四、线粒体的分离与观察
细胞核和线粒体的分离和观察课件
目录
CONTENTS
• 细胞核和线粒体的基础知识 • 细胞核和线粒体的分离技术 • 细胞核和线粒体的观察方法 • 实验操作注意事项 • 实验结果分析
01
CHAPTER
细胞核和线粒体的基础知重要的亚 细胞结构，由核膜、核仁和染色 质等组成。
细胞核和线粒体的分离效果
通过染色和显微镜观察，可以清晰地看到细胞核和线粒体被成功 分离，没有明显的杂质。
细胞核和线粒体形态特征
分离后的细胞核呈现圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密；线粒体 呈现长条形或杆状，表面有细微的皱褶。
荧光染色效果
通过荧光染色技术，可以观察到细胞核和线粒体分别发出蓝色和绿 色荧光，荧光信号强且均匀。
数据分析
对观察结果进行统计分析 ，得出结论。
实验后的处理
清洗和整理实验器材
实验结果总结
实验结束后，及时清洗和整理实验器 材，确保其完好无损。
对实验结果进行总结，撰写实验报告 ，并进行分析和讨论。
废弃物处理
按照规定处理实验废弃物，避免对环 境和人体造成危害。
05
CHAPTER
实验结果分析
实验结果展示
差速离心法是一种简单、快速和经济 的方法，适用于分离大量细胞。
密度梯度离心法
01
密度梯度离心法是一种 利用连续的密度梯度介 质对细胞进行分离的方 法。
02
在密度梯度离心法中， 细胞悬浮在密度梯度介 质中，然后在离心机中 旋转。
03
由于不同细胞组分的密 度不同，它们在介质中 沉降的速度也不同，从 而实现分离。
电子显微镜观察
总结词
电子显微镜提供了高分辨率的图像，能够更精确地观察细胞核和线粒体的超微结 构。
细胞器分离
(5) 1／15 mol／L磷酸缓冲液 (pH 6.8)： 1／15 mol／L磷酸二氢钾(KH2PO4) 50 mL 1／15 mol／L磷酸氢二钠(Na2HPO4) 50 mL (6) 卡诺(Cornay)固定液： 无水乙醇 6 mL 冰醋酸 1 mL 氯 仿 3 mL (7) 生理盐水
2．器具： 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼 龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高 速离心机。
鼠肝线粒体的分离
【材料 材料】 材料 鼠肝脏或猪肝脏。 【实验用品 实验用品】 实验用品 1．试剂： (1) 0.25 mol／L蔗糖+0.01 mol／L三羟甲基氨基甲烷 (Tris)一盐酸缓冲液(pH 7.4)： 0.1 mol／L三羟甲基氨基甲烷溶液 10 mL 0.1 mol／L盐酸 8.4 mL 加双蒸水到100 mL，再加蔗糖使浓度为0.25 mol／L。 (2) 0.34 mol／L蔗糖+0.01 mol／L Tris一盐酸缓冲液 (pH7.4)，配法同上。
2．差速离心： 将0.34 mol／L蔗糖溶液4.5mL放入离 心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝 匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离 心按下图顺序进行差速离心。
分离细胞核：
鼠肝匀浆700×g离心10 min 沉淀(细胞核及质膜碎片) 上清液(1)
洗涤(0.25 mol／L预冷蔗糖溶液5 mL洗涤2次， 每次1000×g离心15 min。 沉淀(细胞核及质膜碎片) 清(1)合并 上清液(2)→与上
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导编者梁亦龙张继承生物信息学院2004年9月前言细胞是一切生物(包括人类)最基本的结构和功能单位。
生命科学中的各个学科领域，甚至非生命科学的许多学科领域中的学者们，越来越多地投入到对细胞生命现象的研究。
细胞是生命的载体，不理解细胞就不理解生命。
在现代生命科学教学中，不设置细胞生物学课，所培养出来的学生就称不上是完全的生命科学家。
在细胞生物学放学中，实验课不可或缺。
实验课的基本任务是，让学生学习细胞生物学基本技术，使他们具有一定的实验操作技能，并培养他们树立独立设计实验的思考观念和进行科研的基本素质。
我们借鉴兄弟院校的经验编写了这本《细胞生物学实验指导》•，供我院开设的各专业选用。
由于我们主客观条件所限，而且编写时间仓促，肯定会有不少缺点和错误，请提出批评意见，帮助我们不断改进教学。
编者梁亦龙2004年9月目录实验是规则与操作要求 (1)实验一细胞形态及大小的观测 (2)实验二相差和暗视野显微镜的原理、使用及标本观察 (5)实验三荧光显微镜原理及应用 (9)实验四电镜参观 (12)实验五植物细胞骨架的显示及光镜观察 (14)实验六人淋巴细胞染色体标本制作 (15)实验七人淋巴细胞姐妹染色体区分染色 (17)实验八碱性磷酸酶的显示 (19)实验九叶绿体的制备及其对染料的还原 (22)实验十人体细胞核型图的制作 (24)实验十一线粒体的分离及活性测定 (27)实验十二联会复合体的染色与观察 (32)实验十三细胞融合 (33)实验十四死、活细胞鉴别 (39)实验十五细胞固定染色法 (41)实验十六早熟染色体凝集（PCC） (43)实验十七细胞同步化 (46)实验十八动物染色体分带技术 (48)实验十九线粒体的显示 (50)实验二十植物愈伤组织培养以及再分化 (52)实验二十一肿瘤细胞培养实验步骤 (57)实验二十二细胞器的分离 (62)实验二十三石蜡切片的制作 (66)实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。
实验四 线粒体的分离与观察
实验八线粒体的分离与观察实验目的用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。
实验原理线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。
细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
I．鸡肝线粒体的分离实验用品一、材料鸡肝脏二、试剂1. 生理盐水2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。
3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：0.1 mol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10 ml0.1 mol／L盐酸8.4 ml加重蒸水到100 ml加蔗糖到0.25 mol／L。
蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖4. 0.34 mol／L蔗糖＋0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph 7.4）5. 固定液：甲醇-冰醋酸(9：1)6. 姬姆萨染液：Giemsai粉0.5g，甘油33 ml，纯甲醇33 ml。
实验五讲义 线粒体的分离与观察
精品
一、实验目的
1.对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 2.掌握用差速离心技术分离制备线粒 体的方法。
二、实验原理
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能 性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就 要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种 物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织 制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释 放出来。
离心技术概述
离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受 到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离 技术。
离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到 一个向外的力。与角速度和旋转半径有关。
相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相 当于重力加速度的倍数，表示“数字×g”。
离心力g＝1.11×10-5n2r
（二）密度梯度离心
（density gradient centrifugation）
A等速度沉降，B等密度沉降
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度 梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
密度梯度离心法是用密度具有梯度的介质来替换 离心管中的密度均一的介质，使介质分为不同的 层次，浓度的低的在上层，浓度高的在底层。将 细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大 小、形态、密度的颗粒就会以不同的速度向下移 动，集中到不同的区域，可以分别收集。
差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使 较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速 将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来 ，从而使各种亚细胞组分得以分离。
但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心 十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离 得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需 经反复悬浮和离心加以纯化。
细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离
实验二细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法.二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法.细胞组分的分离在等渗溶液〔0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液〕中进行.●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞.●在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体〔混有部分细胞核〕.●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶,洗净搽干后去除叶梗和粗脉,称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中,放入组织捣碎机<间歇>；低速匀浆1min；间歇匀浆.2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中.3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体〔混有部分细胞核〕；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离.5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮.〔浓度不要太高,不利于观察〕➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染料,加盖玻片即可在荧光显微镜下观察.第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.收集沉淀涂片,用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.〔教师演示示X〕第三部分人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察一、实验目的：观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布.二、实验原理：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生改变.詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性的对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态〔即有色状态〕,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基〔即无色状态〕.三、实验步骤：1、取清洁载玻片,滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液；2、用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液中,染色10-15 min；〔作用,染液不可干燥,必要时加滴染液〕；3、盖上盖玻片,置显微镜下观察.四、实验结果：在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜观察,可见扁平状上皮细胞内,核周围的胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即为线粒体.实验作业：3 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布.。
实验四线粒体和液泡系的超活染色与观察
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无 毒害的一种染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些 结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以 致引起细胞死亡。
要想获得体外活体染色成功，我们应注意： （1）保证所取材料的活性。通过控制温度和加入缓冲
液实现。
（2）保证染色剂的状态。可以通过现用现配和棕色试 剂瓶保存来保证染色剂的化学性质不发生变化；用浓度 较低的染色剂来保证对细胞无毒或伤害较小。
⑵ 用双面刀片把小麦幼苗根尖（约1～2cm长）小心切一 纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色 5～10min。
⑶ 吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子 轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。
⑷ 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见 细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡 ，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察 ，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积 增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红 色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分空间，将细胞核挤 到细胞一侧贴近细胞壁处。
（三）材料
人口腔上皮细胞 小麦根尖细胞
四、实验步骤
（一）线粒体的超活染色与观察 1、线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和
数量虽不同物种、不同组织器官和不同的生理 状态而发生变化。 1）人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 ⑴取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板 上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。
小麦根尖液泡系（1）
小麦根尖液泡系（2）
六．实验中的注意事项
1、詹姆斯绿B溶液现用现配，以保持它的充 分氧 化能力。
2、实验中速度要快，以免组织细胞死亡。
4章 线粒体
9nm 9nm
头部
合成ATP
F1
4nm 长 4.5-6 nm
柄部
调节质子通道
OSCP
基片部 质子的通道
6-11.5nm 高5-6nm
F0
基粒 （ATP酶复合体）
ATP 合酶
3. 膜间隙 (intermembrane space)
外膜
嵴 内膜
内膜和外膜之间有一宽约6-8nm 的较小间隙，称为膜间隙 ，又称外 室。 但有时某些部位的内、外膜紧 密接触，没有膜间隙， 膜间隙 为细胞质基质中所合 （外室） 成的蛋白质进入线粒 体的部位;但在呼吸活 跃时，间隙扩大，并充 满无定形液体。液体中 含有一些可溶性酶类、 底物和辅助因子。嵴内 所包围的空间又称为嵴 内隙，与膜间隙相通， 嵴间腔 嵴内腔 实际上是膜间隙的一部分。 （内室）
SP2/O-Ael4骨髓瘤细胞中同心圆状线粒体嵴的 形态结构 (a)SP2/O-Ael4骨髓瘤细胞中同心圆状线粒体嵴 的电镜照片; (b)(a)的模式图解
细胞的功能状态不同，嵴的数量也不同。一般需 能较多的细胞中，线粒体数量较多，嵴的数量也多。 嵴的数量与线粒体氧化活性的强弱程度有关。
内膜表面不光滑，嵴朝向线粒体基质的表面上规 则地排列有许多圆球状颗粒，称为基本颗粒（基粒） 或F1颗粒(F1因子)，由于它具有ATP酶活性，故又称为 F1-ATP 酶。利用磷钨酸做负染色时，在电镜下这种颗 粒清晰可见，它是通过细柄与内膜相连。膜中与 F1 因 子相结合的蛋白质结构称为 F0 因子。因此 F1 和F0 因子 便构成了一个大的蛋白质复合物，称为 F0F1-ATP 酶或 ATP合成酶。 ATP合成酶在氧化磷酸化中起偶联作用， 可将H+梯度势能转换为ATP。
线粒体的分离与鉴定
三、实验用品
1. 材料 昆明种小白鼠 若干只 2. 器材
冷冻高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、200 目尼龙网（通常为铜筛）、玻璃匀浆器、PH计、高压灭 菌锅等。
3. 试剂 ① 0.9%灭菌的生理盐水。 ② 1%詹纳斯绿B染液，用0.9%灭菌的生理盐水配制。
③ 0.25mol/L蔗糖十0.01mo1／L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)： ④ 0.34mol/L蔗糖十0.01mol/L tris-盐酸缓冲液(pH7.4) ⑤ ⑦ 固定液：甲醇：冰醋酸(9:1)
一、实验目的
初步掌握用差速离心法分离大鼠肝细胞线粒体的方 法。 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。
二、实验原理
线粒体(mitochondria)是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的
能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联 磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研 究通常是在离体的线粒体上进行的。
七、作
业
线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行？ 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细 胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。要获得高 活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中 需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项 及改进方法。
分离介质0.25mol/L及0.34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层 有什么作用?
心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降 在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞 核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分 离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散 相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操 作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内唯一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今一直是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或万转/分离心机。
2.组织捣碎机或匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布（尼龙布）、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器（氧极普测试系统）。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl（0.05M，pH7.2）缓冲液。
3.磷酸缓冲液（0.2M，Ph7.2）。
4.提取洗涤液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA（0.001M），TriS-HCl（0.01M，pH7.2）缓冲液。
5.悬浮液（同试剂4，但不加BSA）。
6.反应液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、蔗糖（0.25M）、KCl（10ml，pH7.2）、EDTA（0.2mM）、MgCl2（5mM）、TriS-HCl（10mM，pH7.2）。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素（物理和化学的）作用而失活，特别是膜的完整性极为重要，因为只有完整的线粒体才能进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下（0-4 o C）进行。
[2].要注意分离介质的pH值，pH值应和被采用的材料一致。
[3].捣碎时间要控制得当，或匀浆适度，争取获得更多的完整线粒体。
细胞线粒体分离
细胞线粒体分离在进行细胞线粒体分离实验时，确保实验步骤的准确性和实验环境的无菌性是至关重要的。
以下是一个基本的线粒体分离流程，以及一些重要的注意事项。
实验材料：1. 新鲜的组织或细胞样品2. 预冷的线粒体缓冲液（MB）3. 预冷的分离介质（例如Percoll或Nycodenz）4. 离心管和离心机5. 显微镜和细胞计数器实验步骤：1. 收集新鲜的组织或细胞样品，并用预冷的MB缓冲液冲洗以去除任何残留物。
2. 将组织或细胞样品放入离心管中，并加入足够的预冷MB缓冲液以覆盖样品。
3. 用锋利的刀片将组织或细胞样品切成小块，然后使用研磨器将其研磨成匀浆。
4. 将匀浆通过纱布或棉签过滤，以去除大的颗粒和细胞残骸。
5. 将过滤后的匀浆转移到离心管中，并加入足够的预冷分离介质。
6. 以适当的离心速度离心样品，以分离出线粒体。
7. 使用显微镜和细胞计数器对离心后的样品进行观察和计数，以确保获得了足够的线粒体数量。
8. 将分离出的线粒体用于后续的实验或保存以备后用。
注意事项：1. 在整个实验过程中，要确保使用的所有溶液都是预冷的，以避免线粒体的热损伤。
2. 在切割、研磨和过滤组织样品时，要尽量减少对线粒体的机械损伤。
3. 离心速度和时间要根据实验条件进行调整，以确保最佳的线粒体分离效果。
4. 在使用显微镜和细胞计数器进行观察和计数时，要确保样品的代表性，并避免误差的产生。
5. 实验过程中要避免污染，包括对溶液、器具和操作者的污染。
所有使用的器具都应经过消毒处理，并在无菌环境下操作。
6. 线粒体是细胞内的亚细胞结构，其功能与细胞的能量代谢密切相关。
因此，线粒体分离实验的结果可以反映细胞的生理状态，对于研究细胞的能量代谢、疾病机制等方面具有重要的意义。
7. 线粒体分离实验的难度较大，需要操作者具备较高的实验技能和经验。
因此，在进行实验前，应充分了解实验原理、熟悉操作流程，并严格按照实验步骤进行操作。
8. 在实验过程中，应注意安全问题。
线粒体的提取与观察
线粒体的提取与观察线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时（如电镜和光镜的观察）可采用从组织培养细胞中提取，本实验就是介绍两种材料制备用于光镜观察的线粒体。
一、目的与要求了解提取线粒体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态二、基本原理线粒体具有完整的结构，一定的大小和质量，低温条件下在等渗液中破碎细胞，差速离心后，获得线粒体。
经活性染料Janus green B染色，线粒体呈浅蓝色。
三、实验内容1.线粒体的分离提取2. 鼠肝的匀浆制备3. 线粒体的活体染色四、实验步骤（一）动物组织线粒体的分离，提取与观察显微镜检查：将1％Janus green B溶液按1:1比例加入线粒体悬液中,在室温或水浴中染15~20分钟,用吸管吸取一滴线粒体悬液，滴于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜下进行观察，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。
2.组织培养细胞的线粒体的提取与观察（三）操作中应该注意的问题1.整个操作过程为保证线粒体的完整，应尽量使操作时的环境如温度（0—4℃），pH (7.0左右)保持恒定，同时尽可能短操作时间。
2.组培细胞消化时要特别小心，防止损失或反复。
（损失指细胞脱落到消化液中）。
3.匀浆时，所用的介质一定是等渗缓冲液，常用的有0.25 mol/L蔗糖溶液或生理盐水代替Hank’s液4.匀浆次数依照匀浆器的松紧而定，次数过少，细胞破损不完全，就会影响线粒体产量。
5.所以取2/3上清夜用来制备线粒体是为防止细胞碎片过多影响观察。
细胞核及线粒体的分级分离实验报告
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实验五 线粒体的分离与观察
1.试剂 1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH7.4），3 mmol/L EDTA， 0.75 mg/ml BSA（牛血清蛋白）。 2）保存液：0.3 mol/L 甘露醇（pH7.4）。 3）20% NaClO（次氯酸钠）溶液。 4）1% 詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 2.器材 剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微镜， 冷冻高速离心机等。
线粒体干物质的主要成分是蛋白质。蛋白质在室温和高 温环境下都难以长期保存。低温环境能有效保持蛋白质 的稳定性，包括结构和功能。温度过高，线粒体里的蛋 白可能变性而丧失活性等。温度过低，虽然能有效保存 蛋白质，但是低温导致膜结构脆性增大，提取过程中的 物理机械剪切力可能使线粒体破损。完整得提取线粒体 要注意对线粒体的各个结构的保护。
涂片过程：
五、实验结果
光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或 哑铃状。
五、实验报告
实验目的 实验用品 实验原理 实验方法 思考题
六、思考题
1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行 ？ 2.绘制玉米黄化苗的线粒体装片的观察结果,根据你 的实验结果,分析所分离的线粒体的纯度如何?
四、玉米线粒体及细胞核的分离 从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能 研究外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核 外基因――线粒体DNA等目的。 分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差数 离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L 甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去 后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。 牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为 竞争性底物削弱蛋白酶的作用。
（二）密度梯度离心
（density gradient centrifugation）
细胞学实验——精选推荐
目 录1.1.细胞生物学实验细胞生物学实验2.2.实验一实验一实验一 细胞膜的通透性观察细胞膜的通透性观察3.3.实验二实验二实验二 植物细胞骨架的观察植物细胞骨架的观察4.4.实验三实验三实验三 线粒体的超活染色与观察线粒体的超活染色与观察5.5.实验四实验四实验四 叶绿体的分离与观察叶绿体的分离与观察6.6.实验五实验五实验五 线粒体的分离与观察线粒体的分离与观察7.7.实验六实验六实验六 酸性磷酸酶的显示方法酸性磷酸酶的显示方法细胞生物学实验细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业基础课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的发展。
目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或基础理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了基础。
本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向全院本科生进行讲授。
实验一实验一 细胞膜的通透性观察细胞膜的通透性观察一、实验目的1.1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
2.2.了解溶血现象及其发生机制。
了解溶血现象及其发生机制。
二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。
它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。
各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。
渗透作用是细胞膜的主要功能之一。
将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。
实验二 鼠肝细胞核及线粒体提取和显微观察
实验二线粒体差速离心法分离技术细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心方法，可将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)是在低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取。
[实验要求]1．了解并掌握差速离心法分离技术及原理。
2．熟悉线粒体的Janus green B染色方法，并做出分析。
[实验原理]差速分离由低速到高速离心使细胞内各种组分逐渐沉降。
先用低速离心使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心才能不断纯化。
詹纳斯绿(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜。
詹纳斯绿解离后带有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上。
内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈现蓝绿色。
詹纳斯绿B也可对活细胞进行染色，在显微镜下可观察到细胞内的线粒体因具有细胞色素氧化酶系统，它可使染料始终处于氧化状态呈蓝绿色，而在细胞质中的染料被还原呈无色。
荧光显微镜观察线粒体融合和裂变
荧光显微镜观察线粒体融合和裂变荧光显微镜下观察线粒体融合和裂变线粒体是存在于大多数真核细胞中的细胞器，负责能量产生和细胞凋亡等重要功能。
它们具有动态形态，不断融合和裂变，以维持细胞健康和适应环境变化。
荧光显微镜技术为研究线粒体融合和裂变过程提供了宝贵的工具。
荧光标记为了在荧光显微镜下可视化线粒体，需要对它们进行荧光标记。
常用的标记方法包括使用线粒体靶向的荧光染料，如米托追踪红(MitoTracker Red) 或透肌红 (Rhodamine 123)。
这些染料选择性地积累在线粒体基质中，发出荧光信号，使研究人员能够追踪个体线粒体的运动和形态变化。
荧光显微镜成像荧光显微镜利用荧光激发和发射的原理成像荧光标记的线粒体。
光源发射特定波长的光，被荧光染料吸收。
激发的染料分子随后发射出更长波长的光，可被显微镜检测器捕捉。
通过调节激发波长和发射滤光片，可以针对特定荧光染料进行优化成像。
线粒体融合线粒体融合是两个或多个线粒体融合形成单个线粒体。
这一过程对于维持线粒体功能和细胞健康至关重要。
荧光显微镜可用于动态监测线粒体融合。
通过时间推移成像，研究人员可以观察标记的线粒体逐渐接近、接触和融合，形成一个更大的线粒体。
线粒体裂变线粒体裂变是单个线粒体分裂成两个或多个较小线粒体。
这一过程对于线粒体分布、质量控制和细胞凋亡至关重要。
荧光显微镜可用于监测线粒体裂变。
通过时间推移成像，研究人员可以观察标记的线粒体逐渐变长、变细，最终在中央区域裂开，形成两个独立的线粒体。
应用荧光显微镜观察线粒体融合和裂变的应用广泛，包括：研究线粒体动力学与细胞功能之间的关系确定影响线粒体融合和裂变的因素探索线粒体动力学在疾病中的作用，例如神经退行性疾病和心血管疾病开发靶向线粒体融合和裂变的治疗策略结论荧光显微镜是研究线粒体融合和裂变的宝贵工具。
通过使用荧光标记和特定的成像技术，研究人员可以动态监测这些过程，深入了解线粒体动力学在细胞健康和疾病中的作用。
医学专题细胞核和线粒体的分离和观察
（二）高速离心分离提取线粒体
▪ 1、将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯 (shāobēi)中取出，配平后，以17000g离心20分钟，弃上 清，留取沉淀物。
▪ （本实验用12000rpm,非冷冻离心）
▪ 2、加入蔗糖-Tris-Hcl 1ml，用吸管吹打成悬液，以
17000g离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉 淀物，加入0.1ml蔗糖-Tris-Hcl氯化钙溶液混匀成悬液 (可用牙签)。
第十六页，共二十页。
▪ 3、取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于 干净(gānjìng)载玻片上(分别标记④、⑤涂片)， 各滴一滴1％詹纳斯绿b染液染20分钟, 盖 片观察。
▪ 4、油镜观察。
第十七页，共二十页。
注意事项
▪ 1、各步骤加入的溶液(róngyè)的量需根据离心管的大小自行 调整。
▪ 2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧 化。
一、实验 目的 (shíyàn)
1. 初步了解细胞内各种成分的分离方法 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分 离方法 3、对分离得到(dé dào)的细胞核及线粒体进行 活性鉴定。
第二页，共二十页。
二、实验 原理 (shíyàn)
▪ 细胞器分离(fēnlí)基本步骤
细胞(xìbāo)破 碎
分离、纯化
第十九页，共二十页。
内容 总结 (nèiróng)
细胞核与线粒体的分级分离。2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法。从低速到 高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。8、将①、②、 ③涂片(tú piàn)用l％甲苯胺兰（或亚甲基蓝）染色后盖片即可观察。1、各步骤加入的溶液的量 需根据离心管的大小自行调整。2、线粒体的染色必须先染色20分钟后盖盖片，以便充分氧化。 2、本实验步骤有哪些可以改进的地方
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五、实验报告
1. 分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的 细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)
2. 描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体 的纯度如何?
六、实验建议
1.注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长， 以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。 2.将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀 浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。 3.姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。
(1) 细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹 干，滴1滴Gimesa染液染色10min。自来水冲洗，干燥后，镜检。 结果：细胞核呈紫红色，上面附着的少量胞质及浅蓝色碎片。 (2) 线粒体：取线粒体沉淀1 滴涂片，滴加1%詹纳斯绿B 染液染20min，覆上 盖玻片，镜检。 结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
实验四 线粒体的分离与观察
一、实验目的
1. 初步掌握用差速离心法分离鸡肝脏细胞线粒体的方法。 2. 学习并掌握高速离心机和匀浆器的使用方法。
二、实验原理
线粒体是真核细胞中产生能量的重要细胞器，对线粒体结构与功能的研究通 常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体时，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心法进行分离。 在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），大小不一的颗粒沉降速度取决于 它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织 匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。 依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心 管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更 轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度 上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚 集，有利于分离。
（细胞核）
↓ 上清液2(与上清液1合并)
分 离心10min ↓ ↓ ↓ 沉淀 上清液（弃去）
（线粒体）
↓ 洗涤 (加 0.25mol/L预冷蔗糖溶液 10ml混匀, 11000r/min 离心10min） ↓ ↓ ↓ 沉淀（涂片③自然干燥） 上清液
（线粒体）
3. 分离物鉴定
四、实验操作
1.制备鸡肝细胞匀浆: 取出肝脏，用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织 2g，放入研钵内，剪碎，用预冷的0.25mol/L 缓冲蔗糖溶液洗涤两次后，按每克 肝加9ml冷的0.25mol/L 缓冲蔗糖溶液（分数次添加），将肝组织研磨成匀浆，用 8层纱布过滤备用。 2.离心：先将2ml 0.34mol/L 缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入 2ml 肝匀浆，使其覆盖于上层，标注记号，配平后对称放入离心机中进行差速离心。 差速离心提取鸡肝线粒体流程如下图：
三、实验用品
1.材料：鸡肝脏 2.器材：高速离心机、解剖刀剪、烧杯、冰浴、漏斗、纱布、匀浆器、高压灭菌锅 3.试剂：0.9%灭菌的生理盐水、1%詹纳斯绿B 染液、 0.25mol/L 蔗糖十0.01mo1/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)、0.34mol/L 蔗糖十0.01mol/LTris-盐酸缓冲液 (pH7.4)、固定液、姬姆萨染液、磷酸盐缓冲液(pH6.8)
分离细胞核
鸡肝2克匀浆 ↓ 匀浆过滤 ↓ 滤液 ↓ 将滤液2ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上 ↓ 1200r/min 离心10min ↓ ↓ ↓ 沉淀（涂片①自然干燥） 上清液1 （细胞核及碎片） ↓ 洗涤（加0.25mol/L预冷蔗糖溶液 2ml 混匀，2500r/min 离心15min） ↓ ↓ 沉淀（涂片②自然干燥）