线粒体提取
线粒体DNA提取
mtDNA提取流程(1)将待测组织充分切碎(碎片大小:脾脏组织≤10 mg、其他组织≤25 mg),取样品25 mg移入微型离心管。
(2)加入180 μL Buffer ATL、20 μL Proteinase K、缓慢充分混匀,置于56 ℃恒温水浴直到完全溶解(水浴期间间隔摇晃混合)。
在开始下一步前摇晃混合15 s。
(3)加入200μL Buffer AL,充分混合(血液样品需56℃恒温水浴10 min)。
(4)加入200 μL 无水乙醇,混合均匀。
(5)将混合溶液移至2mL收集管中的滤管里,6000 xg条件离心1 min,取出滤管,扔掉收集管。
(6)将滤管放入新的收集管中,加入500 μL Buffer AW1, 6000 xg条件离心1 min,取出滤管,扔掉收集管。
(7)将滤管放入新的收集管中,加入500 μL Buffer AW2, 20000 xg条件离心3 min,取出滤管,扔掉收集管。
(8)将滤管放入新的微型离心管(1.5-2 mL)。
(9)向滤管中心滴加200 μL(100 μL)Buffer AE洗涤DNA,室温放置1 min。
6000 xg条件离心1 min。
(10)重复一边上述步骤,增大DNA产率(重复一遍即可)。
理论25mg原料大概能提取10-20μg DNA.注:摇晃混合和拿起时一定要轻慢,防止DNA断裂。
琼脂糖电泳步骤1. 准备电泳槽:将有机玻璃的电泳凝胶床洗净晾干,插上样品梳。
2. 琼脂糖凝胶的制备:称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中(1%的琼脂糖含量),置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。
3. 灌胶:将冷却60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上(厚度不超过0.5cm)。
待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。
5. 加样:将DNA样品与加样缓冲液按5:1混匀后(取10μL DNA样液与2μL 电泳载样缓或5μL DNA样液与1μL 电泳载样缓冲液混匀,用移液枪将混合液加到样品槽中,每槽加10-20μL,记录样品的点样次序和加样量。
线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
线粒体DNA提取SOP
线粒体DNA提取SOP
一、蛋白酶K法
1、使用液氮将50mg新鲜组织样本研磨至粉末状；
2、转入1.5mL离心管中加入溶液A（4℃）1mL，冰浴中吹打分散后沉降大块沉淀；
3、4℃，1000r/min离心1min，分离颗粒细胞核和细胞碎片；
4、回收上清至新的1.5mL离心管，12000r/min离心10min；
5、弃上清，尽量去除干净；
6、加50uL蛋白酶K，55℃水浴2.5h，期间每隔15min轻轻混匀；
7、加水至500uL；
8、加入等体积的酚、氯仿、异丙醇抽提，轻柔上下翻转离心管15min；
9、1000r/min离心10min；
10、水相转移至新管并加入各500uL的氯仿和异丙醇，轻柔上下翻转离心管15min；
11、1000r/min离心10min；
12、水相转移至新管，加入2倍体积的冰乙醇沉淀，静置10min；
13、12000r/min离心2min，沉淀即为mtDNA；
14、70%乙醇清洗线粒体DNA，置于空气中自然干燥后加入适量TE液溶解，于4℃保存。
线粒体DNA提取
mtDNA提取流程（1）将待测组织充分切碎（碎片大小：脾脏组织≤10 mg、其他组织≤25 mg），取样品25 mg移入微型离心管。
（2）加入180 μL Buffer ATL、20 μL Proteinase K、缓慢充分混匀，置于56 ℃恒温水浴直到完全溶解（水浴期间间隔摇晃混合）。
在开始下一步前摇晃混合15 s。
（3）加入200μL Buffer AL，充分混合（血液样品需56℃恒温水浴10 min）。
（4）加入200 μL 无水乙醇，混合均匀。
（5）将混合溶液移至2mL收集管中的滤管里，6000 xg条件离心1 min，取出滤管，扔掉收集管。
（6）将滤管放入新的收集管中，加入500 μL Buffer AW1, 6000 xg条件离心1 min，取出滤管，扔掉收集管。
（7）将滤管放入新的收集管中，加入500 μL Buffer AW2, 20000 xg条件离心3 min，取出滤管，扔掉收集管。
（8）将滤管放入新的微型离心管（1.5-2 mL）。
（9）向滤管中心滴加200 μL（100 μL）Buffer AE洗涤DNA，室温放置1 min。
6000 xg条件离心1 min。
（10）重复一边上述步骤，增大DNA产率（重复一遍即可）。
理论25mg原料大概能提取10-20μg DNA.注：摇晃混合和拿起时一定要轻慢，防止DNA断裂。
琼脂糖电泳步骤1. 准备电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净晾干，插上样品梳。
2. 琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中（1%的琼脂糖含量），置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。
3. 灌胶：将冷却60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上（厚度不超过0.5cm）。
待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。
5. 加样：将DNA样品与加样缓冲液按5：1混匀后（取10µL DNA样液与2µL 电泳载样缓或5µL DNA样液与1µL 电泳载样缓冲液混匀，用移液枪将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μL，记录样品的点样次序和加样量。
线粒体DNA的提取方法
A buffer: 10 mmol/L Tris-HCL ， pH 7.4 ； 500 mmol/L ； 20 mmol/LEDTA；0.2%BSA；0.2%β-mercaptoethanol B buffer: 10 mmol/L Tris-HCL ，pH 7.4；600 mmol/L sucrose; 20 mmol/L EDTA
实验原理
1、4000rpm 离心可以沉淀分离出叶绿体、 细胞核和组织碎片，12, 000 rpm离心才可 沉淀分离线粒体。 2、用蔗糖浓度梯度纯化线粒体，不同浓度 蔗糖的缓冲液因比重不同而分层。
3、SDS可以从植物各样组织类型中释放和 结合的细胞核酸。
仪器设备： Apparatus:
研钵和研杵；冷冻离心机；过滤装置（漏 斗，玻棒） pH 计；移液器；水浴箱； 50mL 离心管；2；1.5 mL离心管。 mortar (cold); Centrifuged; filter; pH meter; water bath boiler; 50mL centrifugal tube; eppendorf tube .
2.线粒体在37℃下裂解4 h后(或60℃下裂解40min)，往裂解液中加 入等体积的酚-氯仿异戊醇，轻轻混匀，静置5 m in。在12 000rpm 4℃下离心 10 min。吸出上清，再用酚 - 氯仿 / 异戊醇抽提，吸取上 清，加入?RNase,在37℃下保温30m in后,加入酚-氯仿/异戊醇抽提， 吸出上清，再用氯仿 /异戊醇抽提。吸出上清 ,加入1/10 体积的乙 酸钠和两倍体积的异丙醇，置- 20 ℃ 2 h 或过夜。 2. The material were lysed in 2% SDS, constantly shaking the mixture. If the tissue coalesces, warm the tubes in a 60℃water bath for 40 min (or in a 37℃water bath for 4h) until the organelles are fully lysed. Shake the mixture intensively for 10min with an equal volume of equilibrated phenol. Centrifuge for 10min at 12,000 rpm. Remove the upper aqueous phase. The RNase treatment was done at 37℃ for 30minutes. Then add phenol∶chloroform∶isoamyl alcohol （ 25∶24∶1 ） . Repeat the procedure. Add chloroform∶isoamyl alcohol （24∶1）. Repeat the procedure. Precipitate the DNA with 1/10 vol of 3M NaAC and 2 vol of isopropanol at -20℃ for 2-3h or overnight.
线粒体提取
线粒体提取缓冲液A(100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl, 1 2mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10,g/ml pepstatin A)。
缓冲液B(pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A)。
1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。
2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。
3、匀浆液经4层纱布过滤。
滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(1)。
4、于2,600g 离心15 min(Beckman J2-HS)，弃沉淀。
上清取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(2)。
5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。
6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。
从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(3)。
7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml/ 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和 8 ml/ 1.8 M sucrose。
介质均用缓冲液B配制。
8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。
9、然后以24000rpm离心90 min(SW Beckman rotor)。
2810、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。
11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。
13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(4)。
14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80?。
几种不同提取线粒体的方法对线粒体含量及活性的影响
【 KEY W O RD S】 m itochondria; m itochondrial extraction; m itochondrial ac tivity
基础研究
几种不同提取线粒 体的方法对线粒体含量及活性的影响
吴 媛 1, 2 董凌月 1 , 2 安 威 1, 23 安云庆 3 3
( 1. 首都医科大学基础医学院细胞生物学系 ; 学系 )
【 摘要 】 目的 比 较几种不同的提取线粒体的方法对线粒 体蛋白 浓度及 活性的 影响 。方法 采用 蔗糖密 度梯度 离心法 、 普利 莱试剂盒提取方法和 Pierce线粒 体提取试剂盒方法分别提取线粒体 ,测定提 取得到的线 粒体蛋 白浓度 、 污染 情况和活 性 。结果 同样数量的细胞采用普利莱法提取得到的线粒体蛋白 浓度 高于 其他 2 种方法所提取的线粒体蛋白浓度 ( P < 0. 05 ) ; 采用 W este rn
2010 年 4 月 第 31 卷 第 2 期
首 都 医 科 大 学 学 报 Journa l of Capita lM edical U niversity
Apr . 2010 Vo l . 31 No. 2
[ do i: 10. 3969/ j. issn. 1006 2 7795. 2010. 02. 020]
2应用蔗糖密度梯度离心法以下简称为蔗糖法传代培养的细胞pbs洗3次消化细胞并收集沉淀用hepesph22moll甘露醇70mmoll蔗糖edta1无脂肪酸的bsa匀浆之后800g离心10min将上清以11000g离心15min将得到的沉淀用i2pa缓冲液25mgl蛋白酶抑制剂和pmsf洗涤并重悬放于冰上15min1000010min收集上清即为线粒体蛋白3应用pierce公司线粒体提取试剂盒提取线粒以下简称为pierce法将传代培养的细胞化细胞并收集沉淀加入800试剂a中速涡旋min加入10l试剂b以最大速度涡旋冰中min再以最大速度涡旋min后加入800l试剂10min取上清000g离心15min再将沉淀加入500l试剂12000g离心min管内沉淀即为线粒体
动物线粒体DNA提取的原理和方法
动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。
关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。
它是细胞进行氧化磷酸化的场所。
线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。
线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。
由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。
动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。
进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。
线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。
线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。
线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。
其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。
线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。
锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。
线粒体提取方法
线粒体提取试剂盒产品组成：产品组成 BB-3601-1 BB-3601-2规格 50T 100T线粒体提取液A 20ml 40ml线粒体提取液B 20ml 40ml线粒体保存液 20ml 40ml产品简介：本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的线粒体提取。
不能用于冷冻样品的线粒体提取。
细胞线粒体提取：1.取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；2.用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。
4.用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。
5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。
6.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
7.在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
8.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
9.弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。
10.即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
组织线粒体提取：a)取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
b)用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
c)加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。
d)用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。
e)快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。
f)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
g)在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
h)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
i)弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。
j)即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
相关产品：产品 产品号 产品 产品号 总蛋白提取试剂盒BB-3101 磷酸化蛋白富集试剂盒 BB-3108核蛋白提取试剂盒 BB-3102 膜蛋白提取试剂盒 BB-3103- 1 -膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒 BB-3104 活性蛋白提取试剂盒 BB-3106Bradford蛋白定量试剂盒 BB-3411 BCA蛋白定量试剂盒 BB-3401ECL化学发光检测试剂盒 BB-3501 植物核蛋白提取试剂盒 BB-3154细胞蛋白提取试剂盒 BB-3121 细菌膜蛋白提取试剂盒 BB-3151组织蛋白提取试剂盒 BB-3122 植物总蛋白提取试剂盒 BB-3124细菌蛋白提取试剂盒 BB-3123 植物膜蛋白提取试剂盒 BB-3152酵母蛋白提取试剂盒 BB-3125蛋白酶抑制剂混合物 BB-3301昆虫蛋白提取试剂盒 BB-3126真菌蛋白提取试剂盒 BB-3127磷酸化蛋白提取试剂盒 BB-3105 磷酸酶抑制剂混合物 BB-3311SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 BB-3702 SDS-PAGE上样Buffer BB-3703总蛋白提取试剂盒（2D电泳用） BB-3181 细菌蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3182植物蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3183 酵母蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3185细菌膜蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3187 线粒体蛋白提取盒（2D电泳用）BB-3191- 2 -。
实验五 线粒体的分离与观察
离心技术概述
离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受 到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离 技术。
离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到 一个向外的力。与角速度和旋转半径有关。
相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相 当于重力加速度的倍数，表示“数字×g”。
离心力g＝1.11×10-5n2r
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速（
r/min）
1000g=9.8牛（N）
离心技术类型
离心技术可用于细胞器的分离。 离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离心
（一）差速离心
（differential centrifugation）
在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离 不同大小的细胞和细胞器。
实验五 线粒体的分离与观察
一、实验目的
1.对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 2.掌握用差速离心技术分离制备线粒 体的方法。
二、实验原理
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能 性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就 要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种 物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织 制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释 放出来。
(1)匀浆(Homogenization)低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质( 即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成 为各种细胞器及其包含物的匀浆。
(2)分级分离(Fractionation)由低速到高速离 心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀， 再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉 淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、 线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和 密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整 个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉 淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化.
线粒体的提取与观察
线粒体的提取与观察线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时（如电镜和光镜的观察）可采用从组织培养细胞中提取，本实验就是介绍两种材料制备用于光镜观察的线粒体。
一、目的与要求了解提取线粒体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态二、基本原理线粒体具有完整的结构，一定的大小和质量，低温条件下在等渗液中破碎细胞，差速离心后，获得线粒体。
经活性染料Janus green B染色，线粒体呈浅蓝色。
三、实验内容1.线粒体的分离提取2. 鼠肝的匀浆制备3. 线粒体的活体染色四、实验步骤（一）动物组织线粒体的分离，提取与观察显微镜检查：将1％Janus green B溶液按1:1比例加入线粒体悬液中,在室温或水浴中染15~20分钟,用吸管吸取一滴线粒体悬液，滴于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜下进行观察，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。
2.组织培养细胞的线粒体的提取与观察（三）操作中应该注意的问题1.整个操作过程为保证线粒体的完整，应尽量使操作时的环境如温度（0—4℃），pH (7.0左右)保持恒定，同时尽可能短操作时间。
2.组培细胞消化时要特别小心，防止损失或反复。
（损失指细胞脱落到消化液中）。
3.匀浆时，所用的介质一定是等渗缓冲液，常用的有0.25 mol/L蔗糖溶液或生理盐水代替Hank’s液4.匀浆次数依照匀浆器的松紧而定，次数过少，细胞破损不完全，就会影响线粒体产量。
5.所以取2/3上清夜用来制备线粒体是为防止细胞碎片过多影响观察。
线粒体提取
.
样品
2
管号
1
2
操 作
混合液（ml）
3.4
3.4
步 骤
琥珀酸钠（ml） 0.8
0.8
延胡索酸（ml） —
—
CK
3
4
3.4
3.4
— 37C恒温水浴3 min
酶液（溶胀液） （ml）
0.2
0.2
0.2
0.2
（立即记时）
每管反应15min
HCl(ml)
0.6
0.6
思考题： 1.通过线粒体制备实验，谈谈你对分离细胞器的体会 2.说出琥珀酸脱氢酶活性测定时，各种试剂的作用。关键步
骤有哪些？ 3.蛋白质含量测定有哪些方法，各有何有优缺点？
0-4℃（2—4 ℃）以减少 自溶变化。这些变化是由 于把正常区隔开来的酶和 底物混合到一起的结果。
匀浆液用4层纱布过滤
残渣 弃 （部分未破碎的组分）
上清液 12000g 离心15min
上清液 弃
加3ml悬浮液，悬浮线粒体
滤液 3000g 离心10min
沉淀 弃
（细胞碎片、细胞核等） 沉淀 留 （线粒体）
4.注意事项 制备植物线粒体最大的困难是随着组织的破坏 ，常伴随有线粒体膨胀和由于内源脂肪酸、酚类 、醌类物质所引起正常线粒体机能的抑制。所以 制备时要求： （1）溶剂系统必须要维持一定的渗透压。一 般使用的是甘露醇或蔗糖。 （2）加螯合剂或巯基化合物去除酚类化合物 的毒害。 （3）加入牛血清抑制游离脂肪酸或其它脂类 物质的毒害。 （4）根据不同材料确定不同的缓冲系统。
介质中，常含有： ① 0.25-0.4mol/L蔗糖或甘露醇，使与细胞溶液成等渗的； ② 50mmol/L的pH7-8缓冲液（通常用tris),以中和酸性的
核与线粒体分离提取方案
核与线粒体分离提取方案线虫细胞核和线粒体提取N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。
初步计划收集10个皿线虫。
1.细胞核分离细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。
查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。
方法如下：1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。
吸出PBS。
3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。
转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。
4.以10000rpm短暂离心5-10秒。
5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次7.用棉布过滤匀浆8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。
丢弃上清液。
用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。
4℃ 600g 离心10分钟。
丢弃上清液。
10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。
在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。
11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。
12.翻转管子去除蔗糖。
从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。
核在这个阶段保留其膜。
要卸下膜，请执行步骤13。
13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。
在4℃下以600g离心10分钟。
重复该过程。
最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。
线粒体捕获测序方法
线粒体捕获测序方法
1. 提取线粒体DNA，线粒体捕获测序通常从细胞或组织样本中提取线粒体DNA。
这可以通过商业提取试剂盒或自制提取方法来实现，提取后的线粒体DNA可以用于后续的捕获测序实验。
2. 引物设计，为了放大线粒体基因组，科学家需要设计特定的引物来选择性地放大线粒体DNA。
这些引物通常设计成与线粒体基因组中特定区域的序列相匹配，以确保只放大线粒体DNA而不放大核DNA。
3. PCR放大，通过聚合酶链式反应（PCR），使用设计的引物来放大线粒体DNA。
这一步骤可以增加线粒体DNA的数量，为后续的测序实验做准备。
4. 测序，放大后的线粒体DNA可以进行测序，常用的方法包括Sanger测序和下一代测序技术（如illumina测序）。
这些测序方法可以帮助科学家确定线粒体DNA的序列，从而研究线粒体遗传变异和进化。
5. 数据分析，一旦线粒体DNA的序列获得，科学家可以利用生
物信息学工具对数据进行分析，比如比对到参考基因组、进行突变分析和进化分析等。
总的来说，线粒体捕获测序方法是一种用于研究线粒体DNA的重要技术，它可以帮助科学家深入了解线粒体的遗传特征和进化历史。
通过精心设计的实验流程和数据分析，线粒体捕获测序方法为线粒体遗传学和进化生物学领域的研究提供了重要的技术支持。
组织线粒体提取
组织线粒体提取从动物组织中粗提线粒体一、实验目的：从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。
二、实验准备Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具三、实验步骤：1．实验前一天小鼠禁食过夜。
线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。
2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml 预冷的IBc烧杯中；3．预冷的IBc洗去多余的血液。
洗4-5次至IBc澄清。
4．冰上将肝脏剪碎5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬11．7000g，离心10min 4 ℃12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。
用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。
用1ml移液管重悬避免出现气泡。
13．转移至14ml离心管，置于冰上。
线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。
14．Bradford法测定线粒体浓度。
四、试剂配方Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml10 ml 0.1M Tris–MOPS1 ml 0.1M EGTA/Tris20 ml 1M sucrose100 ml ddH2O，pH 7.4储液：1 M sucrose：342.3 g sucrose1L ddH2OMix, 20 ml分装-20 C保存.0.1MTris/MOPS：12.1 g Tris；500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4C.0.1 M EGTA/Tris：38.1 g EGTA；500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C.五、注意事项1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性；2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。
提取线粒体的原理和方法
提取线粒体的原理和方法
嘿，朋友们！今天咱来聊聊提取线粒体的那些事儿。
线粒体啊，就像是细胞里的小“发电站”，给细胞提供着能量呢！那怎么把这些小家伙给弄出来呢？
其实啊，就跟咱在一堆杂物里找宝贝差不多。
咱得先把细胞给破开，这就好比打开一个装满各种东西的大箱子。
然后呢，通过一些巧妙的办法，把线粒体从其他乱七八糟的东西里分离出来。
你想想，细胞就像一个大杂烩，里面啥都有，线粒体只是其中小小的一部分。
咱得想办法让线粒体“脱颖而出”呀！这可不容易，但也不是没办法。
比如说，可以利用线粒体和其他成分的一些不同特性。
就好像不同的东西在水里的沉浮不一样，咱就可以根据这个来把线粒体给“捞”出来。
或者用一些特殊的化学试剂，让线粒体乖乖地聚集到一起，这不就好抓它们了嘛！这就好像用一块磁铁去吸引一堆铁钉里的特定几个铁钉一样。
哎呀，这过程可得细心再细心，就跟咱挑珍珠似的，不能马虎。
要是不小心，可能就把线粒体给弄丢了或者弄不纯啦。
提取线粒体可不只是在实验室里玩玩哦，这可是有大用处的呢！咱可
以通过研究线粒体，了解细胞是怎么工作的，就像了解一个机器的内部构造一样。
这对很多疾病的研究和治疗都很重要呢！
比如说，有些疾病可能就是线粒体出了问题。
那咱要是能把线粒体研究透了，不就能更好地找到治疗的办法了嘛！
所以啊，提取线粒体虽然有点麻烦，但真的很有意义呢！这就像是打开了一扇通往细胞奥秘的大门，让我们能看到更多神奇的东西。
总之呢，提取线粒体就像是一场有趣的探索之旅，虽然会遇到一些小困难，但只要咱有耐心、有技巧，就一定能成功把这些小“发电站”给揪出来！大家加油哦！。
纯化线粒体肿胀光度法
纯化线粒体肿胀光度法概述纯化线粒体肿胀光度法是一种用于评估线粒体膨胀的实验方法。
线粒体是细胞内的重要器官，其功能异常与多种疾病的发生密切相关。
线粒体膨胀是一种线粒体损伤的早期指标，通过测量线粒体的膨胀程度可以评估细胞内的损伤程度。
实验步骤1. 提取线粒体1.1 采集适当数量的细胞，如肌肉组织或细胞培养物。
1.2 用低速离心将细胞分离。
1.3 用断头裂解缓冲液（Lysis Buffer）裂解细胞膜。
Lysis Buffer的配方通常包括0.1 M Tris-HCl（pH 7.4）、糖、盐和蛋白酶抑制剂。
1.4 通过离心将裂解的细胞离析为细胞裂解液和细胞残渣。
1.5 取得细胞裂解液，再次离心。
1.6 收集上清液，富集线粒体。
2. 纯化线粒体2.1 使用密度梯度离心法纯化线粒体。
2.2 准备线粒体纯化梯度液：将载有0.3 M 硫酸钾和0.225 M 蔗糖的离心管装满，再用上清液轻轻涂在底部。
2.3 加入适量的上清液，接着轻轻将细胞裂解液小心地倒入离心管上方。
2.4 进行高速离心，使线粒体在离心管中沉淀。
2.5 将沉淀的线粒体收集起来，用缓冲液洗涤。
2.6 用缓冲液重新悬浮线粒体。
3. 测定线粒体膨胀3.1 准备测定线粒体膨胀所需的试剂和设备，包括线粒体悬液、膨胀缓冲液和光度计。
3.2 在膨胀缓冲液中加入试剂，如脂质过氧化物诱导剂等。
3.3 加入线粒体悬液。
3.4 在一定的温度下，如37°C，孵育一段时间。
3.5 使用光度计测定线粒体的吸光度。
线粒体膨胀程度与吸光度强度呈正相关关系。
结果解读通过测定线粒体的吸光度，可以确定线粒体的膨胀程度。
吸光度越高，说明线粒体的膨胀程度越大，细胞内的损伤程度可能越严重。
应用领域纯化线粒体肿胀光度法被广泛应用于细胞生物学和药理学研究。
它可以用于评估药物对线粒体的影响，以及研究细胞损伤和死亡的机制。
此外，线粒体膨胀的评估也可作为相关疾病的诊断指标，如心肌缺血、中风等疾病。
线粒体提取步骤
线粒体提取步骤线粒体的提取步骤制备程序：a.组织匀浆：称取50-200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS冲洗，用剪刀剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。
估计组织块总体积。
加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution。
上下研磨组织20次。
b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。
计数。
每次提取需要2-5 × 107个细胞。
加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内。
用间隙严密的研杵研磨细胞30-40次。
1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。
800 × g 离心 5 min 4 ºC。
细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底,弃去。
2. 收集上清液并转移到新的离心管。
800 × g 离心5 min at 4 ºC。
弃沉淀3. 将上清液转移到新的离心管。
10,000 × g 离心10 min 4 ºC。
离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，可收集用于对照实验。
线粒体沉淀在管底。
4. 洗涤线粒体：清除管内壁粘连的液体和碎片，加入0.2 ml Mito Sdution轻弹管底重悬线粒体沉淀，12,000 × g 离心10 min 4 ºC。
弃上清，线粒体沉淀在管底。
5. 用Mito Sdution或合适后续实验的自备缓冲液重悬线粒体沉淀50 µl/每100 mg组织或100 µl/5 × 107个细胞。
测定蛋白浓度。
立即使用或−70 ºC保存。
注意：1. 为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。
第二是快速。
微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。
第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。
线粒体蛋白提取
线粒体蛋白提取1.线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4)：250mM蔗糖，20mM HEPES，10mM KCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM DTT, 17ug/mL PMSF, 8ug/mL aprotinin, 2ug/mL leupeptin；-20℃保存。
2.步骤：（1）收集5X10E7细胞，并用PBS洗细胞；（2）往细胞沉淀加入2mL上述抽取液，并混匀，可以采用超声或匀浆器方法破膜，程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。
（3）750g，4℃离心5分钟，收集上清，此时沉淀即为细胞膜成分。
（4）13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清，此时沉淀即为线粒体成分。
（5）用100uL列解液重悬沉淀，-80℃保存备用.培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法1.细胞裂解液（pH8.0）的配方：20mM Tris-Cl，1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT,2mM Sodium Vanadate，1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF；配好后分装-20℃保存，其中PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。
2.裂解方法：按1X106细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟, 12,000rpm, 4℃,离心10min, 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后，12000rpm离心5分钟，取上清和预染Marker加样电泳。
或-80℃保存备用。
细胞核蛋白质的提取2009-04-28 21:28一、试剂准备缓冲液A 缓冲液B10mmol/L HEPES-KOH pH7.9 20mmol/L HEPES-KOH pH7.91.5mmol/L MgCL2 1.5mmol/L MgCL210mmol/L KCL 420mmol/L NaCL0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L EDTA0.2mmol/L PMSF 25% Glycerol0.5mmol/L DTT0.2mmol/L PMSF二、操作步骤1．去细胞培养液，用PBS（含0.05mmol/LPMSF）洗两次，用刮板将细胞刮下，计数细胞，收集于适当体积离心管，用少量PBS冲洗平皿一并吸入离心管。
实验三 差速离心法提取线粒体及线粒体的活体染色
三、实验用品
• 材料：小白鼠肝脏 • 器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机， 普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离 心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光 学显微镜， • 试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液
四、实验步骤
1 、 小白鼠断颈致死，用 70% 乙醇消毒外部
后，剖腹取肝。 2、用预冷到近0℃的匀浆介质洗肝，干净滤 纸吸干水分，称重。 3 、将肝剪碎，按每克肝组织加 8ml 匀浆介 质，加入到玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆。 4 、待肝组织基本碎裂后，移出到离心管中， 在冷冻离心机上 4800rpm 离心 15min ， 吸取上清液n 上清液（GB,ER）
（2）
詹 纳 斯 绿 染 色
1、2阳性； 3阴性
沉淀（Mit, Lys等）
（3）对照片（无色）
五、作业
1、 分析实验结果。 2、试比较差速离心法和密度梯度离心法 的异同。
实验二 差速离心法提取线 粒体及线粒体的活体染色
一、实验目的
• 学会差速离心方法及活体染色一般方 法。
二、实验原理
离心力 RCF=1.11910-5r n2 线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染 料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周 围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。 在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料 在詹纳斯绿染液中染色15min以上，才能放 上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接 触）后，线粒体被染色。
5、上清液再在冷冻离心机上11000rpm 离心20min。 6 、弃去上清液，沉淀以适量匀浆介质悬 浮制成线粒体悬浮液，吸1滴于载玻片上， 加1滴詹纳斯绿染色液，染色（室温下） 约20min。 7、加盖玻片，置显微镜下观察。
实验步骤：
取材，制成悬液（组织块、 细胞、细胞核、线粒体等） 4800rpm离心15min 沉淀（组织块、 细胞和细胞核等 上清液
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
线粒体提取
缓冲液A（100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10
g/ml pepstatin A）。
缓冲液B（pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A）。
1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。
2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。
3、匀浆液经4层纱布过滤。
滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（1）。
4、于2,600g 离心15 min（Beckman J2-HS），弃沉淀。
上清取20ul用于细胞色素c活性
测定，记为（2）。
5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。
6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。
从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（3）。
7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml / 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和8 ml/ 1.8 M sucrose。
介质均用缓冲液B配制。
8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。
9、然后以24000rpm离心90 min（SW28 Beckman rotor）。
10、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。
11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。
13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（4）。
14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80℃。