治疗自身免疫性疾病的新靶标及相关新药研发

ADWX-1与Kv1.3通道作用的分子机制
ADWX-1-Kv1.3复合物结构
ADWX-1突变体计算机丙氨酸 扫描结果和实验结果的比较
ADWX-1与Kv1.3通道作用的分子机制
在ADWX-1和Kv1.3通道的 相互作用中， ADWX-1 中 的Arg23， Phe24 和Lys26 是最重要的功能氨基酸残基。
• 以蝎毒肽为模板进行设计和改造
天然的蝎毒肽包含多种作用于Kv1.3通道的成员，但选择性和特异性普遍不高。
天然蝎毒肽调节剂的筛选
ImKTx88的筛选和序列分析
从海南斑等蝎（Isometrus maculates）毒腺组织 cDNA文库中筛选出钾通道蝎毒肽ImKTx88基因。
多肽ImKTx88的表达纯化和质谱鉴定
ADWX-1 mutant Wild type R11A R23A F24A K26A T28A N29A H33A T35A IC50 (pM) n IC50(mut)/ IC50(wt) 1.0 177.9 3885.8 2123.4 511.8 30.8 240.4 40.8 14.8 1.89±0.53 336.3±49.1 7344.2±3950 4013.4±857 967.4±726 58.2±6.5 454.4±40.7 77.2±37.4 28.0±19.2 13 8 4 4 4 4 6 3 4
有机小分子调节剂的筛选与设计
有机小分子的药理学活性
有机小分子先导药物的不足： 作用于Kv1.3钾通道的选择性和特异性不强
多肽调节剂的筛选与设计
以海葵毒素为基础的 多肽药物筛选与设计 多肽药物的 筛选与设计 以蝎毒肽为基础的多 肽药物筛选与设计
自然界中的有毒动物
海葵毒素多肽药物的研发
选择性较好的SL5多肽药理学活性 海 葵
海葵毒ຫໍສະໝຸດ BaiduShk
多肽调节剂的筛选与设计
以海葵毒素为基础的 多肽药物筛选与设计 多肽药物的 筛选与设计 以蝎毒肽为基础的 多肽药物筛选与设计
自然界中的有毒动物
以蝎毒肽为基础的药物研发
蝎
作用于钾离子通道的蝎毒肽
作为天然的毒素资源库，蝎毒肽比海葵毒素更丰富。
如何获得对钾通道Kv1.3高选择性和特 异性的多肽调节剂？ • 从蝎毒肽中天然分离
人 类 自 身 免 疫 病 的 致 病 性 自 身 抗 原
疾 病 桥本甲状腺炎 原发性粘液水肿 甲状腺功能亢进症 恶性贫血 艾迪森病 过早停经 男性不育 胰岛素依赖性糖尿病 多发性硬化症 肺肾综合征 寻常天疱疮 类天疱疮 晶状体源性色素膜炎 交感性眼炎 重症肌无力 自身免疫性溶血性贫血 原发性血小板减少性紫 癜 原发性胆汁性肝硬化 慢性活动性肝炎 溃汤性结肠炎 干燥综合征 类风湿关节炎 盘状型红斑狼疮 肌皮病 硬皮病 混合结缔组织病 系统性红斑狼疮
自 身 抗 原 甲状腺球蛋白 第二胶体抗原（CA2） 、胞质微粒体、细胞膜 细胞表面 TSH 受体 内因子、壁细胞微粒体 肾上腺细胞胞质 类固醇产生细胞胞质 精子 胰岛细胞胞质、细胞表面物质 脑 肾小球和肺血管基膜 上皮棘细胞间的桥粒 基膜 晶状体 眼色素膜 骨骼肌和心肌中乙酰胆碱受体 红细胞 血小板 线粒体（主要） 平滑肌、细胞核、细胞表面蛋白 结肠脂多糖 腺管、线粒体、细胞核、甲状腺、IgG IgG、类风湿关节炎相关核抗原（RANA） 、胶原蛋 白 细胞核 IgG 可提取的细胞核 DNA 核蛋白、细胞质中可溶性抗原、其他抗原：血液中 有形成分、凝血因子、华氏抗原
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非器官特异性 自身免疫溶血性贫血 特发性血小板减少症 + 肺肾综合征 类风湿关节炎 干燥综合征 系统性红斑狼疮 硬皮病 肌皮病
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• 治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道
• 靶向Kv1.3通道的先导药物研发 • 靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫 疾病中的应用
靶向钾通道Kv1.3的 药物研发
有机小分子调 节剂的筛选与 设计
多肽调节剂的 筛选与设计
有机小分子调节剂的筛选与设计
1998年，Merck公司就分离到correolide，它能在100nM水平上抑制T细胞的 增殖。随后Merck、Pfzer等研发机构分离、合成、和功能鉴定了10多种有机小 分子药物候选物。
自身免疫疾病已被我国列为“十大”严重影响人民 健康的疾病之一。
系统性红斑狼疮
多发性硬化症
类风湿性关节炎
全球有5-8%的人口受到约40种自身免疫疾病的威胁！
自身免疫病的共同特征
1、 多数自身免疫性疾病病因不明； 2、患者女性多见，发病率随年龄增高，有 遗传倾向； 3、存在自身抗体和（或）自身反应性T细胞； 4 、疾病的重叠现象； 5、病程迁延，发作与缓解交替； 6、免疫抑制剂治疗有一定疗效
高水平 低水平 血流→淋巴组织
短（数日） -
低水平 高水平 直接移行至抗原部位
长（数月） +++
再循环
寿命
再次抗原刺 激
T细胞的分类
记忆T细胞（memory T cell,Tm）根据其表面受体CCR7分子 的表达和功能不同，可分为TEM（CCR7-）和TCM （CCR7+） 细胞。
钾通道Kv1.3 和 IKCa1在不同T细胞中的表达
治疗自身免疫性疾病的新靶标和 相关新药研发
• 治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道
• 靶向Kv1.3通道的先导药物研发 • 靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫 疾病中的应用
自身免疫疾病
自身免疫性疾病（autoimmune diseases）是指机体对自 身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。 系统性自身免疫病（非器官特异性）
系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus) 类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis） 口眼干燥综合征 (Sjogren's syndrome) 结节性多发性动脉炎 (polyarteritis nodosa)
器官特异性自身免疫病
慢性淋巴细胞性甲状腺炎 (Hashimoto's thyroiditis) 多发性硬化症 (multiple sclerosis) 重症肌无力 (myasthenia gravis) 胰岛素依赖型糖尿病 (insulin-dependent diabetes mellitus)
Kaliotoxin
OSK1[P12,K16,D 20]
Anuroctoxin
ShK(L5)
ADWX-1
ADWX-1与Kv1.3通道作用的机制？
• 设计ADWX-1的丙氨酸扫描突变体
• 测定突变体的药理学活性 • 生物信息学模建复合物结构
ADWX-1的突变体设计
ADWX-1突变体二级结构分析
突变体对Kv1.3通道的药理学活性
钾离子通道
钾离子通道是一类细胞膜上选择性允许K+跨膜通过的离子通道，是 继G-蛋白偶联受体和蛋白激酶之后的第三大信号转导分子家族。
2003年诺贝尔奖
治疗自身免疫疾病的新靶标：钾通道Kv1.3
钾通道Kv1.3结构示意图
TEM细胞的异常增殖在自身免疫疾病中起重要的作用，钾通 道Kv1.3成为了治疗自身免疫疾病的一个新的药物靶标。
发病机制
免疫耐受性的终止和破坏是自身免疫病发生的根本机制。 确切原因尚未完全阐明，可能与下列因素有关：
• 自身抗原的出现
隐蔽抗原的释放 、自身抗原发生改变
• 免疫调节异常
淋巴细胞的多克隆激活、Th1和Th2细胞功能失调
• 交叉抗原
链球菌感染、 EB病毒感染、柯萨奇病毒感染
• 表位扩展 • 遗传因素
临床上主要的自身免疫病及其相关证据
疾病 直接证据 自身抗体 传递疾病 母体 输入 传递 动物 器官特异性 重症肌无力 甲状腺机能亢进 桥本甲状腺炎 胰岛素依赖性糖尿病 恶性贫血 艾迪森病 天疱疮 原发性胆汁肝硬化 多发性硬化症 + + + + + SCLD 小鼠中 输入细 胞引起 疾病 自身抗 原在实 验动物 中诱发 疾病 + + 间接证据 病变中证实有 实验动物 抗体或 T 细胞 中输入淋 巴细胞引 (抗体 T 细胞) 起疾病 动 物 模 型 证实有自 身抗体或 自身反应 性 T 细胞
Kv1.x通道序列比对、通道模型 及药物分子作用区域示意图
与有机小分子药物相比，多肽调节剂具有更好的选择性和 特异性。
• 治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道
• 靶向Kv1.3通道的先导药物研发 • 靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫 疾病中的应用
理想的治疗策略：
选择性的抑制自身免疫而不影响正常免疫功能，毒副作用弱
T细胞和自身免疫疾病
选择性抑制T细 胞的激活和增 殖的免疫抑制 剂可以有效的 治疗自身免疫 疾病。
T细胞引起自身免疫的信号通路
T细胞中的钾离子通道
• 电压门控钾通道亚型Kv1.3 • 中等电导钙激活钾通道(IKCa1)
与钾通道Kv1.3和IKCa1相关的 T细胞激活过程
发病机制
治疗策略
免疫抑制剂
• 皮质激素：强的松，可的松 • 细胞毒性药物：烷化剂，嘌呤拮抗剂等
抗感染
• 抗菌素：环孢子菌素、氯霉素
细胞因子及受体抗体或阻断剂
• 生物学制剂：抗淋巴细胞球蛋白、细胞因子单抗、细胞因子 受体拮抗剂
缺点：不能根治，且对肝脏和肾脏有毒性，长期使用有 致感染和致癌作用，导致不育和畸形，副作用强
先导药物多肽ADWX-1的设计
α-KTx3亚家族蝎毒肽序列比对
BmKTX结构
蝎毒肽和Kv1.x钾通道作用模式
先导药物多肽ADWX-1的设计
ADWX-1和BmKTX的序列比对及其和Kv1.3通道作用
ADWX-1多肽的表达纯化
ADWX-1和rBmKTX的圆二色谱比较
ADWX-1和BmKTX的NMR结构比较
Arg23，Lys26和Kv1.3的相互作用
Phe24和Kv1.3的相互作用 Arg23， Phe24 ，Lys26和Kv1.3的相互作用
有机小分子和多肽调节剂的比较
有机小分子correolide与Kv1.3通道的相互作用
多肽KTX与Kv1.3通道的相互作用
多肽
小分子
钾 通 道 细胞内
小分子和多肽作用 Kv1.3通道的示意图
T细胞的分类
根据T细胞表面CD45分子，将T细胞分为二个新亚群。凡未 经抗原刺激的T细胞可称之为原始T细胞（naive T cell,Tn） 为CD45RA+T细胞群，而经抗原刺激分化为记忆T细胞 （memory T cell,Tm）为CD45RO+细胞群。
特性 CD45 归巢受休表 达 粘附分子表 达 Tn CD45RA Tm CD45RO
Kd-IC50 xm (nM)
Specificity Index xm/cn n=Kv1.3 1 >100 2.9 1 2.7 61 1 54 >1000 1 >100 8.34 1 92 >100 1 >300 >100000
Charybdotoxin
3.5 >999 10 0.41 1.1 25 0.059 3.18 >100 0.73 >100 6.1 0.076 7.0 48 0.002 0.65 >100
以蝎毒肽为模板的多肽调节剂设计和改造
2005年，法国科学家 Jean-Marc等改造蝎钾 毒素多肽OSK1获得了 特异作用于Kv1.3通道 的多肽AOSK1。
AOSK1及其突变体对Kv1.3的特异性和选择性比较
靶向钾通道Kv1.3先导药物多肽ADWX-1的筛选
2008年，武汉大学依据已建立的 多种蝎毒腺cDNA文库，结合蝎 毒肽的结构与功能研究，设计筛 选获得了选择性和特异性作用于 Kv1.3通道的多肽ADWX-1。
Peptide
Channels and cells tested hKv1.3 Tlymph rKv1.1 oocyte rKv1.2 B82 rKv1.3 oocyte mKv1.1 oocyte mKv1.2 oocyte mKv1.3 mKv1.1 COS hKv1.2 COS hKv1.3 Tlymph hKv1.1 L929 hKv1.2 COS hKv1.3 Tlymph mKv1.1 rKv1.2 B82 mKv1.3 HEK mKv1.1 HEK hKv1.2 HEK