谷氨酸棒杆菌发酵成缬氨酸的反应式

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谷氨酸发酵工艺流程1

二、谷氨酸发酵的工艺流程菌种的选育，培养基配制，斜面培养，一级种子培养，二级种子培养，发酵（发酵过程参数控制通风量、pH、温度、泡沫），发酵液分离提取。

2.1谷氨酸生产菌种棒状杆菌属谷氨酸棒状杆菌：生物素缺陷型、温度敏感型；北京棒杆菌、钝齿棒杆菌；短杆菌属：黄色短杆菌、天津短杆菌。

2.2生产原料玉米、小麦、甘薯、大米等。

其中甘薯和淀粉最为常用，大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌α-淀粉酶进行液化，85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h，过滤后可供配置培养基。

甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。

糖蜜原料因含丰富的生物素，不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源。

2.3.培养基制备谷氨酸发酵培养基组成包括碳源、氮源、水、无机盐和生长因子等。

2.3.1碳源目前使用的谷氨酸生产菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、果糖等，有些菌种还能利用醋酸、正烷烃等做碳源。

2.3.2氮源常见无机氮源：尿素，液氨，碳酸氢铵。

常见有机碳源：玉米浆，豆浓，糖蜜。

碳氮比一般控制在100:15—30。

2.3.3生物素含硫水溶性维生素，是B族维生素的一种，又叫做维生素H或辅酶R。

生物素的作用主要影响谷氨酸生产菌细胞膜的通透性，同时也影响菌体的代谢途径。

生物素对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。

2.4培养基保藏斜面培养基：牛肉膏l％，蛋白胨l％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH7.0。

活化斜面培养基：葡萄糖0.1％，牛肉膏l％，蛋白胨l％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH7.0。

一级种子培养基：葡萄糖2.5％，玉米浆3.1％；，尿素0.55％，磷酸氢二钾0．12％，硫酸镁0.06％，pH7.0。

2.4.3.1谷氨酸菌种的分离挑一环生产斜面到装有生理盐水，、小玻璃珠三角瓶中，振荡摇匀，稀释，10。

5～10。

6涂平板_挑选30个单菌落移接到生产斜面上(每个菌落接2支斜面)培养48h_其中30支斜面存入超低温冰箱保存，另外相同顺序编号的30支斜面则进行摇瓶产酸试验。

缬氨酸生产工艺

缬氨酸生产工艺
缬氨酸（Xylose lysine deoxycholate agar，简称XLD）是一种富含氨基酸缬氨酸的培养基，常用于肠道细菌的分离和鉴定。

下面将介绍缬氨酸的生产工艺。

缬氨酸的生产工艺主要分为以下几个步骤：
1. 原料准备：选择优质的缬氨酸发酵菌株，如大肠杆菌等。

购买缬氨酸发酵培养基，如缬氨酸粉末。

将培养基按照要求加入适量的水，并加热至沸腾搅拌溶解使其均匀。

2. 接种培养基：将培养基倒入消毒的发酵罐中，接种适量的缬氨酸发酵菌株。

并将发酵罐放入恒温恒湿的培养箱中，提供适量的氧气和营养物质。

3. 发酵培养：调节培养基的温度、pH值和搅拌速度等条件，使其适合于缬氨酸发酵菌株的生长和代谢。

同时定期采样检测培养液中的缬氨酸浓度以及细菌的生长情况。

4. 分离和提取：当发酵液中的缬氨酸达到一定浓度时，停止发酵过程。

使用离心机将发酵液离心分离得到细胞渣和发酵液。

5. 精制和纯化：将细胞渣用适量的溶剂进行提取，使得缬氨酸与其他有机物分离。

然后利用蒸馏、结晶、过滤等方法对提取液进行精制和纯化，得到纯度较高的缬氨酸产品。

6. 干燥和包装：将纯化的缬氨酸产品进行干燥处理，除去其中
的水分。

然后按照客户要求进行包装，一般采用密封的塑料袋或瓶子进行包装。

通过以上几个步骤，就可以得到纯度较高的缬氨酸产品。

在整个生产过程中需要注意卫生和生产环境的控制，以确保产品的质量和安全。

缬氨酸作为一种重要的氨基酸，在生物医药、食品等领域具有广泛的应用前景。

因此，缬氨酸的生产工艺也需要不断优化和改进，以提高产量和质量，满足市场需求。

谷氨酸发酵实验报告(1)

兰州大学生命科学学院发酵工程实验谷氨酸发酵实验摘要：谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，为发酵实验准备菌种。

还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，所以在发酵过程中，要求每两个小时测定一次还原糖的含量，并据此作出发酵的糖耗曲线。

关键字：种子的制备、发酵罐、谷氨酸棒杆菌、PH的调节引言：了解发酵工业菌种制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。

了解发酵罐罐体构造和管道系统，掌握对发酵罐及其管道系统的灭菌方法。

了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程。

还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，在发酵后期当还原糖降至1％以下时，表明谷氨酸发酵已经完成。

所以在发酵过程中，要定时测定还原糖的含量，要求每两个小时测定一次，并据此作出发酵的糖耗曲线。

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

学习使用茚三酮比色法检测发酵液中谷氨酸浓度的方法。

谷氨酸棒杆菌通常在0-12小时为生长期，12小时后为产酸期，所以应该从12小时以后开始检测谷氨酸的含量，每两个小时取一次样。

原理:谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，得到大量健壮的种子。

谷氨酸棒杆菌生长速度较快，接种量一般在1-2%。

谷氨酸发酵是有氧发酵，发酵罐由蒸汽管道、空气管道、加料出料管道等组成，在实验之前必须先对发酵罐进行空消。

谷氨酸产生菌是代谢异常化的菌种，对环境因素的变化很敏感，在适宜的培养条件下，谷氨酸产生菌能够将50％以上的糖转化成谷氨酸，而只有极少量的副产物。

如果培养条件不适宜，则几乎不产生谷氨酸，仅得到大量的菌体或者由发酵产生的乳酸、琥珀酸、а－酮戊二酸、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺等产物。

生产上的中间分析只测定一些主要数据，只能显示微生物代谢的一般概况而不能反映细微的生化变化。

因此，进一步完善生化分析项目，从生化角度对发酵进行控制，从而确定最适宜的工艺条件是提高发酵水平的重要课题之一。

氨基酸类饲料添加剂-L-缬氨酸

变株以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累Ｌ一缬氨酸的目的。目前，Ｌ缬氨酸产生菌种大多由谷氨酸产生菌黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、酸发酵短杆菌诱变选育乳
一
而来。
【制
法】产Ｌ一缬氨酸的方法一般有三生
长，家医药局统计２１国００年缬氨酸需求量在
缬氨酸作为蛋白质的组成成分在自然界中广
泛分布，奶、牛肉类、物、谷蘑菇、豆和花生中含大
量丰富，是游离状态的Ｌ一氨酸在自然界中但缬
并不多见。限于价格问题，主要应用于医药方面，以配制复合氨基酸输液，用它在肝昏迷、性慢肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，天性代谢缺陷先的膳食治疗，血症及术后糖尿病患者的治疗，败
１ｇＬ目前国外对发酵生产缬氨酸的研究集中ｌ／。于分子机理和代谢调控方面。国内则侧重摸索了核酸碱基、生素、维氨基酸等生长因子及常规发酵原料对缬氨酸累积的
影响。但是从工业生产角度出发，图以廉价原试
【工艺流程】缬氨酸发酵法工业生产的Ｌ一
工艺流程如下：
葡萄糖
种：提取法、化学合成法和发酵法，是目前在工但业上实施的只有发酵法。Ｉ．提取法提取法即从蛋白质水解液中提取Ｌ一缬氨
磷烯‘ 酮酸醇酸式丙

代谢工程

代谢工程之利用谷氨酸棒状杆菌来生产L-精氨酸精氨酸是一种为不同工业和医疗产品所应用的重要的氨基酸。

这里我们报道了代谢工程中利用谷氨酸棒状杆菌来生产精氨酸的改进方法。

首先进行的是随机诱变，来增加谷氨酸棒状杆菌对精氨酸类似物的耐受性。

接下来进行是系统性的代谢工程来进一步对菌株进行改良。

涉及精氨酸操纵子调控阻遏物的去除，NADPH水平的最优化，破坏L-谷氨酸的生成来增加精氨酸的前体物质还有限制精氨酸合成反应的通量优化。

最终菌株的流加培养发酵在5L和大规模1500L的生物反应器中进行，分别允许生产92.5g/L和81.2g/L的精氨酸，产量为每g 碳源（葡萄糖加蔗糖）可分别产出0.40g和0.35g精氨酸。

这里描述的系统代谢工程结构对于构建棒状杆菌菌株来进行精氨酸及相关产品的工业生产是有用的。

L-精氨酸是一种工业中重要的半必需氨基酸，它在食品和补加健康食品、制药以及化妆品中有很多应用。

与其他的氨基酸和有价值的化学物质相比，利用谷氨酸棒状杆菌作为精氨酸生产工程菌有很大优势，因为它带有强烈的面向L-谷氨酸形成的通量。

跟大肠杆菌相比，谷氨酸棒状杆菌不含有argA和argE基因，但取而代之，它含有可以编码乙酰转移酶的argJ基因，可以催化两种不同的精氨酸生物合成途径的生化反应。

重要的是，谷氨酸棒状杆菌缺乏精氨酸降解酶以及在大肠杆菌中发现的精氨酸脱氨酶，因此，细胞内生产的精氨酸不能被积极地降解。

可被谷氨酸棒状杆菌利用的碳源范围也相对广阔，包括己糖和戊糖两种。

对于精氨酸的过度生产来说，调节子对精氨酸生物合成操纵子的抑制以及精氨酸对乙酰谷氨酸激酶的反馈抑制在谷氨酸棒状杆菌中被显著地移除了。

在这次研究中，我们针对谷氨酸棒状杆菌ATCC 21831菌株进行代谢工程研究，最初经过随机诱变来增强精氨酸的产量。

逐步地合理地代谢工程建立在针对通过菌株工程步骤实现的精氨酸产量逐步增加的代谢结果的分析的基础上。

由本次研究建立的最终菌株的流加培养获得了有效的精氨酸产量，使用5L和大规模1500L生物反应器使浓度分别达到92.5和81.2g/L。

谷氨酸棒杆菌发酵工艺控制

种子培养基：每升含葡萄糖60g，KH2PO4 2.5g , MgSO4.7H2O 0.5g (NH4)2SO4 5g ,玉米浆30g ,pH 7.2 115℃ 20min发酵培养基：每升含葡萄糖70g，KH2PO4 2.5g, K2HPO4 2.5g, MgSO4.7H2O 0.5g, (NH4)2SO4 25g ,玉米浆45g ,pH7.0 （四）罐上的工艺控制1）预热：打开夹套蒸汽进汽阀，微开排污阀，将罐温加热至100℃2）灭菌：关闭夹套蒸汽进汽阀，开启蒸汽进罐阀，使罐温升至121℃；打开空气管路蒸汽阀门对空气过滤器进行灭菌；调整蒸汽进罐阀、排气阀的开度使罐压保持在0.12MPa左右（如此时温度与121℃相差较大，则可用121℃重新标定罐内温度）；保持30min；关闭所有蒸汽阀门，让罐压下降至0.01MPa，打开空气进气阀，引无菌空气保压（0.03~0.05MPa），确保罐压小于过滤器空气压。

3）发酵准备阶段：开启冷却模式，开启进水阀，快速降温至28℃；退出冷却模式，开启发酵模式，保温运作；开启搅拌器（100rpm），如果排气阀没有过度的逃液，则可加大搅拌速率，或加大空气进气量。

4）发酵：采用火焰法接种，调节排气阀、进气阀开度，还有搅拌器速率，在不过分逃液的前提下，保持较高的DO值；发酵过程中微开取样管路（蒸汽进罐阀紧闭）保持较小的蒸汽排出（时刻保持取样管路无菌）。

5）取样：关闭蒸汽排出阀，关闭蒸汽进汽阀，开启蒸汽排出阀，开启蒸汽进罐阀，并调节该两阀门的开度使发酵液以适宜的流量流出，用三角瓶接约20mL；关闭蒸汽进罐阀门，开启蒸汽进汽阀。

6）放罐：关闭空气进气管路，开启夹套加热管路，关闭冷凝水管路，关闭蒸汽排出阀，引蒸汽进罐，待罐温升至100℃后，计时3min；关闭蒸汽进罐阀，关闭蒸汽进汽阀；开启空气进气管路，开启蒸汽进罐阀，利用压强将液体放出；放完后，关闭空气进气管路；通自来水按以上步骤洗罐3次；通入自来水，待下次发酵开始。

发酵工程应用实例谷氨酸发酵

氨酸脱氢酶的最适温度在32-36℃。
（2） pH值
1） pH值对谷氨酸产生菌生长的影响 2） pH值对谷氨酸积累的影响
发酵液的pH影响微生物的生长和代谢途径。 • 发酵前期如果pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌而不产酸；如果pH偏高，则菌
体生长缓慢，发酵时间拉长。在发酵前期将pH值控制在7.5~8.0左右较为合适。 • 而在发酵中、后期将pH值控制在7.0~7.6左右对提高谷氨酸产量有利。
2.形态上共同特点（芽孢杆菌除外）:
（1）革兰氏阳性（2）菌体为球形、短杆至棒状（3）不形成芽孢（4）没有鞭毛，不能运动（5）都是生物素缺陷型（6）都是需氧型微生物
二、谷氨酸合成途径
1.谷氨酸合成的方式
（1）氨基转移作用 -酮戊二酸 + 氨基酸
谷氨酸 + -酮酸
（2）还原氨基化作用 -酮戊二酸 + NH4+ + NADPH2
其他
⑤添加青霉素
• 机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作用下受损,向外泄露谷氨酸.
• 控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换.
（三）发酵条件的控制
（1）发酵温度
• 谷氨酸发酵前期(0~12h):30-32℃。 • 对数生长期:菌体浓度迅速增大（12h），糖耗快，维持温度30-32℃ • 在发酵中、后期:是谷氨酸大量积累的阶段，而催化谷氨酸合成的谷
• 这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。
3. 谷氨酸发酵
当菌体生长基本停滞就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α－酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段，为了提供谷氨酸合成所必需的氨及维持谷氨酸合成最适的pH7.2～ 7.4，必须及时流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需加大通气量，并将发酵温度提高到谷氨酸合成最适的温度34～37℃。

谷氨酸棒杆菌氨基酸

谷氨酸棒杆菌氨基酸
谷氨酸棒杆菌（Lactobacillus glutamicus）是一种革兰氏阳性杆菌，属于乳酸菌。

它是一种产生谷氨酸的细菌，在食品发酵和生物技术中具有重要作用。

谷氨酸（Glutamic acid）是一种氨基酸，属于非必需氨基酸，也是人体蛋白质的组成部分之一。

谷氨酸在机体内起到多种重要角色，包括神经递质和代谢的参与等。

在食品发酵过程中，谷氨酸棒杆菌可以利用一些碳源和氮源，通过发酵作用合成谷氨酸。

这种发酵一般是利用谷氨酸棒杆菌对谷氨酸的高产能力。

谷氨酸在食品工业中常被用作增香剂和调味剂，添加到食品中可以增加食品的鲜味和美味。

另外，氨基酸（Amino acids）是构成蛋白质的组成单元。

人体需要通过食物摄取氨基酸来满足生理需求。

谷氨酸是人体内重要的氨基酸之一，人体通常可以通过蛋白质的消化和代谢来获取谷氨酸。

此外，人工合成的谷氨酸也作为一种添加剂被广泛应用在食品和医药等领域。

因此，谷氨酸棒杆菌是一种具有重要应用价值的细菌，可以通过其发酵作用产生谷氨酸，而谷氨酸作为一种氨基酸在食品和生物技术中有着广泛的应用。

发酵工程 15-2氨基酸发酵

3、谷氨酸发酵培养基的配制

1）培养基 2）发酵培养基中生物素的控制亚适量。

3）发酵培养基中的氮源
谷氨酸分子中氮含量占9.5%，所以培养基中必须提供相对充足的氮源。谷氨酸产生菌的生长和产物合成时期需维持在pH7.07.2，而且培养基中铵离子浓度又不宜太高，因此，不宜采用硫酸铵、氯化铵等生理酸性铵盐。
2、L-谷氨酸发酵原料的预处理

已知所有谷氨酸产生菌都不能直接利用淀粉或糊精，而只能以葡萄糖等作为碳源。所用的山芋淀粉、玉米淀粉、大米或木薯淀粉都需先进行水解，制成葡萄糖。 1）酸法制水解糖液 2）酶法制水解糖液

3）糖蜜原料：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜中都含有丰富的生物素，不宜直接作为谷氨酸发酵的碳源，发酵前必须进行预处理，去除生物素或将其破坏。
生理活性和化学特性。主要应用领域是食品、饲料、化妆品、医药，也用作化学工业的中间体。据估计全世界每年氨基酸市场为40－50亿美元，其中35%用于食

品、50%用于饲料和15%用于医药和化妆品。
1、食品领域

氨基酸大多无味，但它们是自然芳香的前体谷氨酸钠（味精）是所有氨基酸中最大生产品种，全世界年产量达100万吨（中国大陆约为60万吨）。
法育成的菌株，进行发酵生产（L-羟脯氨酸）。
谷氨酸发酵

1957年日本率先采用微生物发酵法生产谷氨酸，
被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业
进行代谢控制发酵的阶段。目前全国有近50家
工厂生产味精，年产量约为60万吨，居世界首位。
一、菌种

现在经过鉴定和命名的谷氨酸生产菌很多，主
要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。它们有很多相似点：革兰氏阳性；不形成芽孢；没有鞭毛，不能运动；都需要生物素作为生长

谷氨酸系列发酵实验

谷氨酸发酵工程系列实验一、实验目的1、了解发酵工业菌种的制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。

2、了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程操作、3、了解和掌握快速测定还原糖含量的方法。

4、了解和掌握快速测定发酵过程谷氨酸含量的方法5、了解用等电点法从发酵液中回收谷氨酸的方法二、实验原理谷氨酸是由谷氨酸棒杆菌以葡萄糖为原料生产的一种呈味氨基酸，其代谢机理为：葡萄糖先经EMP途径生成丙酮酸，丙酮酸经氧化脱氨基作用生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入三羧酸循环生成α—酮戊二酸，α—酮戊二酸再经氨基化作用生成谷氨酸。

由于谷氨酸棒杆菌为生物素缺陷型突变株，因此在发酵过程中要控制生物素亚适量。

三、实验材料、仪器与试剂1、材料：谷氨酸棒杆菌、发酵培养基、谷氨酸发酵液不同发酵时间所取的样品等。

2、仪器：三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、pH试纸、天平、高压蒸汽灭菌锅、培养箱、显微镜、发酵罐及控制系统、蒸汽发生器、空气压缩机、补料瓶、补料针、硅胶管、滴定管、滴定架、电炉、容量瓶、高速离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液器及枪头、无极调速搅拌机、旋转蒸发器、冰箱等3、试剂：无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母提取液、NaCl、NaOH、HCl、KNO3、去离子水、葡萄糖、尿素、消泡剂、硫酸铜、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氢化钾、盐酸、L-谷氨酸分析纯、茚三酮、丙酮、酒精等。

四、实验步骤1、培养基的制备（1）斜面培养基：葡萄糖0.1%；蛋白胨1%；牛肉膏1%；NaCl0.5%；琼脂2%（pH7.0）（2）一级培养基：蛋白胨1%；酵母浸出粉0.5%；NaCl1%（pH7.2）（3）二级培养基：葡萄糖 2.5%；尿素0.34%；K2HPO4·3H2O0.16%；MgSO4·7H2O；FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各0.0002%（pH7.0）各培养基分装到到三角瓶，用铝箔纸封口，高压灭菌。

谷氨酸发酵工艺流程及谷氨酸的提取操作流程

谷氨酸发酵、提取，精制工艺
（一）发酵及提取工艺流程
菌种（石河子大学菌种）
斜面
摇瓶种发酵罐（SY-3015）发酵液
GQ-75分离机离心（15000rpm ）（去菌体）发酵液
结晶（中和）罐，酸罐，
(离子交换高流分
（二）谷氨酸的等电点-离子交换提取谷氨酸工艺
（三）谷氨酸钠的精制操作
1、中和
工艺条件：湿谷氨酸：水：(固体)纯碱=1：2：（0.3-0.34）
T=60℃，pH=6.4（用试纸测）
注意：60℃下，搅拌下，徐徐加入固体纯碱中和，至pH 6.4 ,搅拌至澄清。

2、谷氨酸钠喷雾干燥
工艺流程：中和完的澄清液，用SY-6000小型喷雾干燥仪干燥并收集；
工艺条件：
进风170℃，出风温度65-75℃，进料量控制40%（即500ml/h），空气流量600l/h （四）谷氨酸产生菌发酵代谢曲线示例。

代谢工程试题答案

1.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。

（1）定义：代谢工程是利用重组DNA技术或其他技术,有目的地改变生物中已有的代谢网络和表达调控网络,以更好地理解细胞的代谢途径,并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程。

（2）研究内容：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；代谢流的定量分析；代谢网络的重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；（3）研究手段:代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。

①基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作：涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。

②分析手段：组学技术(X-omics)：工业微生物基因组测序与功能基因组分析；基于基因芯片的转录组学分析；蛋白质组学技术；基于同位素技术的代谢通量组学。

③检测技术：常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，如物料平衡、同位素标记示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。

2.代谢改造思路和代谢设计原理。

（1）代谢改造思路：代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。

根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。

a改变代谢途径的方法：加速限速反应，增加限速酶的表达量，来提高产物产率。

改变分支代谢途径流向，提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。

b扩展代谢途径的方法：在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。

扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。

c转移或构建新的代谢途径：通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。

谷氨酸

谷氨酸发酵综述谷氨酸（glutamic acid）化学式为C5H9O4N，是一种酸性氨基酸，化学名称为α-氨基戊二酸，是20种常见α-氨基酸之一。

谷氨酸为无色晶体，结晶状态是稳定的，微溶于水但溶于盐酸溶液，密度为1.538（kg/m3），等电点为3.22，谷氨酸有左旋体，右旋体，和外消旋体。

谷氨酸的解离常数：pK’1(COOH)为2.19，pK’2(NH3+)为4.25(γ-COOH),pK’3为9.67（NH3+）。

谷氨酸是非必需氨基酸的一种，大量存在与谷类中，谷氨酸有鲜味，谷氨酸钠是味精的主要成分，用于增加食物的鲜味。

正文：一：谷氨酸发酵在谷氨酸发酵中，改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。

研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。

因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。

生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。

生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。

而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。

因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。

1，谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵，环境条件对谷氨酸发酵具有重要的影响，控制最适宜的环境条件是提高发酵产率的重要条件。

（1）碳源目前使用的谷氨酸生产菌均不能利用淀粉只能利用葡萄糖和果糖等。

在一定的范围内，谷氨酸产量随葡萄糖浓度的增加而增加，但若葡萄糖浓度过高，由于渗透压力大对菌体生长很不利，谷氨酸对糖的转化率降低。

国内谷氨酸发酵糖浓度为125—150g/L，但一般采用流加糖工艺。

（2）氮源常见无机氮源：尿素，液氮，碳酸氢铵。

常见有机氮源：玉米浆，豆浓，糖蜜。

当氮源的浓度过低时回事菌体细胞营养过度贫乏，形成“生理饥饿”，影响菌体繁殖和代谢，导致产酸率低。

随着玉米浆的浓度增高，菌体大量增殖使谷氨酸非积累型细胞增多，同时又因生物素过量是代谢合成磷脂增多，导致细胞膜增厚不利于谷氨酸的分泌造成谷氨酸产量下降。

关于《谷氨酸棒状杆菌发酵》小专题的复习

关于《谷氨酸棒状杆菌发酵》小专题的复习作者：孙香芹来源：《内蒙古教育·理论研究版》2008年第10期“微生物与发酵工程”一章，因生物微观，知识零散而不系统，学生生活中直接感知少等因素，导致学生学习后，出现对知识的理解不全面，知识体系不完整，知识记忆不扎实等现象。

针对这一情况，在按课本顺序复习后，让学生课下通阅这一章的内容，联系与谷氨酸棒状杆菌发酵产生谷氨酸有关的知识，进行整理、归纳；总结出这一专题内容，效果是既强化了学生对知识的理解记忆，又培养了学生学习的总结能力；既利于学生对微生物理论的理解，又便于学生将理论与具体实例相结合；既培养了学生的学习兴趣，又达到了良好的复习应试效果。

现将师生共同从三个不同角度总结的该专题与同行学者共享与切磋。

一、谷氨酸棒状杆菌1.种类：原核生物界，细菌（纲）2.结构：具有原核生物的结构特点（1）细胞壁主要成分是由糖类与蛋白质结合而成的化合物（即肽聚糖），区别于植物细胞、细胞壁的主要成分纤维素和果胶。

（2）细胞质中只有核糖体，质粒（小型环状DNA，有控制性状的基因，基因工程中常被用作运载体）和一些贮藏性颗粒，无其他细胞器。

（3）拟核为大型环状DNA分子折叠缠绕而成，无细胞核核膜和染色体。

3.新陈代谢类型：异养需氧型4.繁殖方式：主要以二分裂方式进行无性繁殖。

5.生长规律：在接种发酵之前，要对谷氨酸棒状杆菌的生长规律进行研究，供选种参考，谷氨酸棒状杆菌的生长曲线如下：在谷氨酸的发酵过程中，可根据需要选用对数期的杆菌做菌种，采用连续培养的方法，即在发酵过程中以一定的速度不断添加新的培养基，同时以同样速度不断发出老的培养基，这样既保证杆菌对营养物质的需求，产生最大量的谷氨酸，同时便于自动化管理，提高了发酵设备的利用率，降低了产品的成本。

6.谷氨酸棒状杆菌代谢的调节谷氨酸棒状杆菌在代谢产生谷氨酸的过程中一直受酶的合成和酶活性调节。

酶的活性调节是微生物一种快速、精细的调节方式，其机理是：当微生物代谢过程中产生某种代谢产物与某种酶结合时，会使酶的结构发生改变导致酶的活性下降，当这种代谢产物与酶脱离时，酶的结构又复原，活性得到恢复。

有机氮源对谷氨酸棒杆菌发酵L-缬氨酸的影响

有机氮源对谷氨酸棒杆菌发酵L-缬氨酸的影响徐庆阳;孙家凯;吴晓娇;王晶;谢希贤;陈宁【摘要】以L-缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌XV0505为供试菌株，研究有机氮源对L-缬氨酸发酵的影响，确定了玉米浆代替豆饼水解液作为有机氮源的发酵工艺，降低了发酵成本；考察不同玉米浆浓度对谷氨酸棒杆菌XV0505发酵生产工一缬氨酸过程中生物量、耗糖速率、L-缬氨酸产量、副产物积累及氨消耗等方面影响，确定了玉米浆的适宜添加浓度；考察了玉米浆与生物素不同配比对L-缬氨酸分批发酵过程的影响，确定了最适生物素添加浓度。

与原工艺相比，新工艺的菌体生物量及产酸提高了13．2％和18．5％。

%The effects of organic nitrogen sources on the fermentation of L-valine were studied with L-valine-pro-ducing strain Corynebacterium glutamicum XV0505. Corn steep liquor was selected as the appropriate nitrogen source instead of soybean hydrolysates to reduce the cost of fermentation. The effects of initial concentration of corn steep liq-uor in fermentation process on biomass, glucose consumption rate, yield of L-valine, accumulation of byproduct and ammonia consumption rate were studied by carrying out fed-batch fermentation. The optimal initial concentration of corn steep liquor was also determined. The effects of the combined agents, biotin and corn steep liquor, on overpro-duction of L-valine were also studied, and the concentration of biotin was optimized. Compared with those of the origi-nal process, the biomass and L-valine production from the improved process were increased by 13.2% and 18.5 % respectively.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2012(038)005【总页数】5页(P12-16)【关键词】有机氮源;L-缬氨酸;玉米浆;生物素【作者】徐庆阳;孙家凯;吴晓娇;王晶;谢希贤;陈宁【作者单位】天津科技大学生物工程学院,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学生物工程学院,工业发酵微生物教育部重点实验室,天津300457【正文语种】中文【中图分类】TS262.5L-缬氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需氨基酸之一，除用于一般营养型素膳外，还大量用于配制治疗型特种氨基酸输液、合成食品抗氧化剂和多肽药物，在医学研究和治疗中的生理学作用日益受到重视[1］。

谷氨酸棒杆菌发酵生产1，5-戊二胺的代谢流分析

谷氨酸棒杆菌发酵生产1，5-戊二胺的代谢流分析黎明;唐奇;李东霞;随树珍;路福平【摘要】为了提高糖类的利用效率，加强糖类代谢向生成尸胺的方向流动，提高尸胺产量，对谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢网络进行分析，找出影响尸胺合成的代谢流量分配规律和关键节点，并通过改变溶氧及添加辅酶 NADPH 对关键节点进行验证．结果表明：6–磷酸葡萄糖和丙酮酸是影响碳源流向尸胺合成的关键节点，增强磷酸戊糖途径(HMP)和三羧酸循环(TCA)可以弱化由6–磷酸葡萄糖生成6–磷酸果糖和由丙酮酸生成乳酸，促进碳源向合成尸胺的方向流动，从而有效地提高尸胺产量(产量增幅为77.8%)．该研究为高产尸胺的谷氨酸棒杆菌工程菌种改造以及发酵控制提供了理论基础．%To improve the yield of cadaverine and the efficiency of carbohydrate utilization,we analysed the metabolic net-workof the fermentation of cadaverine in Corynebacterium glutamicum and found the key nodes which influenced the pro-duction of cadaverine. Key nodes were verified by improving the dissolved oxygen and adding coenzyme NADPH. The re-sults showed that the key nodes are glucose-6-phosphate and pyruvate. By enhancing the HMP pathway and tricarboxylic acid cycle,the processes of changing glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate and pyruvic acid into lactic acid were weakened,resulting in the carbon source fluiding to the synthesis of cadaverine,which could efficiently improve the yield of cadaverine(increased 77.8%). The study provided a theoretical basis for the transformation of high-producing cadaverine Corynebacterium glutamicum and fermentation control.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P9-13)【关键词】代谢途径;尸胺;谷氨酸棒杆菌;NADPH;糖类【作者】黎明;唐奇;李东霞;随树珍;路福平【作者单位】工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457【正文语种】中文【中图分类】Q9351.1 材料1.1.1 供试菌株谷氨酸棒杆菌工程菌株（C. glutamicum）ATCC13032/pXLB（CDV-2）由本实验室构建并保存.1.1.2 培养基种子培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10.发酵培养基（g/L）：葡萄糖50，蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10.1.1.3 试剂与仪器苯甲酰氯，纯度为98%，上海金山亭新化工试剂厂；2，4-二硝基氟苯，分析纯. SBA-40C型生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司；SinChrom ODS-BP型色谱柱，4.6，mm× 200，mm，C18填料.1.2 培养方法在平板上取一环谷氨酸棒杆菌接种到含有5，mL种子培养基中活化，以2%的接种量接入到发酵培养基中.待培养液吸光度为1.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂诱导，到发酵中后期取样，并测量相关代谢指标.1.3 测定方法利用生物传感仪测定样品中葡萄糖与乳酸的浓度.利用高效液相色谱仪测定样品中氨基酸与尸胺的浓度.1.3.1 尸胺的测定取1，mL样品加入5，mL具塞刻度试管中，加入500，µL 2，mol/L NaOH溶液、10，µL苯甲酰氯，37，℃水浴振摇20，min，隔5，min旋涡振荡30，s，加入0.5，g NaCl、1，mL乙醚振荡30，s静置分层.把上层乙醚取至另一离心管中，待乙醚挥发完全，加入500，µL甲醇溶解，过膜后作为HPLC检测用样.柱温：20，℃；流动相：100%乙腈、0.02，mol/L乙酸铵；梯度：0～5，min乙腈体积分数为30%，5～10，min乙腈体积分数为75%，10～15，min乙腈体积分数为30%.1.3.2 氨基酸的测定取2，mL离心管，依次加入300，µL体积分数1%的2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液、300，µL 0.05，mol/L的衍生缓冲液NaHCO3和10，µL待测样品，65，℃水浴1，h后，用0.05，mol/L的定容缓冲液KH2，PO4定容至2，mL，过膜后作为HPLC检测样品.柱温：37，℃；流动相A为体积分数50%乙腈水溶液；流动相B为0.03，mol/L乙酸钠溶液.洗脱梯度见表1.1.4 尸胺代谢网络及平衡模型的建立1.4.1 代谢网络的建立建立代谢网络的原则：（1）代谢流分析是基于拟稳态假设的基础上的，即根据生理生化反应中物质的量的平衡，列出计量方程式，转化为矩阵的形式来计算；（2）据文献［11］所知，谷氨酸棒杆菌中糖类的利用途径包括EMP、TCA和HMP途径；（3）同功酶催化的反应按一个反应计算；（4）反应过程中无分支节点的反应按一步反应计算；（5）由于大量无效循环的存在，菌体中的ATP代谢并不平衡，因此不考虑ATP的总量的平衡；（6）根据谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢途径，表明丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸和乳酸是影响尸胺代谢流分配的主要副产物.基于以上原则，建立的代谢网络如图1所示.图中：Glc为葡萄糖；Glc6P为6-磷酸葡萄糖；PEP为磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr为丙酮酸；Fru6P为6-磷酸果糖；GAP为3-磷酸甘油醛；P3G为3-磷酸甘油酸；AcCoA为乙酰辅酶A；Ribu5P为5-磷酸核酮糖；Xyl5P为5-磷酸木酮糖；Rib5P为5-磷酸核糖；Sed7P为7-磷酸景天庚酮糖；E4P为4-磷酸赤藓糖；OAA为草酰乙酸；α，KG为α-酮戊二酸；LAC为乳酸；Glu为谷氨酸；Ser为丝氨酸；Asp为天冬氨酸；Gly为甘氨酸；Thr为苏氨酸；Lys为赖氨酸；Cadaverine为尸胺.1.4.2 平衡模型的建立根据稳态假设，中间产物的合成速率与它的代谢速率是相等的，根据这个条件，建立平衡方程，结果见表2.将方程化为矩阵形式得出矩阵的秩为17，而一共有24个未知速率，因此，要解出该方程组，需要测定24-17=7个变量才能得出所有未知速率的解.在发酵中期，实验测定了不同溶氧下谷氨酸、葡萄糖、尸胺、甘氨酸、乳酸、丝氨酸、苏氨酸的浓度，数值微分后得出其消耗或生成速率，利用LINGO软件分析得出其余未知速率的值，进而得出代谢通量并进行通量分析，得出代谢节点.2.1 理想状态与实际状态下的代谢流分析代谢网络是一个多酶同步催化的复杂的反应体系，仅改变某一限速反应，对产物合成的影响往往不会很大［12］.因此，对谷氨酸棒杆菌合成尸胺的代谢途径进行代谢流分析，目的在于从宏观上把握影响尸胺合成的主要节点，从而有针对性地改造菌体及对尸胺发酵进行环境扰动.根据上述建立的代谢网络以及代谢方程式，在已知葡萄糖添加量而其他代谢产物未知的情况下，利用LINGO软件可对其进行理想状态代谢流计算，即在确定r1情况下，使r24达到最大时的代谢通量计算.以250，mL三角瓶50，mL装液量的实际状态下，通过对上述7种代谢产物测定，计算出实际代谢通量.计算得出的代谢通量见表3.由表3可推知：r2和r8在理想状态下的代谢通量分别为0和100，而在实际条件下代谢通量分别为71.02和28.98，表明6-磷酸葡萄糖是影响尸胺合成的代谢流分配的关键节点之一；同理，r7和r18在理想状态下的代谢通量分别为130和0，而实际状态下的代谢流分别为0.81和183.00，表明丙酮酸是影响尸胺合成的代谢流分配的又一个关键节点.6-磷酸葡萄糖是由糖酵解途径通向磷酸戊糖途径的首个中间代谢产物，由上述计算结果对比表明：提高磷酸戊糖途径的代谢通量可能是尸胺产量提高的关键所在.而丙酮酸亦是碳架进入TCA循环的首个中间代谢产物，因此，提高TCA循环的代谢通量也可能是尸胺产量提高的关键所在.磷酸戊糖途径的生理意义在于生成磷酸核糖提供核酸合成原料，而核酸为细菌本身的重要组成部分，提高磷酸戊糖途径的通量可以有效增加菌体的合成，生成辅酶NADPH提供代谢反应还原力为许多代谢反应提供前体.谷氨酸棒杆菌属好氧菌，改变溶氧可以改变菌体的合成速率及代谢产物的量与种类，提高溶氧可以有效减少乳酸的产生，增加TCA循环的代谢通量，有效改变菌体代谢网络的代谢流分配.因此，可以通过改变溶氧和加入辅酶NADPH作为扰动因子，对尸胺合成的代谢流分配及其关键节点进行验证.2.2 不同装液量下的代谢流分析摇瓶发酵简洁方便，分析效率高，而且可以通过改变摇瓶的装液量来控制发酵过程中的溶氧，从而进行不同溶氧条件下的代谢流分析.本研究在250，mL三角瓶中，分别以50，mL和25，mL装液量进行发酵实验，测定发酵中后期的葡萄糖、谷氨酸、乳酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、尸胺的消耗或积累速率.用LINGO软件进行分析，计算代谢通量，结果见表4.由表4可知：当装液量由50，mL减少到25，mL时，r7反应的代谢通量提高了81.5%，r18反应的代谢通量减小了2.73%，r24反应的代谢通量提高了12.0%，说明代谢流从合成乳酸向TCA偏移，导致合成尸胺的代谢流增加.由于减少装液量可以适当提高溶氧，说明提高溶氧可以促使糖代谢向合成尸胺的方向流动，减少乳酸的合成.这与提高溶氧可以减少乳酸产生的结果是一致的［13］.代谢流向TCA偏移后，进入TCA循环的碳架相应增高，能够合成尸胺的前体物质增加，进而增加了尸胺的产量.2.3 添加NADPH后的代谢流分析由2.1所知，为了证明提高磷酸戊糖途径的代谢通量是提高尸胺产量的关键所在，在不同装液量的基础之上，添加终浓度为25，µmol/L的NADPH进行摇瓶发酵，测定上述7种物质的代谢速率，并进行代谢流分析，结果见表5.由表5可知：与未加入NADPH相比，加入NADPH后，以50，mL装液量的实验组，r8反应的代谢通量提高了18.8%；而以25，mL装液量的实验组，r8反应的代谢通量仅提高了2.84%.由此表明：在溶氧不足时，添加NADPH可以提高磷酸戊糖途径的代谢通量，从而对提高尸胺产量有很大作用；而溶氧充足时，糖代谢向尸胺合成方向的流动明显增加，添加NADPH对磷酸戊糖途径的影响较小.可见，提高溶氧可以有效增加TCA循环以及HMP循环的代谢通量，提高菌体自身对尸胺合成所需NADPH的供给，明显提高尸胺产量.因此，提高溶氧成为提高尸胺产量的最关键因素.在提高溶氧与加入NADPH两方面的扰动下，尸胺的代谢通量由最初的5.00提高到7.20.而最终尸胺的产量提高了77.8%.通过对谷氨酸棒杆菌发酵生产尸胺的代谢网络进行代谢流分析，得出了影响尸胺产量的关键节点及与之相关的关键代谢途径.分析表明：提高磷酸戊糖途径和适当提高TCA循环途径的代谢通量是提高尸胺产量的重要手段.在发酵中后期，提高溶氧可以提高TCA循环的代谢通量，加入NADPH可以提高磷酸戊糖途径的代谢通量，两者均从整体上改变菌体代谢流分配.后期可利用分子生物学手段改造关键节点，改变菌体的代谢流，提高尸胺的产量.【相关文献】［1］ Kind S，Wittmann C. Bio-based production of the platform chemical 1，5-diaminopentane［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91（5）：1287-1296.［2］ Lewis R A. Lewis' Dictionary of Toxicology［M］. State of Florida：CRC Press，1998：212.［3］ Buschke N，Becker J，Schäfer R，et al. Systems metabolic engineering of xylose-utilizing Corynebacterium glutamicum for production of 1，5-diaminopentane［J］. Biotechnology Journal，2013，8（5）：557-570.［4］ Schneider J，Wendisch V F. biotechnological production of polyamines by bacteria：Recent achievements and future perspectives［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91（1）：17-30.［5］ Kind S，Jeong W K，Schröder H，et al. Identification and elimination of the competing N-acetyldiaminopentane pathway for improved production of diaminopentane by Corynebacterium glutamicum［J］. Applied and EnvironmentalMicrobiology，2010，76（15）：5175-5180.［6］ Kind S，Kreye S，Wittmann C. 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