甲基化的分析检测

4.2基于水溶性阳离子共轭聚合物的DNA甲基化分析

中国科学院研究人员合作, 发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA
甲基化分析方法.
通过荧光共振能量转移技术(FRET)研究了质粒和人肿瘤细胞p16 基因启动 子区特异CpG 位点的甲基化状态(原理见图1). 该技术具有较高的灵敏度和特 异性,引物无需荧光标记, 检测在均相溶液中进行, 无需分离、纯化手段, 而且 与高通量分析兼容, 在癌症临床诊断上具有潜在的应用价值。 共轭聚合物具有强的光捕获能力, 具有倍增光学响应性, 可用来放大荧光传 感信号, 为生物传感器的发展提供了新的传感模式.
DNA甲基化与肿瘤标志物的检测
目录
Байду номын сангаас
1. 肿瘤标志物 2. DNA甲基化 3. DNA甲基化与肿瘤的关系 4. DNA甲基化的检测
1.肿瘤标志物
1.1 癌症，亦称恶性肿瘤，由控制细胞生长增殖机制失
常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入
周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身 体其他部分。
2.2 DNA甲基化
DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形
式，是在不改变DNA代码的前提下，改变个体的遗传表现， 其是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会将甲基添加到DNA 分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲 基化方式可见于所有脊椎动物。
目前即使是最先进的检查技术和手段（X光片、超声、CT、MRI或PETCT等物理检查）也只能发现直径0.5厘米以上的肿块。当无症状的肿 块渐渐长到为自身所觉察的大小时，部分肿瘤已经处于中晚期，有的 肿瘤已经发生了转移，很多病人已经丧失了最佳的治疗时期。 目前肿瘤标志物检测技术被认为是早期发现无症状微灶肿瘤的唯一途 径。目前除了血液，体液(如尿液、胸腹水等)、组织细胞等也可作为 肿瘤标志物的检测对象。
总结
1.DNA甲基化的机理有待于进一步研究。特别人类的DNA 非常复杂。 2.DNA甲基化的分析水平有待于进一步提高。 理想的分析方法是：成本低，简单，快速，特异性好。
终极目标：开发出甲基化检测特异性好的试剂盒或者试纸
在PCR 反应时，设计两套不同的引物对： 一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化 DNA 链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检 测位点发生了甲基化；
另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA
链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点 没有甲基化。 对引物的选择和设计要求非常高。
酶切法：
被当做肿瘤的生物学指标，例如膀胱癌和肺癌，应用灵敏
的PCR检测技术可以检测到启动子的改变，从而提供肿瘤 的阳性信息。 DNA甲基化可能会成为一种非常有前途的肿瘤早期诊断标 志。
2. DNA甲基化
2.1 DNA，又称脱氧核糖核酸。DNA可组成遗传指令，以引导生 物发育与生命机能运作。带有遗传讯息的DNA片段称为基因。
肿瘤类型
乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝 癌 乳腺癌、卵巢癌 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌 肺癌 乳腺癌 、甲状腺癌、胃癌 乳腺癌、前列腺癌 前列腺癌、乳腺癌、肾癌 结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌 肺癌、脑瘤 非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌 肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、鼻咽癌 成视网膜细胞瘤、少突神经胶质(细胞)瘤 肾细胞癌
1.3 肿瘤标志物(tumor markers，TM)
肿瘤标志物指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释 放，或由机体对肿瘤细胞反应而产生的标志肿瘤存在和生长的一类物质。 主要包括蛋白质、激素、酶、多胺、癌基因产物等。这些物质在正 常成人中不存在或者是在癌症患者中出现的水平显著高于正常人。
对甲基化敏感程度不同的一对同裂酶 HpaII 和 MspI。
这对酶可识别CCGG 位点，但对甲基化的敏感程度不同： HpaII对内、外侧胞嘧啶甲基化敏感，MspI只对外侧胞
嘧啶甲基化敏感，而绝大多数基因组甲基化发生在胞
嘧啶内侧，因此可以用 MspI 来识别 CCGG，用 HpaII 来鉴别这些序列是否甲基化。
4.3
4.4 单分子纳米孔测序
单分子纳米孔测序仪能直接分辨出甲
基化胞嘧啶和未修饰的胞嘧啶。
当核酸外切酶消化单链DNA 后，单个 碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互
作用，并阻碍了穿过孔中的电流。
每个碱基ATGC 以及甲基胞嘧啶都有 自己特有的电流振幅，因此很容易转化成
DNA 序列。纳米孔技术就能直接读出这 5甲基胞嘧啶。
4. DNA甲基化的分析检测
4.1 传统的分析方法 DNA 甲基化的检测大体分为两个步骤： a．待检测样品的前期处理； b．目标序列的定位和甲基化状态的量化。
待检测样品的前期处理方法主要包括三大类：
a．亚硫酸氢钠法——亚硫酸氢钠把非甲基化的胞嘧啶转
化为尿嘧啶，而保持甲基化的胞嘧啶不变，以此实现两类
根据2012中国肿瘤登记年报据 统计，我国每年新发癌症病例 312万，因癌症死亡270万。
2020年全球癌症新发病例将达
到2000万，因癌症死亡1200万。
1.2 癌症的检测分析
世界卫生组织指出，如果能早期诊断并及时治疗，90%～95%的肿瘤是 可以治愈的。而早发现是解决癌症防与治的关键中的关键。”
抑癌基因的沉默， 导致肿瘤的发生。
癌症的程度分级
治疗癌症的药物
常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用
基因
APC BRCA1 CDKN2A/p16 DAPK1 E-cadherin ER GSTP1 hMLH1 MGMT P15 RASSF1A Rb VHL
基因沉默对肿瘤的意义
对细胞增殖、迁移、粘附、骨架重组及染色质稳定 性失去调节作用 与DNA 修复与转录激活有关 周期素依赖性蛋白激酶抑制剂 钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制 增强增殖、侵袭与转移 激素抵抗 失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用 缺损DNA错配修复,基因点突变 p53-相关基因，与DNA 修复及耐药性有关 细胞的过度激活与增殖 失去了对G1/S负调控抑制作用 不能抑制DNA复制和细胞分裂必需的基因转录 错误的降解RNA结合蛋白质，改变RNA稳定性
的分离；
b．限制性内切酶法——限制性内切酶可以切割非甲基化 的位点，而甲基化以后的识别位点将被保留；
c．利用特定抗体对甲基化的胞嘧啶进行免疫沉淀反应．
前期处理实现了甲基化和非甲基化的胞嘧啶分离以后， 可以对分离出的甲基化 DNA 片段进行基因芯片杂交
或者大规模深度测序，实现高通量的检测。
亚硫酸氢钠-PCR 法：
相连的磷酸酯键（p）。哺乳类基因中的启动子上，含有
约40%的CpG岛（人类约70%）。一般CpG岛的长度约 300到3000个碱基对（bp）。
常用的正式定义是指一个至少含有200bp的区域，其中
GC所占比例超过50%，
3. DNA甲基化与癌症的关系
CpG岛的甲基化
DNA甲基化
癌症的早期诊断
异常升高，造成
在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成
熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生于CpG双核苷酸 （CpG dinucleotide）部位
S -腺苷甲硫氨酸
5-甲基胞嘧啶 5-mC
2.3 CpG岛
CpG岛（CpG islands）是指DNA上一个区域，此区域含 有大量相联的胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G），以及使两者
缩写: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin-dependent kinase 2A; DAPK1, death-associated protein kinase 1; ER, estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase Pi 1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methyltransferase; RASSF1A, Ras association domain family member 1; Rb, retinoblastoma; VHL, von Hippel-Lindau; GIT, gastrointestinal tract; NHL, non-Hodgkin’s lymphoma.
理想的肿瘤标志物，应对肿瘤的检出敏感性和特异性达到
100%
检测呈阳性≠肿瘤，仅仅是一种提示和信号，提示
检测者属于高危人群。
检测呈阴性≠不是肿瘤，不一定就能排除肿瘤
原因：产生肿瘤标志的肿瘤细胞数目少；细胞或细胞表面被 封闭；机体体液中一些抗体与肿瘤标志形成免疫复合物；肿瘤组 织本身血液循环差等。
异常的DNA甲基化是癌症的特征。许多CpG岛甲基化事件已