甘油法制作谷氨酸棒杆菌感受态

合集下载

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

农杆菌电击感受态的制备及电击转化表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化（1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。

按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。

（2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。

（3）农杆菌EHA105电击预备处理。

I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。

EHA105II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。

1.5mlIII. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。

IV. 重复步骤ⅲ三次。

V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。

加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。

（4）电击I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。

II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。

III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。

IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L 和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。

8000rpm1.制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。

谷氨酸发酵实验报告(1)

兰州大学生命科学学院发酵工程实验谷氨酸发酵实验摘要：谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，为发酵实验准备菌种。

还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，所以在发酵过程中，要求每两个小时测定一次还原糖的含量，并据此作出发酵的糖耗曲线。

关键字：种子的制备、发酵罐、谷氨酸棒杆菌、PH的调节引言：了解发酵工业菌种制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。

了解发酵罐罐体构造和管道系统，掌握对发酵罐及其管道系统的灭菌方法。

了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程。

还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，在发酵后期当还原糖降至1％以下时，表明谷氨酸发酵已经完成。

所以在发酵过程中，要定时测定还原糖的含量，要求每两个小时测定一次，并据此作出发酵的糖耗曲线。

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

学习使用茚三酮比色法检测发酵液中谷氨酸浓度的方法。

谷氨酸棒杆菌通常在0-12小时为生长期，12小时后为产酸期，所以应该从12小时以后开始检测谷氨酸的含量，每两个小时取一次样。

原理:谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，得到大量健壮的种子。

谷氨酸棒杆菌生长速度较快，接种量一般在1-2%。

谷氨酸发酵是有氧发酵，发酵罐由蒸汽管道、空气管道、加料出料管道等组成，在实验之前必须先对发酵罐进行空消。

谷氨酸产生菌是代谢异常化的菌种，对环境因素的变化很敏感，在适宜的培养条件下，谷氨酸产生菌能够将50％以上的糖转化成谷氨酸，而只有极少量的副产物。

如果培养条件不适宜，则几乎不产生谷氨酸，仅得到大量的菌体或者由发酵产生的乳酸、琥珀酸、а－酮戊二酸、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺等产物。

生产上的中间分析只测定一些主要数据，只能显示微生物代谢的一般概况而不能反映细微的生化变化。

因此，进一步完善生化分析项目，从生化角度对发酵进行控制，从而确定最适宜的工艺条件是提高发酵水平的重要课题之一。

甘油法制作谷氨酸棒杆菌感受态

甘油法制作谷氨酸棒杆菌感受态1，培养基LBG培养基（g/l）：酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10，ph7.0，用于培养谷氨酸棒状杆菌制备感受态的种子液。

EPO培养基（g/l）：酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10，甘氨酸30，Tween80 1。

用于谷氨酸棒状杆菌感受态的制备。

LBHIS培养基（g/l）：酵母膏2.5，蛋白胨5，氯化钠5，脑心浸液18.5，山梨醇91，用于谷氨酸棒状杆菌转化子的培养。

谷氨酸棒杆菌的培养条件：30℃，200rpm，需要卡那霉素时，加入的终浓度为30ug/ml，相应的固体培养基中加入2%的琼脂粉。

2 ，谷氨酸棒状杆菌感受态的制备：（1）将一环谷氨酸棒状杆菌的种子接种于种子培养基中，200rpm，30℃过夜培养。

（2）以10%的比例转接于100ml培养基中，使初始细胞OD达到0.3，200rpm 30℃培养3-5h至OD达到0.6-0.9。

（3）将所有菌液放入50ml离心管中冰浴15min，4000rpm，4℃离心10min。

（4）取预冷的10%甘油约30ml，充分悬浮菌体，4000rpm，4℃离心10min。

（5）再次取预冷的10%甘油重复洗涤两次。

（6）用400ul预冷的10%甘油重悬细胞，1.5ml离心管分装，每管80ul，-70℃保存或者点击转化。

3 谷氨酸棒状杆菌的电转化法：（1）将新鲜制备(或者冰箱取出)感受态细胞和连接产物置于冰上，轻弹管壁使其混匀。

（2）吸取5ul冰上预冷的质粒加入感受态细胞中，轻弹管壁使其混匀，然后冰浴5-10min。

（3）加入预冷的0.1cm电击杯中，1.8kv，5ms电击。

加入恢复用培养基LBHISml，混匀46℃水浴6min。

（4）30℃，100rpm培养1h。

（5）涂布含有抗生素的平板，30℃过夜培养观察。

感受态细胞的制备的实验步骤

感受态细胞的制备的实验步骤CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

甘油对聚谷氨酸合成的贡献

Contribution of glycerol on production of poly(γ-glutamicacid) in Bacillus subtilis NX-21Wu Qun，Xu Hong *，Liang Jinfeng，Yao JunCollege of Life Science and Pharmacy，Nanjing University of Technology，Nanjing （210009）AbstractGlycerol would stimulate the production of poly(γ-glutamic acid) (γ-PGA) and decrease its molecular weight in B. subtilis NX-2. The yield of γ-PGA increased from 26.7 to 31.7 g/l when 20 g/l glycerol was added in medium, and the molecular weight of γ-PGA could be regulated between 2.43×106 and 1.42×106 Da with glycerol concentration ranging from 0 to 60 g/l. The effect of glycerol on molecular weight of γ-PGA had never been reported, and it would be developed to be an approach for the regulation of microbial γ-PGA chain length.Keywords: B. subtilis NX-2；fermentation；glycerol；molecular weight；poly(γ-glutamic acid)1. IntroductionPoly(γ-glutamic acid), γ-PGA, is a homopolymer of D- and L-glutamic acid units produced by microbes, and it has broad applications in fields of medicine, foods, plastics and many others (Shih and Van 2001). Molecular weight is an important feature of microbial γ-PGA for the effect that molecular size has on polymer properties (Richard and Margarities 2001). However, γ-PGA produced by Bacillus sp. generally has relatively high molecular weight, and such a high molecular size polymer is too viscous, rheologically unmanageable and difficult to be modified by chemical reagents (Shih and Van 2001). Therefore, it is useful to decrease γ-PGA molecular weight during fermentation course to obtain the polymer with relatively low molecular weight.In this work, we found that glycerol present in medium would not only decrease the molecular weight of γ-PGA, but also increase the yield of γ-PGA in B. subtilis NX-2. This was the first time to discover such contribution of glycerol on γ-PGA production by Bacillus sp., and it could be used to establish a general foundation for regulation of microbial γ-PGA molecular weight.2. Materials and methodsBacterial strainsB. subtilis NX-2 was isolated from soil sample (Xu et al. 2005). It was deposited in China General Microbiological Culture Collection Center with the accession number of CGMCC No.0833.Production of γ-PGA by flask culture was performed as reported (Wu et al. 2006).Analytical methodsGlucose and glutamate were measured enzymatically using a bioanalyzer (SBA-40C, Shandong Academy of Sciences). Glycerol was determined enzymatically using analysis kit (Sigma). The volumetric yield and molecular weight of γ-PGA was measured by gel permeation chromatography system following the method reported previously (Wu et al. 2006). Every experiment was repeated for 3 times.3. ResultsImprovement of γ-PGA production with the addition of glycerol1This work was supported by the National Basic Research Program of China (973 Program, 2003CB716004), the National Nature Science Foundation of China (20674038, 20336010) and the Graduate Student Innovation Project of Jiangsu Province.As shown in Fig. 1A, glycerol had positive effect on γ-PGA fermentation in B. subtilis NX-2. When 20 g/l glycerol was added at the beginning of fermentation, the yield of γ-PGA increased from 26.7 to 31.7 g/l, and the biomass was also comparatively higher than that without glycerol. On the other hand, glycerol could decrease the molecular weight of γ-PGA (Fig. 1B), and it seemed that glycerol began to take effect at the very beginning of γ-PGA formation. This was a unique discovery in γ-PGA production, as to our knowledge, there was no report about decreasing of γ-PGA molecular weight by the addition of glycerol in medium. In addition, glycerol could effectively decrease the fermentation viscosity (Fig. 1C). When glycerol was added in medium, both the extracellular glucose and glutamate were consumed faster than those without glycerol (Fig. 1D), indicating decreasing of fermentation viscosity would relieve the mass transfer limitation, and stimulate the uptake of extracellular substrates, which would not only improve cell growth, but also stimulate γ-PGA production in B. subtilis NX-2. （Fig. 1）Effect of initial concentration of glycerol on γ-PGA productionGlycerol had positive effect on both cell growth and γ-PGA biosynthesis in B. subtilis NX-2 with the initial concentration ranging from 0 to 50 g/l, and the optimum concentration for γ-PGA production was 20 g/l (Fig. 2). While in the case of B.1icheniformis ATCC9945a, high level of glycerol was used (80 g/l) (Cromwick and Gross 1995), this was also the advantage of this strain, as the low concentration of glycerol required would efficiently lower the industrial cost. On the other hand, γ-PGA molecular weight decreased remarkably from 2.43×106 to 1.42×106 Da with glycerol concentration increased from 0 to 60 g/l, and it kept nearly constant despite further increase of glycerol concentration to 80 g/l. Therefore it was convenient for us to effectively modulate γ-PGA molecular weight by altering glycerol concentration between 0 to 60 g/l to meet different requirements in different fields.（Fig. 2）Effect of glycerol addition time on γ-PGA productionThe effect of glycerol addition time on γ-PGA production in B. subtilis NX-2 was shown in Table 1. Glycerol showed nearly the same effect on γ-PGA molecular weight as long as it was added before 16 h, and the effect gradually weakened when it was added thereafter. It seemed that the effect of glycerol might be related to the process of γ-PGA biosynthesis. On the other hand, since glycerol with high concentration would bring inhibition to cell growth (Fig. 2), it was suggested glycerol could be added in medium around 16 h, which would lessen the initial inhibition on cell growth.（Table 1）Utilization of glycerolWhen 20 and 80 g/l glycerol was added in medium, respectively, no glycerol was consumed by B. subtilis NX-2 during the whole fermentation process (data not shown). While in B. licheniformis ATCC 9945a, glycerol was utilized from the very beginning, and a total of 30 to 40 g/l glycerol had been consumed until the end of fermentation when 80 g/l glycerol was added in medium (Birrer et al. 1994; Cromwick et al. 1996). The difference of glycerol consumption between the two strains might be due to the differences of species and medium composition.In fact, it has been reported that glycerol added in medium could also decrease molecular weight of some other biopolymers, for example, poly(hydroxyalkanoate) and ε-poly-L-lysine. And the mechanism was that the esterification of glycerol and theses biopolymers occurred, which led to the inhibition of monomers incorporation into the carboxyl terminus (Ashby et al. 2005; Nishikawa and Ogawa 2006). As no glycerol was consumed by B. subtilis NX-2, glycerol would not be covalently bonded to γ-PGA. Then glycerol might have another particular effect mechanism in γ-PGA production in this strain.4. DiscussionGlycerol could decrease the molecular weight of γ-PGA in B. subtilis NX-2, and then decreased the broth viscosity, enhanced the uptake of substrates, which was beneficial for cell growth and γ-PGA production in this strain. This was the first time to discover such contribution of glycerol on γ-PGAproduction by Bacillus sp.. In addition, it was expected that glycerol would modulate γ-PGA molecular weight more effectively through further investigation for the mechanism features, which would not only deepen the knowledge of γ-PGA biosynthesis process, but also establish a general foundation for regulation of microbial γ-PGA molecular weight.ReferencesAshby RD, Solaiman DKY, Foglia TA (2005) Synthesis of short-/medium-chain-length poly(hydroxyalkanoate) blends by mixed culture fermentation of glycerol. Biomacromolecules 6:2106-2112Birrer GA, Cromwick A, Gross RA (1994) γ-Poly(glutamic acid) formation by Bacillus licheniformis 9945a: physiological and biochemical studies. Int J Biol Macromol 16:265–275Cromwick AM, Birrer GA, Gross RA (1996) Effects of pH and aeration on γ-poly(glutamic acid) formation by Bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures. Biotechnol Bioeng 50:222 - 227Cromwick AM, Gross RA (1995) Effects of manganese (II) on Bacillus licheniformis ATCC 9945A physiology and γ-poly(glutamic acid) formation. Int J Biol Macromol 17:259-267Nishikawa M, Ogawa K (2006) Inhibition of epsilon-poly-L-lysine biosynthesis in Streptomycetaceae Bacteria by short-chain polyols. Appl Environ Microb 72:2306-2312Richard A, Margaritis A (2003) Rheology, oxygen transfer and molecular weight characteristics of poly(glutamic acid) fermentation by Bacillus subtilis. Biotech Bioeng 82:299–305Shih IL, Van YT (2001) The production of poly-(γ-glutamic acid) from microorganisms and its various applications. Bioresource Technol 79:207-225Xu H, Jiang M, Li H, Lu D, Ouyang P (2005) Efficient production of poly(γ-glutamic acid) by newly isolated Bacillus subtilis NX-2. Process Biochem 40:519-523Wu Q, Xu H, Xu L, Ouyang P (2006) Biosynthesis of poly(g-glutamic acid) in Bacillus subtilis NX-2: Regulation of stereochemical composition of poly(g-glutamic acid). Process Biochem 41:1650–1655Table 1 Effect of glycerol (20 g/l) addition time on poly(γ-glutamic acid) (γ-PGA) molecular weight Glycerol addition time (h) γ-PGA yield (g/l) Molecular weight (×106 Da)26.7 + 1.0 2.43 + 0.07+ 1.3 1.86 + 0.060 31.7+ 1.3 1.86 + 0.068 31.6+ 1.2 1.89 + 0.0616 31.2+ 1.2 1.95 + 0.0624 30.2+ 1.2 2.13 + 0.0632 29.1+ 1.2 2.38 + 0.0740 27.8Figure captionsFig. 1 Time profile of poly(γ-glutamic acid) (γ-PGA) fermentation, (A) biomass without glycerol (■), biomass with 20 g/l glycerol (□), yield of γ-PGA without glycerol (●), yield of γ-PGA with 20 g/l glycerol (○); (B) Molecular weight of γ-PGA without glycerol (■), molecular weight of γ-PGA with 20 g/l glycerol (●); (C) Broth viscosity without glycerol (■), broth viscosity with 20 g/l glycerol (●); (D) Residual glucose without glycerol (■), residual glucose with 20 g/l glycerol (□), residual glutamate without glycerol (●), residual glutamate with 20 g/l glycerol(○), both the initial concentrations of glucose and glutamate were 40 g/l.Fig. 2 Effect of glycerol concentration on poly(γ-glutamic acid) (γ-PGA) fermentation, Biomass (□), yield of γγwere incubated for 48h.C DB A。

感受态大肠杆菌的制备(DH5a)

制备感受态大肠杆菌（DH5α）
一．原理和用途
1.利用CaCl2对大肠杆菌细胞膜的作用，使细菌产生短暂的可摄取外源DNA的过程
2.用于质粒DNA或连接产物转化大肠杆菌，构建重组克隆
二．材料
1.高压灭菌：50ml离心管，枪头等
2.试剂：0.1M CaCl2，无菌甘油
三．
《精编分子生物学》，科学出版社，第三版
一步法（TSS）制备感受态大肠杆菌（DH5α）
一. 准备工作
冻存菌株，LB液体培养基，Transform Storage Solution（TSS）
消毒：三角瓶（50ml、500ml），50ml一次性离心管（预冷），1.5ml EP管（预冷）
低温离心机，超低温冰箱，冰盒，冰水浴，移液器（1000μl,200μl）,枪头
二. 操作步骤
1.活化菌株：－80℃取出保存菌株（如DH5α、BL21、BG5183等），37℃摇菌过夜。

或：－80℃取出保存菌株，（可选：EP管摇菌）涂板，37℃培养过夜，复壮菌株，然后再挑菌并活化菌株。

2.三角瓶（500ml）中加入100ml LB，加1-2ml 活化好的菌液，37℃摇置约3h，使菌生长
至对数生长中期，OD值至0.3-0.4(不超过0.6)（菌液成半透明状）。

3.冰水浴30min，分装至50ml离心管，4℃，3000rpm（1000g），10min。

4.弃尽上清，沉淀用约10倍体积2×TSS重悬菌体，100-200μl分装至预冷的EP管中，
－80℃保存。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。

取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。

谷氨酸发酵工艺流程1

-----WORD格式--可编辑--专业资料-----目录一、谷氨酸简介 (2)二、谷氨酸发酵的工艺流程 (3)2.1谷氨酸生产菌种 (4)2.2生产原料 (4)2.3培养基制备 (4)2.3.1碳源 (4)2.3.2氮源 (5)2.3.3生物素 (5)2.4培养基 (5)2.5菌种的保藏 (6)2.6灭菌的方法 (8)2.7菌种如何选育 (8)2.8种子的扩大培养 (8)2.9谷氨酸的发酵 (8)3.0谷氨酸的分离 (9)三、谷氨酸发酵的工艺控制 (9)3.1环境控制 (9)3.1.1pH (9)3.1.2温度 (9)3.1.3通风量 (9)3.1.4泡沫 (9)3.1.5染菌的防治和染菌后的处理方法 (9)3.2.细胞膜渗透性控制 (10)3.3提取工艺的进展 (10)3.4鉴别 (12)3.5发酵终点的判断 (12)四、小结 (12)五、参考文献 (12)谷氨酸发酵工艺秦岭内蒙古工业大学化工学院 08级生物工程2班摘要：众所周知，日常所用调味料味精就是L一谷氨酸单钠盐(monosodiuo gluamate，MsG)。

自1909年日本发明并工业化生产味情以来，几经变迁，已发展成为以谷氨酸发酵为主体的世界性氨基酸发酵工业。

1956年从日本开始，以后先后由面二筋豆粕和废糖蜜浓缩物水解的方向，转向以糖质为原料的细菌发酵法。

生产味精谷氨酸之类氨基酸的发酵，区别于传统的酿酒和抗菌素发游，是一种改变微生物代谢的代谢控制发酵。

本文则就谷氨酸发酵生产过程、谷氨酸发酵机制和研究动向等方面，说明谷氨酸发酵的发展。

[1]关键词：谷氨酸；发酵；工艺；研究；发展一、谷氨酸简介谷氨酸一种酸性氨基酸，分子内含两个羧基，化学名称为α-氨基戊二酸。

为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。

大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。

分子式C5H9NO4、分子量147.13076。

谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。

谷氨酸_色氨酸_丝氨酸发酵进展_刘贤雪

我国氨基酸生产最早在 1922 年用酸法水解面筋生产谷氨酸钠即味精，1965 年发酵法生产味精的成功，带动了其它氨基酸的研究开发。
自从氨基酸法生产谷氨酸成功以后，世界各国纷纷开展氨基酸发酵的研究与生产，产量增长很快。但除谷氨酸、赖氨酸和蛋氨酸外，其它品种产量均不大。目前世界各大氨基酸生产国的厂商积极发展氨基酸的新技术，国内外氨基酸产业的发展促使生产技术和手段方面的突飞猛进外，氨基酸深层次加工及新产品开发是今后发展方向。本文综述了发酵生产谷氨酸、色氨酸、丝氨酸的最新研究进展，以期对其工业化生产有指导意义。
4 丝氨酸发酵进展
L-丝氨酸属非必需氨基酸，但其作为一种生化试剂，在食品、饲料、医药、农业以及化妆品工业中广泛应用。 L-丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，参与许多生物物质(如甘氨酸、蛋氨酸、嘌吟等)的合成，代谢运转速度极快。因此，与其它类氨基酸相比，L- 丝氨酸的直接发酵法生产十分困难。 L-丝氨酸发酵法生产的研究报告主要集中于利用添加前体物发酵生产 L-丝氨酸，甘油酸盐 (或酯)、甘油酸三甲内盐、甘氨酸被研究认为是合成 L-丝氨酸最有前景的前体物[19]。
—38—
7．33kg ／ m3，生物素 1．783mg ／ m3，温度 33．7℃，初始 pH7．74，发酵时间 58．4h)，谷氨酸最大产率为 37．1kg ／ m3。 2．3．发酵生产谷氨酸的代谢途径最新研究
上述各种努力都是为了提高谷氨酸产率，但根本的措施是搞清细菌的代谢途径。因此，已有人将研究重点放在了代谢途径工程。 S．Takac[11]等人在前人工作的基础上尝试了谷氨酸生产最优化的代谢流分布研究。据称，基于化学计量的流率平衡模型已经引起了极大兴趣，但由于文献中关于大肠杆菌生成氨基酸的代谢系统信息较多，这种模型主要用于 E．coli．。 S．Takac 等人提出了一个详细的谷氨酸生产菌生物反应网络。并把它用于分析最优化生产谷氨酸的细胞内流率分布。流率分布分析揭示了要增加谷氨酸产率需要通过基因工程技术以及发酵条件来调节的 B．flavum 细胞内的代谢反应。理论上，通过磷酸戊糖支路，乙醛酸支路的中间物以及 A-酮戊二酸的分布对谷氨酸的生产是至关重要的。为了增加谷氨酸产率，有关 α-酮戊二酸、丙酮酸和谷氨酸的生物反应都应进行调控。研究还显示，为了生成谷氨酸，TCA 循环不需进行完全，倒是乙醛酸支路相当活跃。这好像和传统的观点不一致。分析还显示，谷氨酸优先利用谷氨酸脱氢酶由 α-KG 生产，但到发酵后期，由于反应液中 NH3 浓度的下降，谷氨酸开始利用谷氨酸合成酶由谷氨酰胺合成。文中也谈到了溶氧的问题，此问题他们尚在研究之中。

发酵工程应用实例谷氨酸发酵

氨酸脱氢酶的最适温度在32-36℃。
（2） pH值
1） pH值对谷氨酸产生菌生长的影响 2） pH值对谷氨酸积累的影响
发酵液的pH影响微生物的生长和代谢途径。 • 发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；如果pH偏高，则菌
体生长缓慢，发酵时间拉长。在发酵前期将pH值控制在7.5~8.0左右较为合适。 • 而在发酵中、后期将pH值控制在7.0~7.6左右对提高谷氨酸产量有利。
2.形态上共同特点（芽孢杆菌除外）:
（1）革兰氏阳性（2）菌体为球形、短杆至棒状（3）不形成芽孢（4）没有鞭毛，不能运动（5）都是生物素缺陷型（6）都是需氧型微生物
二、谷氨酸合成途径
1.谷氨酸合成的方式
（1）氨基转移作用 -酮戊二酸 + 氨基酸
谷氨酸 + -酮酸
（2）还原氨基化作用 -酮戊二酸 + NH4+ + NADPH2
其他
⑤添加青霉素
• 机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.
• 控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.
（三）发酵条件的控制
（1）发酵温度
• 谷氨酸发酵前期(0~12h):30-32℃。 • 对数生长期:菌体浓度迅速增大（12h），糖耗快，维持温度30-32℃ • 在发酵中、后期:是谷氨酸大量积累的阶段，而催化谷氨酸合成的谷
• 这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。
3. 谷氨酸发酵
当菌体生长基本停滞就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α－酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段，为了提供谷氨酸合成所必需的氨及维持谷氨酸合成最适的pH7.2～ 7.4，必须及时流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需加大通气量，并将发酵温度提高到谷氨酸合成最适的温度34～37℃。

感受态细胞制备的几种方法

感受态细胞制备的⼏种⽅法⼤肠杆菌感受态细胞的⼏种制备⽅法关于感受态细胞(Competent cells)常态的细胞不能摄⼊外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进⼊⼤肠杆菌必须⾸先制备感受态的⼤肠杆菌细胞。

受体细胞经过⼀些特殊⽅法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发⽣变化，成为能容许多有外源DNA的载体分⼦通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化，是将异源DNA分⼦引⼊⼀细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的⼀种⼿段，是基因⼯程等研究领域的基本实验技术。

进⼊细胞的DNA分⼦通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所⽤的受体细胞⼀般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有⼀个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转⼊可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各⾃都没有酶活性，但它们可以融为⼀体形成具有酶活性的蛋⽩质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产⽣的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作⽤于⽣⾊底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)⽽产⽣蓝⾊的菌落，所以利⽤这个特点，在载体的该基因编码序列之间⼈⼯放⼊⼀个多克隆位点，当插⼊⼀个外源DNA⽚段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作⽤，就不能产⽣具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为⽩⾊，⽽没有重组质粒的菌落为蓝⾊。

⼤肠杆菌感受态细胞的⼏种制备⽅法⽅法⼀：细菌转化的⽅法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本⽅法是⽤冰预冷的CaCl2或多种2价阳离⼦等处理细菌，使之进⼊感受态得以转化。

农杆菌感受态制备

版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

4℃5000rpm 离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl （7.0）0.01 DTT）替代。

版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。

大肠杆菌感受态的制备

大肠杆菌感受态的制备原理: 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。

转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。

材料：Top10、pcDNA3.0, TB buffer（现用现配）、超纯水、碎冰。

LB液体培养基200 ml（不含AMP）、LB固体培养基（含AMP）、LB固体培养基（不含AMP）10ml圆底离心管（玻璃或塑料）、100ml锥形瓶、2.0 ml离心管、各型号枪头, 刻度移液管均需灭菌处理甘油：100ml (高压灭菌)氨苄（母液100mg/ml，终浓度为100ug/ml）： 1ml母液需氨苄100mg 过滤除菌。

仪器：滤器、0.22um微孔滤膜、刻度吸量管、恒温摇床、恒温培养箱, 分光光度计、比色杯、低温离心机、制冰机、超净工作台, 移液器。

步骤：1）从冻存的E.coli .Top 10, 划线接种至LB固体培养基（不含AMP）. 37℃培养O/N, 16h左右。

2) 从新活化的E.coli .Top 10菌平板上挑取一单菌落，接种与2ml LB液体培养基（10ml圆底离心管）中，37℃振荡培养O/N, 16h左右。

备注: E.coli . Top 10, 20%无菌甘油, －70℃保存。

3)将该菌悬液以(400UL)1:100～1:50转接于20 ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液明显混浊后，2.5~3小时后测一次OD(600nm)，至OD600nm≤0.6时停止培养.摇菌期间, 配TB buffer，开制冰机。

TB buffer置于冰上预冷(20~30分钟). 低温离心机预冷(20~30分钟)以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4）细菌置于冰上,10min。

5）取12管, 1.5 ml细菌培养液3000 g 4℃离心5min,弃上清。

6) 每管加200 ul 预冷的LB，轻轻混匀, 均成2管, 置冰上20~30分钟，3000 g 4℃离心5min,弃上清。

甘油制备感受态原理

甘油制备感受态原理
甘油制备感受态原理是通过甘油乙烯酯化反应，将乙二醇和甘油
在硫酸催化下进行酯化反应。

首先，将乙二醇和甘油按一定比例混合，然后将硫酸加入反应体系中作为催化剂，加热反应混合物至一定温度，使得反应开始进行。

在反应过程中，硫酸起到了催化作用，能够加速
酯化反应的进行。

随着反应的进行，产生的水分可以通过水分分离装
置进行分离，保证反应持续进行。

当反应达到一定程度时，停止加热
并进行冷却，将反应产物进行电析，得到甘油。

该原理主要适用于化
工行业生产甘油等有机物质，具有较高的工业应用价值。

实验四细菌感受态的制备

实验四细菌感受态的制备（4学时）实验目的学习感受态细胞的制备过程实验原理对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

109～1010转化子/μg DNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。

106～107转化子/μg DNA。

实验材料和试剂（一）实验材料大肠杆菌DH-5a质粒pUC118（ampicillin，AmpR）（二）培养基和试剂1. LB液体培养基(%)胰蛋白胨（Tryptone）0.5酵母浸出粉（Yeast extract） 1.0NaCl 0.5pH 7.2～7.4（用2mol/L NaOH调节）（分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。

3ml/试管，每组2管。

0.07Mpa高压灭菌30分钟）。

2. LB固体培养基LB液体培养基加入1.6%的琼脂粉即可。

（分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。

0.07Mpa高压灭菌30分钟）。

3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin,，Amp），配制成100mg/ml备用。

4. 0.1mol/L CaCl2溶液(配制方法：称取1.1克无水CaCl2，溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，装于250ml三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4℃保存。

）（三）器材接种针10ml移液管50ml塑料离心管5ml移液管90mm培养皿1ml移液管1.5ml Eppendorf管200ml吸头三角爬15×150试管冰块试管铝帽牛皮纸纱布盖线绳硫酸纸（四）仪器净化工作台摇床机恒温水浴锅离心机CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1. 前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

TSS方法制备感受态细胞

TSS方法（又称一步法）制备感受态细菌傻瓜程序一、准备工作1、配置1M 氯化镁或硫酸镁氯化镁（一般含6个水分子）或硫酸镁（二者效果一样）母液，不用灭菌，用时根据需2、配制1×TSS溶液（20ml）tryptone(1%) 0.2gYeast extract(0.5%) 0.1gNaCl(1%) 0.2gPEG(MW= 3350-8000) (10%) 2gDMSO（5%）1mlMgCl2(20-50mM) 1M MgCl2 400ul-1ml，或0.081~0.203 g六水氯化镁加14ml水（最好是超纯水）溶于三角瓶或烧杯中，搅拌使溶解，用量筒定容至20ml，用稀盐酸或氢氧化钠调ph至6.5(6.4-6.8均可)，过滤除菌（0.22或0.45um滤膜），4℃保存备用（可保存6月左右）。

注：如配制2×TSS溶液，试剂加倍即可，其它操作不变。

3、准备器具注射器，过滤器及滤膜——自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，保证器具不含干扰物质，然后装至一干净烧杯（去离子水冲洗过）中高温高压灭菌，注射器可不灭试剂瓶，1个，自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，灭菌，用于过滤除菌时接收过滤液50ml管子（管底注意圆或尖，4℃离心时与配备的冷冻离心机转头相配）2个（可多准备几个），自来水洗净，去离子水冲洗数次，用超纯水涮洗一次，然后装2/3管超纯水高温高压灭菌，用时把水倒掉1.5ml离心管（新开包装的，保证干净），200个（用来分装感受态），用干净的铝盒装好，铝盒外用报纸包住，橡皮条扎紧，灭菌，用前20小时整个置于-20℃冰箱预冷。

镊子1个，灭菌干净，锡箔纸包好灭菌，用来夹取1.5ml离心管。

液氮或预冷到-70℃的工业酒精（提前20h用500ml玻璃瓶装好置于-70℃冰箱中预冷），用于后面速冻分装好的感受态细胞不含抗生素的平板数个，含抗生素的平板数个250ml三角瓶（棉塞或锡箔纸封住）3-4个，全部自来水洗净，去离子水冲洗数次，一个装10-30mlLB，另一个装50ml，灭菌，用来培养细菌灭菌一次性吸头，全部新鲜灭菌，且用前未开过吸头盒盖4℃离心机（最好能装50ml离心管），超净工作台，酒精灯等二、制作感受态1、划线平板取-20℃或-70℃保存甘油菌划线于无抗生素平板，不要用4℃或常温保存菌，过夜培养（12-18h）2、扩大培养和培养指数初期细胞挑单菌落至10-30 m lLB（三角瓶或50ml管）中过夜培养（12-16h）。

农杆菌感受态制备

版本一?1.1农杆菌感受态细胞的制备?℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

?℃振荡培养12-16 hr。

?℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

??℃5000rpm离心5min，去上清。

??℃。

?1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105?取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。

版本二?普通农杆菌感受态制备与转化：?1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

?2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

?3. 5k rpm离心5分钟。

?4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

?5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

?如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。

?6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。

?7. 液氮中冷冻1分钟。

?8. 37℃水浴溶化细胞。

?9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。

?10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。

?11. 涂板，28℃培养2-3天。

?版本三农杆菌感受态细胞的制备1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基(含50mg/L STR)中，28℃、200r/mim培养过夜。

2.取2ml培养物于LB液体培养基(含50mg/L STR) 中继续培养，直至OD800 为0.5左右。

感受态制做方法

From 二医神经生物学实验室尹岚2.1 DH5α感受态细菌的制备1）从37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个DH5α单菌落，转到一支含有3mlLB培养基的15ml试管中，于37℃剧烈振荡培养过夜。

2）第二天，取100ul过夜菌加到含有3mlLB培养基的15ml试管中，于37℃剧烈振荡培养3小时，至对数生长期。

3）取2ml对数生长期的细菌加到含有50mlLB的250ml三角烧瓶中，于37℃剧在0.5-0.6之间。

大约需要1.5-2小时。

烈振荡培养，直至OD6004）在无菌条件下将细菌转移到无菌的50ml聚丙烯管中，在冰上放置15min后离心，4℃，3500rpm，10min。

,将细菌团块彻底打散，在冰上5）去上清，加入12.5ml 4℃预冷的100mM MgCl2放置5min后离心，4℃，3500rpm，10min。

,将细菌团块彻底打散，在冰上放6）去上清，加入25ml 4℃预冷的100mM CaCl2置30min后离心，4℃，3500rpm，10min。

/15%甘油，用枪将细菌团块彻底7) 去上清，加入1.25ml 4℃预冷的85mM CaCl2打散, 在冰上放置30min8）分装成100ul一支（EP管），-80℃保存。

（此方法制备的感受态细菌可使每微克超螺旋质粒pUC18产生约5x106-1x107个转化菌落，可以符合常规克隆及质粒扩增的需要）2.2 质粒转化1）取出-80℃保存的感受态细菌，放在冰上，使其融化。

2）加入DNA，用手指轻轻打匀，放置在冰上30min。

（超螺旋质粒<50ng，连接产物<10ul）3）将EP管放置在42℃水浴中，90sec，取出插入冰中，放置1-2min。

4）每管加入900ul LB培养液，37℃温育45分钟，使细菌复苏并表达抗性标记基因。

5）取适量已转化的感受态细菌涂布已加入特定抗生素的LB平板，37℃倒置培养过夜。

（超螺旋质粒取30ul涂布，连接产物取100-200ul涂布）2.3 质粒的制备2.3.1 质粒的少量制备使用Qiagen公司的质粒少量抽提试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit。

甘油法制作谷氨酸棒杆菌感受态

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证

谷氨酸发酵 实验报告(1)

甘油法制作谷氨酸棒杆菌感受态

感受态细胞的制备的实验步骤

甘油对聚谷氨酸合成的贡献

感受态大肠杆菌的制备(DH5a)

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

谷氨酸发酵工艺流程1

谷氨酸_色氨酸_丝氨酸发酵进展_刘贤雪

发酵工程应用实例 谷氨酸发酵

感受态细胞制备的几种方法

农杆菌感受态制备

大肠杆菌感受态的制备

甘油制备感受态原理

实验四 细菌感受态的制备

TSS方法制备感受态细胞

农杆菌感受态制备

感受态制做方法

谷氨酸发酵实验报告(1)

发酵工程应用实例谷氨酸发酵

实验四细菌感受态的制备