石蜡切片法透明透蜡包埋
石蜡切片法
如需过夜，应停留在70%酒精中。
4. 脱水的注意事项
脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分； 在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏； 在低浓度酒精中，每级停留时间不宜太长，防止材料解体； 在高浓度酒精中，每级停留的时间也不宜太长，防止材料变脆； 脱水必须彻底，否则不易透明。
从取材开始，到制成切片标本为止，其间必须经过以下各主要 步骤： 一、取材 三、洗涤 二、固定 四、脱水
五、透明
七、切片 九、染色
六、透入与包埋
八、贴片 十、封藏
实验十七 石蜡切片法（一）取材、固定、洗涤、脱水 、透明、透蜡、包埋
一、实验目的 1.理解取材、固定、洗涤、脱水等各步骤的基本原 理。
2.了解取材、固定、洗涤、脱水等各步骤的注意事 项。
1. 取材的注意事项： 材料应新鲜； 动作要迅速； 取病理材料时，应加对照。
2. 固定的注意事项 固定液以新配为好 ；
固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定；
材料固定完毕，保存于加盖的容器，贴上标签。
3.洗涤：洗涤是洗去渗入细胞内部的固定液。因材
料中的固定液有的会妨碍染色；有的会发生沉淀或 结晶，影响观察；有的会继续作用，使材料变坏等。
三、实验步骤
（一）切片 切片前的准备工作 （ 1 ）石蜡块的固着：先将蜡块用刀片切成方形或长 方形，组织四周留下2—3mm宽的石蜡。点燃酒精灯， 然后用烤热的蜡铲放在台木和蜡块之间，利用蜡铲的 温度熔化两者的蜡，把蜡块粘附在台木上。 （2 ）整修：用单面刀片将蜡块四周修整平行。
4.脱水：材料经洗涤后含有大量的水分，必须用脱水剂 脱尽里面的水分，以利于材料的透明和制片的保存。 因为水分会使材料分解，而且透明剂与水是不相混合 的，只有在完全无水的情况下，透明剂才能完全透入。
实验六 石蜡切片法1
四、实验结果
包埋后的石蜡快应为均匀的半透明状，蜡块中没有 气泡。
包埋材料摆放的位置是否符合要求？
修块效果：每个蜡边与材料平行，蜡边的上下左右摇 平行。
切片效果：得到厚薄均匀的蜡带，蜡带无破损。 展片效果：展片后蜡带或蜡片平整，无气泡、粘附牢 固，蜡带略呈透明状，后续制片不易脱落。
五、作业
实验完毕，每人交包埋块一个，在纸盒上写
上材料名称及自己的姓名和日期；
实验完毕，每人交玻片两张，用铅笔在载玻
片上写上材料名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
苦味酸液（波茵氏液）
甲液： 1％铬酸 10％醋酸 乙液： 甲醛 苦味酸饱和水溶液 50ml 20ml 25ml 75ml
包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
实验六 石蜡切片法
—— 包埋、切片和贴片
石蜡切片法
石蜡切片法是显微制片技术中最常用的一种方法，除了
藻类、菌类、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既 可制成较薄的切片，使材料各部分都清晰可见，同时也
可制成连续切片，观察材料的动态发生及层次，所以，
它在显微制片技术中占有非常重要的地位，必须掌握， 同时也是进行透射电镜观察超薄切片的基础。
病理组织切片制作技术
病理组织切片制作技术病理组织切片制作技术病理组织切片常用的制作方法有三种。
即石蜡切片法，冰冻切片法和火棉胶切片法。
以石蜡切片法为代表，切片的基本制作过程是：组织取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→组织包埋→组织切片→展片附贴→切片脱蜡→染色→脱水→染片透明→封固。
以上基本过程是互相联系的，任何一环节出现问题，都将使整个切片制作归于失败。
因此应细致、耐心、认真负责，并事先做好计划安排。
一、取材采取病料，要刀剪锐利，剪切时不可挤压，扯拉病料，以防人为损伤。
切取的工具要清洁。
采取病料越新鲜越好，一般不超过死后24小时。
应选择病变部与可疑病变部切取，切取时要由表及里，有浅入深并包括周围正常组织一部分。
特殊病料应根据器官的结构特点切取。
管状，囊状和皮肤组织应注意垂直切取（横切）。
带有薄膜的组织，要防止切时薄膜分离和脱落。
切取组织块大小，以1.5×1.5×0.3厘米为宜，最厚不宜超过0.5厘米。
组织块病变一面应平整光滑，另一面可不平整，以便包埋时辨认。
切取后，放入事先准备好的装有固定液的磨口玻璃广口瓶中，并做好标记。
二、固定固定的目的是迅速将组织细胞杀死，使细胞中的蛋白质，糖，脂肪等凝固，从而保持与活组织相似的结构状态。
材料取下后，应迅速固定。
固定液数量应为病理组织块的5到20倍。
由于一般把组织块浸入固定液后数小时，固定液渗入组织液的深度只达2到3厘米。
因此，可以放置冰箱内固定，使组织内酶失去作用，细菌也能停止滋生。
最常用的固定液是10%的福尔马林溶液：使用时，用40%的甲醛饱和水溶液10毫升，加水90毫升配成。
三、冲洗固定后的组织块，应将固定液洗去。
一般均用流水（自来水）冲洗12到24小时左右。
及时冲洗尚有停止固定的作用，防止固定过度，有利于制片染色。
冲洗时如不方便用流水冲洗，也可用较大容器盛装水浸洗，每隔相当时间换水一次。
整个浸洗时间比流水冲洗应稍长一些。
酒精固定的组织材料不需冲洗。
石蜡切片法
取材 固定 浸洗（冲洗） 脱水 透明 浸蜡（透蜡） 包埋
八、 切片 九、 展片和贴片（裱片） 十、 烤片 十一、 染色 十二、 封固（封片） 十三、 贴标签
一、取材
1、用锐利刀、剪剪切组织块，不可来回切割和 用力挤、压，以免损伤组织。 2、组织块大小一般为5×5×2mm。 3、切好的组织块经生理盐水清洗后可用牙签
十、 烤片 1、展片时是利用水使切片展平，但载玻片 与蜡片之间尚留有部分水分，烤干便是将水分 通过温箱加热后除去，使组织在脱蜡后依然能 够粘贴在载玻片上。若水分未烤干，则脱蜡时 组织会脱落。 2、烤干时的温度<60℃，一般以50℃较为 适当；也可置37℃温箱内烤干（约12~24hr，烤 干后蜡片在玻片上呈透明状）。烤干的时间， 以底烤去水分为原则。
四、切片发生严重皱纹： （1）蜡太软、室温过高→用冰块冰一下再切； （2）切片刀不锋利→磨刀； （3）刀的切削角过小→切刀片仅能在蜡块切削面上浮切 →改变切削角 五、蜡片裂纹： （1）切片刀口缺口刀纹； （2）刀刃不干净→干布擦； （3）蜡块中具有坚硬杂质或尘埃：石蜡过滤及修块时用
刀削去各个方面的表面蜡（纸屑）。
十三、 贴标签 切片封后，在切片的右侧贴上标签， 平放于无灰尘或放在左右的温箱中烤几天 ，待树胶干固后便可使用。 如制成的切片上，树胶过多而溢出盖 片，则可候其完全干固后，用刀片轻轻刮 去，再用纸蘸二甲苯少许将胶擦净。
七、包埋 1、目的：使组织与石蜡在硬度上适配， 以利于切片。 2、硬蜡包埋温度65℃。 3、包埋操作要快，材料吸、夹入石蜡后 轻吹使蜡表面凝结成薄膜状，即可将 其没入水中使快速、均匀、完全凝固
八、切片 1、单面刀片修整蜡块，长：宽约3：2，长边与 刀刃平行。 2、木块上先熔上一点蜡，再用烫蜡铲将蜡块牢固 地粘在木块上；之后沿蜡块四周用烧热的解剖 针烫几下，使蜡块粘牢。 3、安装，刀口与蜡块的角度<100。 4、切片：5~8m；左手用毛笔托住蜡带， 右手不断摇动切片机，获连续切片。 5、切片前，将蜡块置冰箱冷藏一下； 较硬、难切的材料，可将蜡块在甘油：50%酒 精=1：1液中半浸泡数天再进行切片。
实验八石蜡切片法一
盐酸、蛋清、甘油。 • 3、材料 • 各类你感兴趣的固定标本。
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4
四、实验步骤
• 1、取材 • 2、固定 • 3、漂洗 • 4、脱水 • 5、透明 • 6、透蜡 • 7、包埋 • 8、修块 • 9、切片 • 10、染色
实验八 石蜡切片法
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1
一 、实验目的
• 学习石蜡切片法 • 了解组织染色原理
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2
二、实验原理
• 用石蜡渗透固化组织；
• 用碱性染料如苏木精、碱性品红等，使细 胞核着色；
• 用酸性染料如伊红、酸性品红等，使细胞 中的嗜酸性成分着色，如蛋白质。
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3
三 、实验用品
• 1、器材： • 切片机、水浴锅、染色缸、玻片、显微镜、试剂瓶、剪刀、
• 未注明时间的一律处理2-3min。
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8
五、作业
• 简述石蜡切片过程，绘制你所观察到的细 胞形态。
• 提交一张你认为制作较好的玻片。
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9
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பைடு நூலகம்
5
取材到切片
• 取材——固定（Cannoy’s），材料厚度 2mm。
• 100%酒精——100%酒精——二甲苯:酒精 （1:1）——二甲苯——二甲苯——二甲苯: 石蜡（65℃ 1:1）——石蜡（65℃）——石 蜡（65℃），以上处理各10-30min，视材 料大小而定，最后一步石蜡20min 。
• 包埋——修块——切片——贴片
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6
脱蜡与复水
• 二甲苯——二甲苯——二甲苯/无水乙醇 (1/1)——无水乙醇 ——无水乙醇——95% 乙醇——80%乙醇——70%乙醇——50% 乙醇——蒸馏水。
石蜡切片法
包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？） 脱水时间：视材料的性质、大小而定 小鼠肝脏：在各级AL中停留0.5-1h； 植物叶片：在各级AL中停留2-4h； 注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水；如需过夜， 则停留在70%酒精中。
二、实验步骤（2）
透明（置换） 常用透明剂：二甲苯； 透明原则：低浓度到高浓度 （½ 二甲苯+ ½ 100%酒精 二甲苯 二甲苯） 透明时间：小鼠肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留1-3h。
染色原理－－化学作用
化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸性、碱性和 中性染色剂，而动、植物的细胞内—般也可区分为酸性(阴离子) 和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳 离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸 性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳 离子(碱性部分)较牢固地结合。 例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸 性的组成成分．故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于 着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红、曙红)的亲 和力很大，易于着色。
甲醛－醋酸－酒精液(FAA) 50%或70％酒精 90ml 冰醋酸 5ml 甲醛 5ml 特点：过去称”标准固定液“或”万能固定液“；是 组织形态中常用的固定液；同时兼作保存液。是植物 制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和 丝状藻类外，均可用此液固定．也通用于昆虫和甲壳 类的固定。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
石蜡切片的操作流程
在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前,必须根据植物材料的特性,采用不同的方法,对植物材料进行处理,把材料制成透明的玻片标本.根据材料的性质和制作法的不同,常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类,前者常用的有徒手切片法,冰冻切片法,火棉胶切片法,石蜡切片法,冷冻切片法等,其中以石蜡切片法最为常用.后者包括整体封藏法,涂布法,压片法等.石蜡切片法石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.取材用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定. 取材的注意事项如下:(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织;取病理材料时,应设置对照材料.(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm 小段;叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行);对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.(二)固定将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.常用固定液:简单固定液以一种化学药品配制的固定液.⑴乙醇为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.⑵甲醛为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.⑶醋酸为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.2. 混合固定液:由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:①优缺点互补;②膨胀与收缩相互平衡;③强氧化剂与还原剂应分别配置.常用混合固定液有下列几种:⑴ FAA 固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇) 广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24 h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.⑵纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存;主要用于显示分裂相.(三)抽气植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.(四)洗涤固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察;有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24 h.(五)脱水材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分;在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料. (六)透明透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..(七)浸蜡是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.(八)包埋材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.(九)切片即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.(十)贴片是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.常用的粘片剂有下列二种:(1) 明胶黏片剂(2) 蛋清黏片剂(十一) 染色即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.染色方法可分为下列几类:①单染只用一种染料染色.②双重染色两种染料染色,如番红--固绿;苏木精---曙红.③多重染色多种染料染色,如番红—固绿—桔红G;酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.(十二) 封藏封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.。
组织块石蜡包埋
组织块石蜡包埋的步骤：1.取材：尽量活杀，在处死30min内取材完毕，组织块的大小一般为（1.0-1.5cm）*1.0cm*(0.2-0.3cm)2.固定：常用甲醛液浓度为4%，是40%甲醛溶液和水按1:9比例配制而成。
固定时间以12-24h为宜。
（4℃冰箱可放置1-3个月）3.冲洗：将组织块放在固定的容器中用流水冲洗24h.4.脱水：一次70%酒精2h, 80%酒精2h, 90%酒精1h, 95%酒精40min,无水乙醇Ⅰ40min,无水乙醇Ⅱ30min。
可将组织放于70%酒精中过夜。
5.透明：将脱水后组织直接浸入二甲苯透明剂中（二甲苯Ⅰ, 二甲苯Ⅱ），每次透明为10min。
6.浸蜡：常规制片常用熔点高于56℃以上的石蜡，普通采用56℃-58℃石蜡。
先将组织浸入软蜡Ⅰ1h左右, 再浸入软蜡Ⅱ40min；硬蜡Ⅰ40min, 硬蜡Ⅱ1h。
（一般浸蜡时间为3-4h）软蜡熔点为45℃-50℃，硬蜡熔点为55℃-60℃。
7.包埋：将蜡液注入包埋硬具中，迅速将组织块平放入蜡液中，摆正并铺平，然后移至冷却台，使组织块同蜡液凝固在一起的过程。
（硬蜡凝固定型）石蜡切片法：在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为“修块”），但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。
一般切片厚度为4-6μm。
贴片时先在干净的载玻片上涂一层蛋白甘油，然后于60℃恒温箱中烘烤1h，若未烤干可适当延长时间；若组织剥脱可涂一层蛋清加以固定。
做免疫组化时，玻片应涂多聚赖氨酸，亦可买防脱玻片。
HE染色的步骤：二甲苯Ⅰ5-10min→二甲苯Ⅱ5-10min→无水乙醇Ⅰ1-3min→无水乙醇Ⅱ1-3min→90%酒精1min→80%酒精1min→70%酒精1min→水洗→苏木精3-5min→水洗→盐酸酒精1-3s→水洗→饱和碳酸锂（氨水）10-30s→水洗→伊红3-5min→水洗（短）→70%酒精1-2s→80%酒精3-5min→90%酒精3-5min→95%酒精3-5min→无水乙醇5-10min→二甲苯Ⅰ3-5min→二甲苯Ⅱ3-5min→中性树胶封片染色液的配制：1.Harris苏木精的配制苏木精 1g硫酸铝钾 15g无水乙醇 10ml蒸馏水 200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。
石蜡切片制作过程的脱水、透明、浸蜡最佳时间和方法的探讨
脱水
脱水是石蜡切片制作过程中的一个关键步骤，它旨在去除组织内的水分，为后 续的透明和浸蜡步骤创造条件。以下是几种常用的脱水方法及其原理和注意事 项：
1、真空干燥：将组织置于密封的容器内，在一定的负压下进行干燥。此方法 可有效去除组织内的水分，但需要严格控制负压大小和干燥时间，以避免组织 过度干燥或受到损伤。
准备工作
在制作石蜡切片前，需要做好以下准备工作：
1、材料和设备的选择：根据实验需要，选择合适的实验动物、包埋剂、切片 刀、染色剂等材料，同时准备好烘箱、水浴锅、注射器等设备。
2、实验前的准备：对实验动物进行麻醉、处死、解剖等操作，获取所需的组 织器官，并按照要求进行处理。
3、实验方案的制定：根据实验目的和操作流程，制定详细的实验方案，以便 有条不紊地进行实验。
在制作过程中，每个步骤都有需要注意的关键点和事项。例如，在涂布石蜡时， 需保证石蜡的均匀性和厚度；在制作切片时，应根据组织类型和观察需求选择 合适的切片厚度；在盖印时，应保证切片的平整度和无气泡。此外，为了获得 更好的观察效果，还需注意显微镜的调整和光源的选择。
四、注意事项
在制作石蜡切片标本时，需注意以下问题及相应的解决方案： 1、石蜡的纯度：选用纯度较高的石蜡，避免影响切片的制作和观察效果。
鼠组织采集主要采用处死法，常用的有颈椎脱臼法和吸入麻醉法。采集的组织 应尽可能保持完整，避免机械性损伤。采集后，将组织块置于预冷的0.9%生理 盐水中清洗，去除血渍和杂质，再放入4%多聚甲醛固定液中固定，以保持组织 形态和结构。
二、切片方法
石蜡切片是最常用的组织切片方法，其制作过程包括取材、固定、脱水、包埋、 切片和染色等步骤。另外，冷冻切片也是一种常用的切片方法，主要适用于新 鲜组织的观察和研究。
组织包埋及石蜡切片制作实验报告
组织包埋及石蜡切片制作实验报告一、实验目的本次实验旨在掌握组织包埋及石蜡切片制作的方法，了解其原理和步骤，并能够正确操作实验仪器，完成对组织样品的包埋和切片。
二、实验原理1. 组织包埋：组织包埋是指将组织样品固定在一定位置后，用透明的树脂或石蜡等物质将其包裹起来，使其保持形态。
这样可以方便进行显微镜下观察和分析。
2. 石蜡切片制作：石蜡切片制作是指将已经包埋好的组织样品用微型刀片进行切割，并将其贴在载玻片上，以便于观察和分析。
三、实验步骤1. 组织处理：将需要研究的组织样品取出并处理。
通常需要去除多余的组织、水分和血液等杂质，并用缓冲液或其他试剂进行固定。
2. 包埋处理：将处理好的组织放入容器中，加入透明树脂或石蜡等物质，在真空环境下进行振荡混合。
然后放入模具中，加热固化。
3. 切片处理：用微型刀片将已经包埋好的组织样品切成薄片，并将其贴在载玻片上。
然后进行染色和封片等处理。
四、实验仪器和材料1. 组织固定试剂：如福尔马林等2. 透明树脂或石蜡3. 包埋模具4. 微型刀片5. 载玻片6. 染色试剂：如伊红、苏木精等五、实验注意事项1. 实验操作时要注意安全，避免有毒有害物质的接触。
2. 包埋模具和刀片要清洗干净，避免杂质对实验结果的影响。
3. 实验操作时要认真仔细，避免出现误操作。
六、实验结果分析通过本次实验，我们成功地制作了组织包埋及石蜡切片，并进行了染色和封片等处理。
观察到了组织样品在显微镜下的形态和结构，并对其进行了分析。
七、实验总结本次实验通过对组织包埋及石蜡切片制作的学习和实践，使我们更加深入地了解了这一技术的原理和步骤。
同时，也让我们对组织样品的结构和形态有了更深入的认识。
在实验过程中，我们还注意到了实验操作的细节和注意事项，提高了实验操作的技能水平。
石蜡切片的制作及免疫组织化学标准化操作流程
石蜡切片的制作标准化操作流程1.取材固定1)取材必须新鲜，组织离体后迅速割取组织块，并随即投入固定剂福尔马林中。
切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。
2)固定完毕，用水冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。
2.脱水脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水，各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。
需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。
3.二甲苯透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。
透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。
将组织块先放入纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，。
透明时间一般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。
4.透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在60℃左右。
透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。
纯石蜡应处理2-3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15-30min。
透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。
具体做法是；先准备好纸盒，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。
5.切片方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。
石蜡切片的制作过程
石蜡切片的制作过程（一）花药切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。
3．脱水：经70％乙醇、85%乙醇，每级3~4h，含1%伊红的95％乙醇中3~4h（可以过夜），无水乙醇2次，每次1~2h。
4．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1~2d5．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋。
6．修蜡块、切片：粘蜡块时组织块直立于台木上，并用单面刀片切除先端石蜡，浸水软化后放在切片机上坐横切片，切片厚12μm。
7．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。
8．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。
9．染色（番红-固绿双重染色）：在已脱蜡的材料上滴注无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水各4~5s，苯胺番红染色5~10min，用蒸馏水洗去浮色。
10．脱水、透明：各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇），苯胺固绿复染30~40s，再经95%乙醇，无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯2次，各约4~5s，最后置二甲苯缸中。
11．封片、烘片：加拿大树胶封片。
封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。
最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。
制片日程（二）花芽纵切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。
3．整染：经70％乙醇、50%乙醇各2~4h，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木精原液1份，加入50%乙醇及乙醇各半的混合液1份）中整染2~3d。
4．水洗、反蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色渗出，再转入自来水中，换1~2次水，至样品由紫色变深蓝色为止，共需时约1d。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70 ％酒精开始，再经80％，95 ％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF 固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy ）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
石蜡切片
石蜡切片切片法：切片法是将材料处理后用切片机将标本切成薄片好后封藏观察切片法：❖切片法的种类:石蜡切片技术冷冻切片技术半薄切片技术❖切片法制片的过程：取材（动物或植物）——固定——洗涤——染色（整体染色）——脱水（梯度酒精）——透明——浸蜡透入（包埋剂）——包埋——切片（黏附切片与载玻片上）——脱蜡——复水——染色与复染——脱水——透明——封藏石蜡切片的主要过程：杀生（取材）——固定——冲洗——脱水——保存——透明——石蜡透入——包埋——切片——复水——染色——脱水——封藏——观察保存（一）取材杀生（动物）• 1.目的：动物有时需要杀生，然后取出所需组织• 2.方法：一般采用乙醚（氯仿）麻醉后解剖，取出所需组织。
• 3.注意事项：–尤其细胞学方面的研究，对于材料的新鲜的程度要求十分严格。
尽量割取活的动物组织快。
–性别合适；–麻醉前动物生活正常，以免影响其代谢活动，进而影响细胞结构；–取材部位要准；–速度快。
取材：1.目的：得到所需要的组织2.方法：a.用剪刀剪下组织b.冲洗动物组织，动物（生理盐水、糜蛋白酶溶液）植物（缓冲液或水）冲洗干净，防止失水，避免压挤损伤，用生理盐水、糜蛋白酶冲去表面的血、粘液和赃物。
c.切成小块3注意事项：»要准»要快»避免损伤（方向，刀要快，不能挤压）❖植物取材：用剪刀剪下材料时一定要植物生活正常，不要因缺水、营养和温度光照发生明显改变，影响细胞结构，同时发育程度、部位要准。
（二）固定1.目的：为了使取样的细胞在形态结构和成分方面保持与生活的状态一样，就必须迅速杀死细胞避免失水变形，自溶破坏结构等。
固定液的选择：快；不溶解；不收缩膨胀；软硬适中；增加折光度；增加染色能力；长期保存等7项。
2.方法（1）固定剂的种类：一般采用化学固定单纯固定：只用一种试剂固定：混合固定：用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如：❖四川师范大学第二章石蜡切片技术单纯固定：乙醇：可与水任何浓度混合❖适合固定浓度为70%_100%：与福尔马林和醋酸等混合使用效果更佳。
石蜡包埋技术
石蜡包埋技术制作石蜡切片，切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中，而水与石蜡又是不相混合的，所以在浸蜡，包埋前必须将组织内所含的水分脱去。
而大多数的组织固定剂是水溶液，随后的水冲洗也使其含有大量水分，因此必须先行脱水，一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。
由于酒精和石蜡不能混合，须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精，因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状，所以此步骤又称透明。
最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。
常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤，即固定，脱水，透明，浸蜡和包埋，前一章中已述过固定。
第一节脱水脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步透明及浸蜡创造条件。
此外，脱水还可以使组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。
一．常用的脱水剂1．酒精：是制片最常用的试剂，可与水在任何比例下相混合，酒精的脱水能力比较强，又能硬化组织。
但是酒精的船头速度很快，对于组织会有明显的收缩作用。
因此在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
第一瓶酒精浓度随固定剂，脱水组织的大小和种类而异，经水溶性固定剂固定的细柔组织需要慢慢脱水，从50％酒精开始。
如眼球，组胚组织等大多数组织标本则是从70％酒精开始，再经80％，95％以至无水酒精。
但是有时为了某种特殊要求，例如要做糖元的切片标本或是要做尿酸结晶染色切片标本，为了防止糖元和尿酸结晶在水中消失却要直接投入无水酒精中固定，而不需要经过水洗和低浓度酒精的脱水过程。
经无水酒精固定后的组织只需要再经过换一次无水酒精脱水即可。
用AAF固定液固定的组织可直接置于95％酒精开始脱水。
用醇性固定剂（如Carnoy）则可置于高浓度无水酒精内，但应多次换液以除酸。
一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。
但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。
组织石蜡包埋和切片技术
组织石蜡包埋和切片技术包埋剂embedding agent在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。
所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。
一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂。
石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。
此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。
除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。
该法多采用旋转式切片机进行切片。
石蜡制片操作程序如下：（一）材料的采集与分割采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。
采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。
为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。
分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。
分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。
（二）杀死与固定利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。
常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。
将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。
用F.A.A 固定液固定，时间至少24小时。
F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。
卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。
因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。
石蜡切片法透明透蜡包埋
附：植物材料的透蜡过程必须缓慢进行，所须的时间 约需1-2天。其方法如下：①将材料连同二甲苯一起倒 入小蜡杯中；②然后轻轻倒入溶解的石蜡。石蜡就在二 甲苯的上层凝固起来。此时可将小蜡杯放在35-37ºC温箱 内，使石蜡徐徐熔解到饱和为止，约需1-2天；③将蜡杯 移入56-60ºC温箱中，待石蜡熔解后，倒去含有二甲苯的 石蜡，以后每隔1小时左右更换已熔的纯蜡一次，共换纯 蜡2-3次即可进行包埋。
二、试剂与器Βιβλιοθήκη 1.试 剂：1/2 无水乙醇+1/2二甲苯、 二甲苯、 1/2二甲苯+1/2石蜡、 纯石蜡。 2.器 材：恒温箱、蜡杯、镊子、解剖针、 酒精灯、塑料面盆、温台。
三、实验程序
1．透明：透明也是渐次由低浓度至高浓度。材料先 在纯酒精和二甲苯各半的混合液浸15—30分钟，再转 入纯二甲苯中透明（至透明为止），一般15—30分钟。
五、思考题 1 .当材料周围出现白色雾状时，应退回纯酒精中重
新脱水。为什么？
3．包埋：从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋 用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，用温镊子夹取材料 平放于纸盒底部，使之排列整齐。将纸盒两侧的把手提 起，慢慢地平放在面盆的水面，待石蜡的表面凝固，将 纸盒慢慢浸入水中，待石蜡完全凝固（约30分钟）后即 可取出备用。
四、注意事项
透明的注意事项 • 使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中水分进入； • 更换透明剂，动作要迅速； • 材料周围出现白色雾状，应退回纯酒精中重新脱水。 透蜡的注意事项 • 动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料为54-60ºC。 • 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低； 包埋的注意事项 • 包埋前应先把必需的用具（恒温箱、温台、纸盒）准备好。 • 包埋用的镊子要先放在温箱中预热。
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新脱水。为什么？
二、试剂与器材 1.试 剂：1/2 无水乙醇+1/2二甲苯、 二甲苯、 1/2二甲苯+1/2石蜡、 纯石蜡。 2.器 材：恒温箱、蜡杯、镊子、解剖针、 酒精灯、塑料面盆、温台。
三、实验程序
1．透明：透明也是渐次由低浓度至高浓度。材料先 在纯酒精和二甲苯各半的混合液浸15—30分钟，再转 入纯二甲苯中透明（至透明为止），一般15—30分钟。
2．透蜡：材料自二甲苯中取出后,先移入二甲苯和石 蜡等量的混合液中约30分钟，然后进入纯石蜡中约40 —60分钟，再换纯石蜡一次约40—60分钟。
附：植物材料的透蜡过程必须缓慢进行，所须的时间 约需1-2天。其方法如下：①将材料连同二甲苯一起倒 入小蜡杯中；②然后轻轻倒入溶解的石蜡。石蜡就在二 甲苯的上层凝固起来。此时可将小蜡杯放在35-37ºC温箱 内，使石蜡徐徐熔解到饱和为止，约需1-2天；③将蜡杯 移入56-60ºC温箱中，待石蜡熔解后，倒去含有二甲苯的 石蜡，以后每隔1小时左右更换已熔的纯蜡一次，共换纯 蜡2-3次即可进行包埋。
3．包埋：从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋 用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，用温镊子夹取材料 平放于纸盒底部，使之排列整齐。将纸盒两侧的把手提 起，慢慢地平放在面盆的水面，待石蜡的表面凝固，将 纸盒慢慢浸入水中，待石蜡完全凝固（约30分钟）后即 可取出备用。
四、注意事项
透明的注意事项 • 使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中水分进入； • 更换透明剂，动作要迅速； • 材料周围出现白色雾状，应退回纯酒精中重新脱水。 透蜡的注意事项 • 动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料为54-60ºC。 • 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低； 包埋的注意事项 • 包埋前应先把必需的用具（恒温箱、温台、纸盒）准备好。 • 包埋用的镊子要先放在温箱中预热。