如前操作 12、加入500ulSEWS-M,轻柔的悬浮管中的Si 化合物 13、13000rpm离心1min，倒空收集管（重复12、13步一次） 14、13000rpm离心2min，使收集柱干燥，并将其置于一个新 的无菌离心管中 15、在室温下静置5min，空气干燥SpinTM Filter 16、小心的加入50~100ul的DES（或ddH2O),使所有的Si化合 物湿润，55℃温浴5min 17、13000rpm离心1min，弃去SpinTM Filter，液体保存备用
பைடு நூலகம்
环境样品常见的有水样、土壤、生物膜等
水样可以先用0.22um的微孔滤膜过滤，然后把微 孔滤膜剪碎，用于提取DNA
土壤、垃圾、生物膜、活性污泥这些样品因为杂 质较多，在提取时要考虑杂质的影响，可先预处 理去除一部分干扰物质后再提取
具体方法很多：直接提取法、间接提取法
1、水样DNA提取
用0.22um微孔滤膜过滤水样，将滤膜放入离心管，加TE 充分 震荡混匀，12000rpm收集菌体，再悬浮于1ml TE，加20ul 20mg/ml 溶菌酶，室温10min；加40ul蛋白酶K，37度1h，加 1/3体积5M NaCl，剧烈震荡混匀， 12000rpm 离心5min，上清 液用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，上清液加 0.6V异丙醇沉淀离心后70%乙醇洗涤沉淀，再溶于TE中，加 1/10V 3M pH5.2 NaAc后，2.5V 无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤 后溶于50ul TE中，测定A260/A280， A260/A230 确定DNA的纯度和 浓度
（3）苯酚抽提法
苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的活性。用苯 酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子 表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于 酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复 操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质， 用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃 漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天 然状态 。
C. 以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA 的 分离。在提取过程中为抑制样品中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液 中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用1.5M NaCl，0.015M柠檬酸 钠（并称SSC溶液）提取DNA。
（2）阴离子去污剂法
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提 取DNA，由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去 污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。
DNA提取的几种方法
(1) 浓盐法： A. 利用RNA和DNA在电解液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M
氯化钠溶液抽提,得到的DNP粘液与氯仿：异戊醇（24:1）一起振荡，使 乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间， 而DNA位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。 B. 用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脱氧核糖 蛋白，再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。 ➢ A/B两种方法比较, B法使核酸降解可能少一些。
（4）水抽提法
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后，用低盐 溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水 中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至 2.6M。加入2倍体积95%乙醇。立即用搅拌法搅出。然后分 别用66%、80%和95%乙醇以洗涤，最后在空气中干燥，即 得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不 用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。
常用试剂盒品牌
MP Bio公司Fast-Prep SPIN Kit（for soil） Mo Bio公司ultra clean soil DNA kit
2、加978ul的sodium phosphate buffer 到样品管中 3、加122ulMT buffer (保持管中有250~500ul剩余空间） 4、在振荡器中充分振荡混匀 5、13000rpm离心10min 6、将上清液转入到一个新的无菌2ml离心管中，加250ul PPS(蛋白质
沉淀剂），手动混合10次 7、13000rpm离心5min，将上清液转入到一个无菌15ml离心管中（可用
分子生物实验技术原理
污染控制与资源化研究国家重点实验室 20120319
一、DNA提取原理和方法
核酸的理化性质 ：DNA、RNA和核苷酸都是极性化合 物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解 度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性 溶液中较稳定。
DNA提取原理
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中 提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白除去，再除去细胞中的糖，RNA 及 无机离子等，从中分离DNA。
步骤
1、细胞破碎 三种方法 ➢ 机械方法：超声破碎法、研磨法、匀浆法； ➢ 化学试剂法：SDS处理； ➢ 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，使细胞壁破碎。
power clean soil DNA kit Qiagen公司：QIAamp DNA Stool Mini Kit Omiga 公司 国产试剂盒 按试剂盒操作说明提取样品DNA，置-20℃保存备用
Fast-Prep SPIN Kit（for soil） 操作说明
1、称量500mg土样（离心适量活性污泥）到一个Lysing Matrix E管 中，冰上静置2min。
10ml管代替） 8、摇匀Binding Matrix suspension，加1ml到15ml管的上清液中
9、振荡离心管2min使DNA充分结合，再静置3min来沉淀Si化 合物
10、小心的弃去700ul的上清液 11、重新悬浮剩余的上清液中的混合液，吸取700ul混合液到
SpinTM Filter中，13000rpm离心1min，倒空收集管，再 将剩余的混合物加入到SpinTM Filter中，如前操作 12、加入500ulSEWS-M,轻柔的悬浮管中的Si 化合物 13、13000rpm离心1min，倒空收集管（重复12、13步一次） 14、13000rpm离心2min，使收集柱干燥，并将其置于一个新 的无菌离心管中 15、在室温下静置5min，空气干燥SpinTM Filter 16、小心的加入50~100ul的DES（或ddH2O),使所有的Si化合 物湿润，55℃温浴5min 17、13000rpm离心1min，弃去SpinTM Filter，液体保存备用
பைடு நூலகம்
环境样品常见的有水样、土壤、生物膜等
水样可以先用0.22um的微孔滤膜过滤，然后把微 孔滤膜剪碎，用于提取DNA
土壤、垃圾、生物膜、活性污泥这些样品因为杂 质较多，在提取时要考虑杂质的影响，可先预处 理去除一部分干扰物质后再提取
具体方法很多：直接提取法、间接提取法
1、水样DNA提取
用0.22um微孔滤膜过滤水样，将滤膜放入离心管，加TE 充分 震荡混匀，12000rpm收集菌体，再悬浮于1ml TE，加20ul 20mg/ml 溶菌酶，室温10min；加40ul蛋白酶K，37度1h，加 1/3体积5M NaCl，剧烈震荡混匀， 12000rpm 离心5min，上清 液用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，上清液加 0.6V异丙醇沉淀离心后70%乙醇洗涤沉淀，再溶于TE中，加 1/10V 3M pH5.2 NaAc后，2.5V 无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤 后溶于50ul TE中，测定A260/A280， A260/A230 确定DNA的纯度和 浓度
（3）苯酚抽提法
苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的活性。用苯 酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子 表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于 酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复 操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质， 用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃 漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天 然状态 。
C. 以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA 的 分离。在提取过程中为抑制样品中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液 中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用1.5M NaCl，0.015M柠檬酸 钠（并称SSC溶液）提取DNA。
（2）阴离子去污剂法
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提 取DNA，由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去 污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。
DNA提取的几种方法
(1) 浓盐法： A. 利用RNA和DNA在电解液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M
氯化钠溶液抽提,得到的DNP粘液与氯仿：异戊醇（24:1）一起振荡，使 乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间， 而DNA位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。 B. 用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脱氧核糖 蛋白，再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。 ➢ A/B两种方法比较, B法使核酸降解可能少一些。
（4）水抽提法
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后，用低盐 溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水 中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至 2.6M。加入2倍体积95%乙醇。立即用搅拌法搅出。然后分 别用66%、80%和95%乙醇以洗涤，最后在空气中干燥，即 得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不 用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。