正交实验优选白毛夏枯草中木犀草素的提取工艺

( 1. D epartm ent o f Pha rm acy, D ong feng H osp ita l A ffiliated to Y unyang M edical College, Sh iyan H ube i
442008; 2. D rug T est College o f Yunyang M ed ica l Co llege, Sh iyan Hube i 442000)
[ 2 ] 马志平, 黄榕. 筋骨草有效部位黄酮类粗品的保肝试验 [ J ]. 海峡 药学, 2002, 14 ( 5) : 40.
[ 3 ]邵鹏, 李明静, 赵文善, 等. 苦蒿中木犀草素的 反相高效液相 色谱 测定方法研究 [ J] . 中药材, 2006, 29( 3 ): 245.
[ 4 ] 尹海波, 康廷国, 王冰, 等. 正交实验法优选葎草的提取工 艺 [ J] . 中药材, 2005, 28 ( 12) : 1 112. (收稿日期: 2010- 04- 21)
4. 精密度实验: 吸取浓度为 4. 4 g m L- 1木犀 草素对照品溶液 20 L, 按上述色谱条件, 重复进样 6次, 测得平均峰面积 RSD 为 1. 02% , 表明仪器精 密度良好。
5. 重复性实验: 取同一份样品 5份, 按供试品溶 液制备项下方法制备供试 品溶液, 测定峰面积, 结 果 RSD 为 2. 16% 。
K ey word s! O rthogonal D esign; Luteo lin; A juga D ecumbens Thunb; Extrac tion P rocess
白毛夏枯草为唇形科 植物筋骨草属金疮 小草 ( A juga decum bens Thunb. )的全草, 主要分布在秦岭 以南各省区。白毛夏枯草性味苦寒, 民间主要用于 止咳化痰、清热、凉血、消肿、解毒、腹泻、肝炎、疔毒 疖肿、外伤出血等 [ 1] 。现代药理研 究证明, 白 毛夏 枯草具有保肝利胆, 镇咳、祛痰、平喘等活性 [ 2] 。其 主要有效成分为黄酮, 而木犀草素是白毛夏枯草中 含量较高且有明显保肝利 胆和止咳平喘作用 的成 分之一。近年来有关白毛夏枯 草药材的研究 报道 不多, 未见有效成分提取工艺的报道。
6A 紫外检测器; N 2000色谱工作站; SK5200H 超声 波清洗机 (上 海科导超声仪器有限 公司 ) ; AEU200 电子分析天平 ( 日本岛津 ) ; RE - 5299型旋转蒸发 仪 ( 上海亚荣生化仪器厂 ); DZF - 1B型真空干燥箱 (上海跃进医疗器械厂 ) 。
2. 试药: 木犀草素对照品 ( 供含量测定用, 中国 药品生物检定所, 批号: 111520- 200201); 白毛夏枯 草购于湖北清大中药饮片有限公司, 经湖北中医学 院药学院中药鉴定教研室詹亚华教授 鉴定为白毛 夏枯草; 乙腈为色谱纯, 其他试剂均为分析纯。
3. 标准曲线和线性范围考察: 精密吸取对照品 储备溶液 2. 0 m L 至 10 mL 量瓶中, 以 甲醇定容得 44. 0 g m L- 1 的对照品溶液, 取上述对照品溶液 0. 25, 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0, 3. 0 mL 各置 10 mL 量瓶 中, 分别以甲醇定容, 摇匀, 各精密吸取 20 L 注入 液相色谱仪, 按上述色谱条件测定峰面积。以峰面 积对浓 度进 行 线性 回 归, 得到 回 归方 程: Y = 105 148C - 570 90, r = 0. 999 8, 表明木犀草素在 1. 1~ 13. 2 g mL- 1范围内线性关系良好。
C(次 ) 1 2 3
D( h) 0. 5 1. 0 1. 5
2. 正交试验及结果: 取白毛夏枯 草 10 g, 按 L9
( 34 ) 正交表设计方案进行实验, 以测定的白毛夏枯 草中木犀草素含量为指标, 结果见表 2。
试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
K1 K2 K3 R
表 2 正交实验设计及结果
6. 稳定性实验: 取同一份供试品溶液 20 L, 分 别在 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 h进样, 测得平均峰面积 RSD 为 1. 21% , 表明处理后的供试品溶液在 10 h内稳定 性良好。
7. 加样回收率实验: 精密称取已知含量的白毛 夏枯草约 5 g, 平行 6份, 分为高、中、低三组, 分别在 每组样品中加入木犀草素对照品溶液适量, 按供试 品溶液制备项下方法制备供试品溶液, 在前述色谱 条件下测定, 计算加样回收率。结果平均回收率为 99. 55% , RSD 为 1. 27% 。
世界中西医结合杂志 2010年第 5卷第 6期 W orld Journal of Integrated Tradit ional and W estern M edicine 2010, V ol 5, N o 6
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60 ∃ 干燥至恒重, 粉碎, 过 40目筛, 精密称取 10 g 置烧瓶中, 用提取溶剂浸泡 0. 5 h后, 按正交试验项 进行回流提取, 提取液过滤后减压浓缩, 用 60% 乙 醇定容至 100 mL 量瓶中, 精密吸取样品溶液适量, 用流动相溶解, 超声混匀, 过 0. 45 m 微孔滤膜, 各 取 20 L 分别进样 3次, 记录峰面积, 用面积外标法 计算木犀草素的含量。
方法与结果
1. 色谱条件: 色谱柱: K rom asil- C18 ( 250 ∀ 4. 6, 5 m ); 流动相: 乙腈 #0. 4% 磷酸水 ( 25#75); 检测波 长: 350 nm; 流速: 0. 8 mL /m in; 柱温: 30∃ ; 进样量: 20 L。
2. 溶液的制备: % 对照品溶液的制备: 取经五氧 化二磷减压干燥器中干燥 36 h的木犀草素对照品 适量, 精密称定, 加甲醇制成 0. 22 m g /mL 的对照品 储备液。 & 供试品溶液的制备: 白毛夏枯草药材于
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药物研究
正交实验优选白毛夏枯草中木犀草素的提取工艺
陈富超 1 李鹏 1 方宝霞 1 王亚文 2 狄书萌 2 陈茜 2
A bstrac t! Ob jec tive T o optim ize the best extrac tion process of luteo lin from A juga D ecum bens Thunb. M ethod s H PLC w as used to determ ine the con tent o f luteo lin ex tracted from A juga D ecum bens Thunb; the orthogona l design was applied to observe the im pacts o f ethano l concentra tion, so lvent amount and extraction frequency and tim e on the extraction o f luteolin from A juga D ecumbens T hunb. R esu lts The best extraction process of luteolin from A juga Decumbens T hunb: 60% ethano,l 10 times solven t, ex traction fo r 3 tim es, 0. 5 h each tim e. Con clu sion Th is process is stab le and good in repeatab ility, and it can provide the ev idence in a furthe r resea rch o f A jug a D ecum bens T hunb.
摘要 ! 目的 用正交实验优选白 毛夏枯 中木犀 草素的 最佳提 取工艺。方 法 用 高效液 相色 谱法测定白毛夏枯草中木犀草素的含量; 采用正交试验法 , 考察 乙醇浓 度、溶 剂用量、提取 次数、提取 时间对白毛夏枯草中木犀草素提取量的 影响。结 果 白 毛夏枯 草中木 犀草素 的最佳提 取工艺 为 10 倍量的 60% 乙醇回流提取 3次, 每次 0. 5 h。结论 该工艺稳定, 重复性好, 可以为白毛夏枯草的进一 步研究提供依据。
A
B
C
D 木犀草素含量 /%
1
1
1
1
0. 59
1
2
2
2
1
3
3
3
0. 97 0. 88
2
1
2
3
2
2
3
1
2
3123132
0. 75 1. 06 0. 66 0. 65
3
2
1
3
3
3
2
1
0. 49 0. 78
2. 44 1. 98 1. 75 2. 43 2. 47 2. 52 2. 50 2. 28 1. 92 2. 32 2. 59 2. 12
3. 工艺验证性试验: 为考察上述优选提取工艺 的稳定性, 按该工艺条件进行重复试验 3次, 测定白 毛夏枯草中木犀草素的平均含量为 1. 05% , RSD 为 1. 56% 。表明本实验制定的工艺路线稳定可靠。
讨论
木犀草素在植物中多以糖苷的形式存在 [ 3- 4] , 为了准确测定白毛夏枯草中木犀草素的含量, 我们 对其不同水解酸度及不同水解时间进行了考察, 结 果发现, 提取物水解前后木犀草素含量的保留值和 峰面积均未见明显变化, 由此可以判定提取物中木 犀草素几乎全部以游离苷元的形式存在。
关键词 ! 正交试验; 木犀草素; 白毛夏枯草; 提取工艺