组织线粒体提取
线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
线粒体DNA提取SOP
线粒体DNA提取SOP
一、蛋白酶K法
1、使用液氮将50mg新鲜组织样本研磨至粉末状；
2、转入1.5mL离心管中加入溶液A（4℃）1mL，冰浴中吹打分散后沉降大块沉淀；
3、4℃，1000r/min离心1min，分离颗粒细胞核和细胞碎片；
4、回收上清至新的1.5mL离心管，12000r/min离心10min；
5、弃上清，尽量去除干净；
6、加50uL蛋白酶K，55℃水浴2.5h，期间每隔15min轻轻混匀；
7、加水至500uL；
8、加入等体积的酚、氯仿、异丙醇抽提，轻柔上下翻转离心管15min；
9、1000r/min离心10min；
10、水相转移至新管并加入各500uL的氯仿和异丙醇，轻柔上下翻转离心管15min；
11、1000r/min离心10min；
12、水相转移至新管，加入2倍体积的冰乙醇沉淀，静置10min；
13、12000r/min离心2min，沉淀即为mtDNA；
14、70%乙醇清洗线粒体DNA，置于空气中自然干燥后加入适量TE液溶解，于4℃保存。
实验五 线粒体的分离与观察
（二）密度梯度离心
（density gradient centrifugation）
A等速度沉降，B等密度沉降
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度 梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
密度梯度离心法是用密度具有梯度的介质来替换 离心管中的密度均一的介质，使介质分为不同的 层次，浓度的低的在上层，浓度高的在底层。将 细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大 小、形态、密度的颗粒就会以不同的速度向下移 动，集中到不同的区域，可以分别收集。
差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使 较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速 将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来 ，从而使各种亚细胞组分得以分离。
但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心 十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离 得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需 经反复悬浮和离心加以纯化。
F 105000g x 20min
内容物 完整细胞 细胞核，细胞碎片 叶绿体 线粒体、溶酶体、微体 微粒体 0.26%脱氧胆酸纳 核糖体
三、实验材料、用品 1.器材： 剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微
镜，冷冻高速离心机等。 2. 材料： 玉米黄化苗
四、玉米线粒体及细胞核的分离 从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能
细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗 糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一 定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶 的活性，避免细胞器的聚集。
沉淀
转速x时间
A 150g x 20min
B 1000g x 20min
C 3000g x 6min
动物线粒体DNA提取的原理和方法
动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。
关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。
它是细胞进行氧化磷酸化的场所。
线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。
线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。
由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。
动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。
进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。
线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。
线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。
线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。
其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。
线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。
锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。
鱼组织线粒体基因组提取方法的改进
以新 鲜鲤 鱼 的肝 脏 、 脾脏 和 肾脏 组 织为 材 料 ， 材
Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｄｓ：ｆ ｉｓ ｈ； ｍｉ ｔ ｏ ｃ ｈ ｏ ｎｄ ｒ ｉ ａ； ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｅ； Ａｌ ｋａ ｌ ｉ ｎ ｅ Ｌ ｙｓ ｉ ｓ
线粒 体 是 真核 细胞 中普遍 存 在 的一 种重 要 而独
特 的 细胞 器 ， 线粒 体ｃ ｔ ： Ｇｅ ｎ ｏ ｍｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｔ ｈ ｅ ￣ｕ ｎ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｑ ｕ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ． Ｔ ｈ ｅ ｐ ｕ ｒ ｅ ｄ ｅ ｇ ｒ ｅ ｅ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｕ ｒ ｅ
第 ２ ５卷 第 ２期
２０１ ３
４月
黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｈ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｂ ａ ｙ ｉ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
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分离线粒体
从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法所需缓冲液：RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液）10mM NaCl（Mr=58.44）2.5mM MgCl2（Mr=203.3）10mM Tris-Cl（PH8.0）调PH值至7.4配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液）525mM甘露醇（Mr=182.17）175mM 蔗糖（Mr=342.3）12.5mM Tris-Cl（PH8.0）2.5mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。
1×MS缓冲液210mM甘露醇70mM 蔗糖5mM Tris-Cl（PH8.0）1mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
注意事项：溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。
从细胞中分离线粒体：1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。
2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。
普利莱基因技术线粒体提取试剂盒说明书
升级版线粒体提取试剂盒C0010描述：线粒体制备试剂盒(Mitochondria Isolation Kit)用于从组织或培养细胞中分离线粒体和细胞胞浆成分。
加入分离溶液，匀浆破碎组织细胞，经过数次800g和12000g离心，在60分钟内即可分离出完整的线粒体和胞浆成分。
制备的线粒体具有很高的生物学活性，可进行各种功能研究如酶学测定，更可用于Western Blot、2D-胶、线粒体蛋白或DNA提取、蛋白质组学等研究。
严格按照说明操作，总是能制备获得高纯度线粒体。
一篇方法学研究论文发现，用普利莱试剂盒制备线粒体的得率、活性、纯度优于蔗糖密度梯度离心法和Invotrogen/Pierce线粒体提取试剂盒方法。
适用：从组织、培养细胞制备高纯度线粒体，同时分离细胞胞浆成分。
组成：Mito Solution100ml for50次制备200ml for100次制备储存：−20ºC12个月有效操作步骤：以下所有操作均在4ºC进行1.组织匀浆：100~200mg新鲜组织如肝、脑、肾、心肌等，剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。
估计组织块总体积。
加入1.5ml冰预冷的Mito Solution。
用间隙严紧的研杵上下研磨组织20次。
培养细胞匀浆：800×g5min离心收集细胞。
单次提取需2-5×107个细胞。
加入1.5ml冰预冷Mito Solution 重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，用间隙严密的研杵研磨细胞30次。
2.将匀浆液转移到离心管中，800×g，4ºC离心5min。
（胞核、膜碎片、未裂解细胞等在管底，弃去）3.收集上清液并转移到新的离心管。
再次800×g离心5min at4ºC，弃沉淀。
4.将上清液转移到新的离心管。
10,000×g离心10min4ºC。
线粒体沉淀在管底。
离心后的上清含胞浆成分，可收集用于对照实验。
蛋白提取方法及注意事项
组织蛋白提取材料准备：组织、冰块、称、超声匀浆器、试剂各种试剂比例：PMSF：Lysis Buffer = 1:1001、将组织称重，减去EP管重量2、每100mg组织加入1mL(1mg ,10ul)试剂，冰上裂解半小时3、匀浆（注意低温操作），开20秒，关2秒，共打20次，每次用水冲洗，擦干，超声完后放冰上4、将匀浆液移至1.5mL预冷离心管5、离心，12000转，4℃，30分钟6、取上清至新的预冷的EP管7、BCA定量8、放入—80℃线粒体蛋白提取材料准备（放冰盒中）：线粒体试剂、EP管、EP管中的组织、枪头、PBS1、用冷PBS清洗细胞2次，洗后吸干上清2、加入A200uL，放冰上10分钟3、匀浆30-40次，每次用清水清洗匀浆器头4、离心500rpm，4℃，5分钟5、将上清移至离心管6、离心1100rpm，4℃，20分钟7、沉淀中加入200uLB，混匀8、离心1100rpm，4℃，20分钟9、弃上清10、加入80-150uL裂解液，放冰上20分钟，每隔5分钟高速震荡15秒，11、得线粒体蛋白12、定量后放-80℃冰箱。
细胞总蛋白提取材料准备：试剂（—20℃）、细胞培养板、EP管（已标记）均放置于冰盒中操作，以防止蛋白降解。
1、吸掉培基2、加入PBS，约1ml/孔左右，用手晃匀3、约5min后倒去PBS，并用枪将PBS尽量吸尽4、加入试剂，摇床振荡10分钟，再置冰上10分钟。
培养器皿面积（cm2）培养液量（ml）细胞量裂解液（ul）96 孔培养板0.32 0.1 10524孔培养板 2 1.0 5×10512孔培养板 4.5 2.0 1066孔培养板9.6 2.5 2.5×106803.5 cm 培养皿8 3.0 2×1066 cm 培养皿21 5.0 5.2×10632010 cm 培养皿55 10.0 13.7×10680025cm2培养瓶25 5.0 5×10675cm2培养瓶75 15～30 2×1075、用黄色枪头将各孔中cell刮下，保证孔底部分都要刮到，根据分组将细胞悬液吸入各个EP管中。
动物线粒体DNA提取的原理和方法
动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。
关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。
它是细胞进行氧化磷酸化的场所。
线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。
线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。
由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。
动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。
进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。
线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。
线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。
线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。
其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。
线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。
锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。
线粒体提取方法
线粒体提取试剂盒产品组成：产品组成 BB-3601-1 BB-3601-2规格 50T 100T线粒体提取液A 20ml 40ml线粒体提取液B 20ml 40ml线粒体保存液 20ml 40ml产品简介：本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的线粒体提取。
不能用于冷冻样品的线粒体提取。
细胞线粒体提取：1.取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；2.用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。
4.用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。
5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。
6.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
7.在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
8.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
9.弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。
10.即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
组织线粒体提取：a)取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
b)用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
c)加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。
d)用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。
e)快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。
f)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
g)在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
h)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
i)弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。
j)即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
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线粒体的分离与鉴定
线粒体的分离与鉴定
实验简介
线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器，人体内95%
的ATP是由线粒体中的呼吸链所产生的，因此线粒体是细胞
内的“能量加工厂”，线粒体通过氧化磷酸化作用，进行能量 转换，为细胞进行各种生命活动提供能量。
本实验以小鼠肝组织为实验材料，通过对肝组织匀浆液悬浮
在蔗糖介质中进行差速离心法制备线粒体样本，然后通过詹 纳斯绿活染法进行显微镜观察线粒体的形态。 实验学时3个。
四、实验操作
速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷 到0～4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0～4℃条件下，
制备小鼠肝细胞匀浆：实验前小鼠空腹12h，拉颈处死，剖腹取肝，迅
按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液 应分数次添加。匀浆液用200目铜筛过滤备用。 离心：先将9ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心
六、注意事项
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程 不宜过长，以保持组分的生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中 进行。 将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离 心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层 效果。 姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应 用液不可使用。
地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻高速离心机按下图顺序进行 差速离心。 差速离心提取鼠肝线粒体流程见下图。
差 速 离 心 提 取 鼠 肝 线 粒 体 流 程 图
沉淀 （细胞核及质膜碎 片） 沉淀
取5g 鼠肝
先用生理盐水洗净血水，滤纸吸干，然后 用预冷的0.25M蔗糖溶液洗3次。
洁净的肝组织
线粒体捕获测序方法
线粒体捕获测序方法
1. 提取线粒体DNA，线粒体捕获测序通常从细胞或组织样本中提取线粒体DNA。
这可以通过商业提取试剂盒或自制提取方法来实现，提取后的线粒体DNA可以用于后续的捕获测序实验。
2. 引物设计，为了放大线粒体基因组，科学家需要设计特定的引物来选择性地放大线粒体DNA。
这些引物通常设计成与线粒体基因组中特定区域的序列相匹配，以确保只放大线粒体DNA而不放大核DNA。
3. PCR放大，通过聚合酶链式反应（PCR），使用设计的引物来放大线粒体DNA。
这一步骤可以增加线粒体DNA的数量，为后续的测序实验做准备。
4. 测序，放大后的线粒体DNA可以进行测序，常用的方法包括Sanger测序和下一代测序技术（如illumina测序）。
这些测序方法可以帮助科学家确定线粒体DNA的序列，从而研究线粒体遗传变异和进化。
5. 数据分析，一旦线粒体DNA的序列获得，科学家可以利用生
物信息学工具对数据进行分析，比如比对到参考基因组、进行突变分析和进化分析等。
总的来说，线粒体捕获测序方法是一种用于研究线粒体DNA的重要技术，它可以帮助科学家深入了解线粒体的遗传特征和进化历史。
通过精心设计的实验流程和数据分析，线粒体捕获测序方法为线粒体遗传学和进化生物学领域的研究提供了重要的技术支持。
碧云天 组织线粒体分离试剂盒
5. Zhang Z, Wang S, Qiu H, Duan C, Ding K, Wang Z.
Waltonitone induces human hepatocellular carcinoma cells apoptosis in vitro and in vivo.
离心速度可以采用1000g和3500g。 ¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后立即置于冰上并混匀。第一次使用时，把1.5ml PMSF(溶剂)加入到 PMSF(晶体)中，溶解并混匀，即得到1.5ml 100mM PMSF。配制好的100mM PMSF溶液-20℃保存。如果最终目的是制备 线粒体蛋白，根据样品数量，取适量相应的线粒体分离试剂备用，在线粒体分离试剂加入到组织样品中前数分钟内加入 PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。取适量线粒体裂解液备用，在线粒体裂解液加入到线粒体样品中前数分钟内加入 PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
包装清单：
产品编号
产品名称
包装
C3606-1
线粒体分离试剂A
60ml
C36ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ6-2
线粒体分离试剂B
60ml
C3606-3
胰酶消化液
50ml
C3606-4
线粒体储存液
3ml
C3606-5
线粒体裂解液
15ml
—
说明书
1份
保存条件：
-20℃保存，一年有效。其中胰酶消化液可以4℃保存。
注意事项：
¾ 试剂盒中的试剂对于不同的实验目的不必全部使用。 ¾ 如果用于制备蛋白样品，需自备PMSF，否则不必使用PMSF。PMSF(ST506)可以向碧云天订购。PMSF一定要在线粒体分
实验二 鼠肝细胞核及线粒体提取和显微观察
实验二线粒体差速离心法分离技术细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心方法，可将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)是在低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取。
[实验要求]1．了解并掌握差速离心法分离技术及原理。
2．熟悉线粒体的Janus green B染色方法，并做出分析。
[实验原理]差速分离由低速到高速离心使细胞内各种组分逐渐沉降。
先用低速离心使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心才能不断纯化。
詹纳斯绿(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜。
詹纳斯绿解离后带有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上。
内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈现蓝绿色。
詹纳斯绿B也可对活细胞进行染色，在显微镜下可观察到细胞内的线粒体因具有细胞色素氧化酶系统，它可使染料始终处于氧化状态呈蓝绿色，而在细胞质中的染料被还原呈无色。
线粒体提取步骤
线粒体提取步骤线粒体的提取步骤制备程序：a.组织匀浆：称取50-200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS冲洗，用剪刀剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。
估计组织块总体积。
加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution。
上下研磨组织20次。
b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。
计数。
每次提取需要2-5 × 107个细胞。
加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内。
用间隙严密的研杵研磨细胞30-40次。
1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。
800 × g 离心 5 min 4 ºC。
细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底,弃去。
2. 收集上清液并转移到新的离心管。
800 × g 离心5 min at 4 ºC。
弃沉淀3. 将上清液转移到新的离心管。
10,000 × g 离心10 min 4 ºC。
离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，可收集用于对照实验。
线粒体沉淀在管底。
4. 洗涤线粒体：清除管内壁粘连的液体和碎片，加入0.2 ml Mito Sdution轻弹管底重悬线粒体沉淀，12,000 × g 离心10 min 4 ºC。
弃上清，线粒体沉淀在管底。
5. 用Mito Sdution或合适后续实验的自备缓冲液重悬线粒体沉淀50 µl/每100 mg组织或100 µl/5 × 107个细胞。
测定蛋白浓度。
立即使用或−70 ºC保存。
注意：1. 为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。
第二是快速。
微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。
第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内唯一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今一直是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或万转/分离心机。
2.组织捣碎机或匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布（尼龙布）、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器（氧极普测试系统）。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl（0.05M，pH7.2）缓冲液。
3.磷酸缓冲液（0.2M，Ph7.2）。
4.提取洗涤液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA（0.001M），TriS-HCl（0.01M，pH7.2）缓冲液。
5.悬浮液（同试剂4，但不加BSA）。
6.反应液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、蔗糖（0.25M）、KCl（10ml，pH7.2）、EDTA（0.2mM）、MgCl2（5mM）、TriS-HCl（10mM，pH7.2）。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素（物理和化学的）作用而失活，特别是膜的完整性极为重要，因为只有完整的线粒体才能进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下（0-4 o C）进行。
[2].要注意分离介质的pH值，pH值应和被采用的材料一致。
[3].捣碎时间要控制得当，或匀浆适度，争取获得更多的完整线粒体。
线粒体提纯后流式鉴定
线粒体提纯后进行流式鉴定是一种常用的线粒体质量检测方法，其主要目的是评估线粒体的纯度、完整性和功能状态。
下面是一个线粒体提纯后进行流式鉴定的实验流程示例：
1. 线粒体的提纯：使用适当的线粒体分离方法，如差速离心或密度梯度离心，从细胞或组织中提纯线粒体。
2. 荧光染料标记：选择适合线粒体标记的荧光染料，如 MitoTracker 染料或其他线粒体特异性染料。
将提纯的线粒体与荧光染料孵育，使染料结合到线粒体上。
3. 流式细胞仪设置：根据所使用的流式细胞仪型号和荧光染料的激发和发射波长，设置合适的参数，如激光功率、荧光通道等。
4. 流式分析：将标记后的线粒体悬液加载到流式细胞仪中，进行流式分析。
通过流式细胞仪，可以获得线粒体的荧光强度、大小、形态等信息。
5. 数据分析：使用相应的流式分析软件，对获取的流式数据进行分析。
可以根据荧光强度的分布，确定线粒体的纯度和数量；根据线粒体的大小和形态，评估其完整性。
需要注意的是，流式鉴定的结果可能会受到多种因素的影响，如线粒体的提纯方法、染料的选择和孵育条件等。
因此，在进行流式鉴定时，需要进行适当的对照和质量控制，以确保结果的准确性和可靠性。
以上内容仅供参考，具体的实验步骤和分析方法可能因实验需求和设备条件而有所不同。
建议在进行线粒体提纯和流式鉴定实验前，详细阅读相关的实验指南和文献，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
组织线粒体提取
组织线粒体提取从动物组织中粗提线粒体一、实验目的：从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。
二、实验准备Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具三、实验步骤：1．实验前一天小鼠禁食过夜。
线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。
2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml 预冷的IBc烧杯中；3．预冷的IBc洗去多余的血液。
洗4-5次至IBc澄清。
4．冰上将肝脏剪碎5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬11．7000g，离心10min 4 ℃12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。
用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。
用1ml移液管重悬避免出现气泡。
13．转移至14ml离心管，置于冰上。
线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。
14．Bradford法测定线粒体浓度。
四、试剂配方Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml10 ml 0.1M Tris–MOPS1 ml 0.1M EGTA/Tris20 ml 1M sucrose100 ml ddH2O，pH 7.4储液：1 M sucrose：342.3 g sucrose1L ddH2OMix, 20 ml分装-20 C保存.0.1MTris/MOPS：12.1 g Tris；500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4C.0.1 M EGTA/Tris：38.1 g EGTA；500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C.五、注意事项1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性；2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。
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从动物组织中粗提线粒体
一、实验目的：
从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。
二、实验准备
Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具
三、实验步骤：
1．实验前一天小鼠禁食过夜。
线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。
2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml预冷的IBc烧杯中；
3．预冷的IBc洗去多余的血液。
洗4-5次至IBc澄清。
4．冰上将肝脏剪碎
5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器
6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间
7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃
8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃
9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃
10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬
11．7000g，离心10min 4 ℃
12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。
用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。
用1ml移液管重悬避免出现气泡。
13．转移至14ml离心管，置于冰上。
线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。
14．Bradford法测定线粒体浓度。
四、试剂配方
Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml
10 ml 0.1M Tris–MOPS
1 ml 0.1M EGTA/Tris
20 ml 1M sucrose
100 ml ddH2O，pH 7.4
储液：
1 M sucrose：
342.3 g sucrose
1L ddH2O
Mix, 20 ml分装-20 C保存.
0.1MTris/MOPS：
12.1 g Tris；
500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4 C.
0.1 M EGTA/Tris：
38.1 g EGTA；
500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C.
五、注意事项
1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性；
2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。
不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬，线
粒体在高浓度减少与氧接触时可长时间保持其功能。
用1ml移液管重悬避免出现气泡。
3. 此种方法得到的线粒体约为80 mg/ml,体积为1ml
六、参考文献
NATURE PROTOCOLS, VOL.2 NO.2, 2007。