人脂联素基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达
人TLR4胞外段真核表达质粒的构建及其在HEK293 细胞中的表达
人TLR4胞外段真核表达质粒的构建及其在HEK293 细胞中的表达陈伟;史忠【期刊名称】《中国急救医学》【年(卷),期】2005(025)012【摘要】目的构建人Toll-like receptor 4(TLR4)胞外段真核表达质粒并观察其表达.方法通过PCR扩增人TLR4胞外段基因,将其克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+),重组质粒pcDNA3.1(+)-eTLR4转染入人胚肾293细胞(HEK293细胞)中,RT-PCR检测TLR4胞外段的表达.结果测序结果表明,成功构建人TLR4胞外段真核表达质粒pcDNA3.1(+)-eTLR4,并在HELK293细胞中获得表达.结论TLR4胞外段能在HEK293细胞中获得正确表达,为TLR4信号通路的进一步研究打下了基础.【总页数】3页(P899-901)【作者】陈伟;史忠【作者单位】中国人民解放军第三军医大学新桥医院急救部,重庆,400037;中国人民解放军第三军医大学新桥医院急救部,重庆,400037【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.人TLR4胞外段的克隆、表达及功能活性分析 [J], 王凡平;王明永;孙瑞利;郭庆合;张婧婧;杨景瑞;张新富;段巨洪2.脂质体包裹人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒的构建 [J], 杨于力;罗清礼;吕红彬3.人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达 [J], 谢向荣;杨玉雯;汤圣兴;左广锋;程浪;汪茗;曹蘅;汪和贵;蔚有权;杨浩;芮世宝4.带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达[J], 章广玲;袁丽杰;王芳;汤华;张银;张淑杰5.真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达 [J], 王海红;董为人;张琳;晏芳;刘忠英;李妍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达
Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达温见燕;于长安;杨鹏;阴彬;李耿;柯元南;廖文强【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2009(49)4【摘要】目的构建小鼠Mef2c基因真核表达质粒并转染HEK293T细胞.方法采用RT-PCR方法从小鼠心脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的Mef2c的基因,采用基因重组技术将Mef2c的cDNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建小鼠Mef2c真核表达质粒,脂质体转染HEK293T细胞进行表达.结果酶切和测序结果证实Mef2c真核表达质粒构建成功,经脂质体转染293T细胞后,Western blot 检测证明Mef2c蛋白在真核细胞中成功表达.结论成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Mef2c,为进一步研究小鼠Mef2c在心肌分化过程中的作用及其调控机制奠定了实验基础.【总页数】3页(P15-17)【作者】温见燕;于长安;杨鹏;阴彬;李耿;柯元南;廖文强【作者单位】中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中国医学科学院,北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达[J], 陈杰;高下;朱敏生;张文程;麻晓峰;顾香芳2.犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达 [J], 靳慧君;仲飞;吴凌娟;解民;王微;韩冬梅3.结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达 [J], 白娜;毛莹莹;颜仁和;林明;陈兴露;李青青;陈惠莹;刘军;李红卫4.SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达 [J], 王明月;王浩;王冬梅;杨泽斌;崔梅英;刘宁;黄莉莉;关新刚5.人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达 [J], 丁国富;吴翀;蒋为薇;李军;罗平;周红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达
人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达白书媛;王培昌【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2013(42)13【摘要】目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平.方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2 cDNA片段,与pMD18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2；将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2.应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照；用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2 mRNA及蛋白表达水平.结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DN A Polδ2 cDNA序列完全一致.RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2 mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组；Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNAPolδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性.结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功.【总页数】4页(P1499-1501,1505)【作者】白书媛;王培昌【作者单位】首都医科大学宣武医院检验科,北京100053;北京市宣武区疾病预防控制中心,北京100053;首都医科大学宣武医院检验科,北京100053【正文语种】中文【相关文献】1.人p75 NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 鲁秀敏;朱枫;黄鹏;余瑛;王永堂2.突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达 [J], 赵四敏;陈旭东;赵国强;董子明3.人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建 [J], 杜柳涛;庄志雄;高昆;杨杏芬;何云;徐雷;魏青4.巢式逆转录-聚合酶链反应扩增人骨形成蛋白2全长cDNA及其真核表达载体的构建 [J], 俞莉敏;党耕町;杨吉成;郑祖根5.人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达 [J], 李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
真核表达载体pIRES—EGFP—PDGF—B的构建及在293T细胞中的表达
ｔｅｄ ｖｌｐ ｅ ｔｏ ｉ ｒｃｎ ｅ ［］ ＪＬ ｂＣｉ ｄ，０ ６ １７ ｈ ｅｅｏ ｍ ｎ ｆｌ ｅ ａｃｒ Ｊ ． ａ ｌ Ｍｅ ２ ０ ，４ ｖ ｎ （ ） ５ － ６ ２ ：８ ６ ．
［ ］ 宋 霆婷 ， 玉华 ， ４ 姜 李妙玉 ， Ｍ Ｐ 等． Ａ Ｋ反义寡核 苷酸对肝 癌细胞恶 性 表型的逆转作用［］ Ｊ． 实用医学杂志 ， ０ ，１ １ ） ２ １— ｌ８ ２ ５ ２ （９ ：ｌ６ ２ １． ０ ［ ］ 王顺祥 ， 晓慧 ，周少英 ， ． ５ 吴 等 乙酰 肝素酶 反义 寡核苷 酸对 人肝 癌 细胞 株 乙酰 肝素 酶 表达 的影 响 ｆ ］ 实用 医学杂 志 ，０ ５ ２ Ｊ． ２０ ，１
LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达
LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达张大伟;胡蕴玉;李立文;白文涛;杨香菊;李文献;白建萍【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2007(007)006【摘要】为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3/pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定.脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位.经酶切和基因测序鉴定LMP3/pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功.转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达.说明基因重组技术可成功构建LMP3/pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内.【总页数】4页(P972-975)【作者】张大伟;胡蕴玉;李立文;白文涛;杨香菊;李文献;白建萍【作者单位】第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;西北大学生命科学院生物科学系,西安,710069;第四军医大学微生物学教研室,西安,7100321;第四军医大学口腔医院正畸科,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】Q5【相关文献】1.遗传学：LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞中的表达 [J], 张大伟2.SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达 [J], 罗天霞;樊红琨;芮丹丹;孙佳翕;马小芳;章茜3.牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 庞峰;史巧芸;朱华培;徐开莲;赵天靖;李亚颖;彭冬梅;李国华;周海龙4.水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 匡文华;王凤阳;张晓茹;成鹰;杜丽;雷明;焦寒伟;张冬琳;郝永昌;祁超5.pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达 [J], 徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人cbl基因真核表达载体的构建及表达
人cbl 基因真核表达载体的构建及表达【Abstract】AIM： To construct the eukaryotic expressing vector of human cbl and test its expression in African green monkey kidney cell line COS7. METHODS: Human cbl gene tagged with flag was amplified from pEFHAcbl plasmid by PCR. The product was cloned into pGEMT easy, sequenced and then subcloned into eukaryotic expressing vector pcDNA3.1(+). The recombined vector was then transfected into COS7 cells with lipofectin and the expression of cbl gene was detected by Western blot. RESULTS: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl was successfully constructed and its expression in COS7 cells could be detected. CONCLUSION: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl is constructed and it expresses flagcbl fused protein correctly in COS-7 cells.【Keywords】 cbl; polymerase chain reaction; cloning, molecular; gene expression【摘要】目的：构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体，并检测其在真核细胞中的表达.方法：以含有人全长cbl cDNA 的质粒pEFHAcbl 为模板，采用PCR方法扩增cbl基因，并在其N末端带上含24 bp的flag标签，克隆到pGEMT easy载体并测序，再亚克隆至真核表达载体pcDNA31(+)，酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS7细胞，Western blot检测flagcbl在细胞中的表达. 结果：测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flagcbl融合基因的序列以及读框全部正确；重组质粒pcDNA31(+)flagcbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段；脂质体法转染COS7后检测到预期目的蛋白的表达.结论：成功构建了N末端带flag标签的cbl真核表达载体，并使其在真核细胞COS7中表达.【关键词】 cbl; 聚合酶链反应; 克隆，分子; 基因表达0引言Cbl (casitas Blineage lymphoma,简称Cbl)是一类广泛分布的细胞内蛋白，在哺乳类中有Cbl、Cblb和Cbl3 3种.Cbl分子中含有多个不同的结构域，可以介导与不同的细胞内分子结合，在细胞活化过程中可作为接头分子或支架分子参与信号转导；同时该分子中的RING结构域能够与泛素结合酶E2结合,作为泛素连接酶E3促进其结合的靶分子发生泛素化－蛋白酶体降解，因此参与细胞内信号转导的负调控机制［1］.近年来的研究表明，突变的Cbl可成为癌基因［2］；而许多肿瘤细胞内与增殖有关的分子（如受体型蛋白酪氨酸激酶，RTK）发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.我们成功构建了N－末端融合有flag标签的cbl 基因的真核表达载体，并采用脂质体法转染培养的COS7细胞，检测其是否正确表达，为进一步研究cbl 对肿瘤细胞生长的影响奠定基础.1材料和方法11材料大肠杆菌菌株DH5α、pcDNA31(+)真核表达载体、COS7细胞由本室保存；含人全长cbl cDNA的质粒由美国La Jolla变态反应与免疫学研究所保存；pGEMT easy购自Promega公司；dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、DL2000 DNA Marker购自Takara公司；1640培养基购自Gibico 公司；LipofectamineTM2000购自invitrogen公司；抗flag M2 mAb和抗ACTIN抗体、HRP标记的羊抗鼠、兔第二抗体分别购自Sigma公司和博士德公司；Western blot 所用发光底物为pierce公司产品；用于PCR 反应的引物由上海生物工程公司合成；质粒提取和DNA 回收试剂盒由杭州维特洁公司提供.12方法121引物设计上游引物序列： 5′GGT ACC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG ATG GCC GGC AAC GTG AAG AAG AGC3′，其中GGT ACC为KpnI酶切位点.下划线部分为编码flag标签的核苷酸序列；下游引物序列： 5′ CTC GAG CTA GGT AGC TAC ATG GGC AGG AGA AGA AAT GG 3′，其中CTC GAG为XhoI酶切位点.122PCR扩增flagcbl基因及产物修饰在25反应体系中加入25 μL 10×反应缓冲液，20 μL dNTP，pEFHAcbl 质粒模板10 μL，上下游引物各10 μL，pyrobest高保真酶025 μL，补水至25 μL.扩增条件为94℃ 5 min，94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 2 min，35 cycles.扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离；回收后溶于35 μL去离子水中，并进行加“A”反应： 50 μL 反应体系中加入5 μL 10×反应缓冲液，4 μL dATP，3 μL MgCl2，扩增产物30 μL，rTaq 酶05 μL，补水至50 μL，72℃ 40 min.123PCR产物克隆及序列测定上述加“A”后的PCR产物回收，回收片段克隆到pGEMT easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切鉴定及测序.124pcDNA31(+)flagcbl真核表达载体的构建用BglI先将pGEMT easy酶切成小片段，因flagcbl内部无BglI酶切位点，故包含在酶切后产生的最大片段内，将该片段回收后再用KpnⅠ/XhoⅠ将flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表达载体中，构建出重组表达载体pcDNA31(+)flagcbl.125基因转染COS7细胞在含100 mL/L新生小牛血清的1640 培养基中，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度下培养，80%汇合时按照LipofectamineTM2000说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染. 126Western blot检测转染后细胞中转入基因的表达分别于转染后24，48 h收细胞并裂解细胞内总蛋白，取20 μg处理后的蛋白样品进行SDSPAGE电泳并电转移至NC膜，5 g/L脱脂奶封闭1 h，分别与适当稀释后的一抗孵育1 h、PBST洗膜，然后与1∶4000二抗孵育1 h，PBST洗膜后加入发光底物孵育1 min，暗室中用X光片曝光，显影，定影.2结果21人cbl基因的克隆及序列测定用PCR技术以pEFHAcbl 质粒为模板扩增得到2737 bp片段（Fig 1），加“A”后克隆到pGEMT easy 载体中，EcoRI/XhoI酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示切出大小为450、1190和3000 bp的几种片段（Fig 2），表明系阳性克隆，测序结果表明，所克隆的人cbl基因序列以及flagcbl融合基因的读框完全正确.22真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl的构建利用酶切后产生的载体和片段之间互补的黏性末端进行亚克隆.构建成功的pGEMT easy flagcbl先用BglⅠ将pGEMT easy酶切成小片段，而flagcbl 内部无BglⅠ酶切位点，包含在最大片段内，将该片段回收后再用KpnI/XhoⅠ双酶切将flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表达载体.KpnⅠ/XhoⅠ双酶切和EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定均表明pcDNA31(+)flagcbl表达载体构建成功（Fig 3）.23真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl在COS7细胞中的表达构建成功的pcDNA31(+)flagcbl和空质粒pcDNA31(+)分别瞬时转染COS7细胞，转染后24 h和48 h antiflag抗体均检测到flagcbl在蛋白水平的表达，Mr约为120×103；而对照的空质粒转染后则没有相应的条带（Fig 4）.表明所构建的真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl 可以在真核细胞内正确表达.3讨论Cbl家族蛋白属于泛素连接酶E3家族的一大类，这类分子中具有RING结构域，又称为RING型E3 .遗传和进化研究显示，Cbl家族蛋白是一类保守的蛋白酪氨酸激酶（PTK）信号通路的负调控因素.这一现象最早是在对C. elegans研究中发现的，功能缺失的Cbl同源分子Sli1可以恢复EGFR同源分子Let23的信号转导，而增加Sli1基因的拷贝数则可抑制此通路［4］；对Drosphila的研究也发现DCbl 同样可负调控EGFR介导的信号通路［5］.此后，越来越多的研究表明，CCbl可以促进多种受体型蛋白酪氨酸激酶（RTK）如EGFR、PDGFRα、β［6］、CSF1R［7］等发生配体诱导的泛素化和随后的蛋白酶体降解.Cbl的这种负调控RTK作用对于维持正常细胞内稳机制具有重要意义.而上述分子很多在肿瘤的发生和发展过程中具有重要作用，有些是癌基因的产物；并且许多肿瘤细胞内与增殖有关的RTK发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.这就提示，加强Cbl分子的负调控作用机制，下调某些肿瘤细胞内过度活化或发生突变的RTK可能会抑制相应肿瘤的恶性增殖.已有研究表明CCbl不仅可以使细胞表面的Neu迅速泛素化、下调，并抑制其下游信号通路，而且可以抑制转染了Neu的神经母细胞瘤在小鼠体内的生长［8］.与此相一致，Klapper等认为HER2单抗Heceptin的抗癌机制与Cbl结合并促使HER2泛素化、降解有关［9］.另外，膜锚定的Cbl可以逆转由Hck导致的鼠成纤维细胞恶性转化，表现为细胞形态的改变以及锚着非依赖性生长受抑［10］.在鼠NIH3T3细胞中过表达Cbl可抑制PDGFα和PDGFβ诱导的细胞增殖及抵抗凋亡［6］.这些研究结果强烈地提示： Cbl可能能够抑制各种增殖性疾病（包括肿瘤在内）的细胞内多条信号通路，有可能将其作为与异常活化PTK相关疾病的治疗手段.我们以pEFHAcbl 质粒为模板，通过PCR法获得了N－末端融合有flag标签的人cbl基因，并构建了的flagcbl基因的真核表达载体，该表达载体在真核细胞COS7中能够正确表达.这为我们进一步研究cbl对肿瘤细胞生长的影响，探讨一种肿瘤治疗的新思路奠定了基础.【参考文献】［1］ Joazeiro C, Wing S, Huang H, et al. The tyrosine kinase negative regulator cCbl as a RINGtype, E2dependent ubiquitinprotein ligase ［J］. Science, 1999 ;286(5438):309-312.［2］ Thien CB, Langdon WY. Cbl: Many adaptations to regulate protein tyrosine kinases［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001;2(4):294-307.［3］Peschard P, Park M. Escape from Cblmediated downregulation: A recurrent theme for oncogenic deregulation of receptor tyrosine kinases［J］. Cancer Cell, 2003 ;3(6):519-523.［4］ Jongeward GD, Clandinin TR, Sternberg PW. Sli1, a negative regulator of let23mediated signaling in C. elegans ［J］. Genetics, 1995;139(4):1553-1566.［5］ Pai LM, Barcelo G, Schupbach T. Dcbl, a negative regulator of the Egfr pathway, is required for dorsoventral patterning in Drosophila oogenesis［J］. Cell, 2000;103(1):51-61.［6］ Miyake S, MullaneRobinson KP, Lill NL, et al. Cblmediated negative regulation of plateletderived growth factor receptordependent cell proliferation. A critical role for Cbl tyrosine kinasebinding domain［J］. J Biol Chem, 1999;274(23):16619-16628.［7］ Lee PS, Wang Y, Dominguez MG, et al.The Cbl protooncoprotein stimulates CSF1 receptor multiubiquitination and endocytosis, and attenuates macrophage proliferation［J］. EMBO J, 1999;18(13):3616-3628.［8］ Levkowitz G, Oved S, Klapper LN, et al. cCbl is a suppressor of the neuoncogene［J］. J Biol Chem, 2000;275(45):35532-35539.［9］Klapper LN, Waterman H, Sela M, et al. Tumorinhibitory antibodies to HER2/ErbB2 may act by recruiting cCbl and enhancing ubiquitination of HER2［J］. Cancer Res, 2000;60(13):3384-3388.［10］ Howlett CJ, Robbins SM. Membraneanchored Cblsuppresses Hck proteintyrosine kinase mediated cellular transformation［J］. Oncogene, 2002;21(11):1707-1716.。
PinX1基因真核表达载体的构建及其在Hek293细胞中的表达
PinX1基因真核表达载体的构建及其在Hek293细胞中的表达孙文旦【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2009(27)6【摘要】目的确定PinX1在转染该基因的真核细胞Hek293内的表达定位.方法采用RT-PCR技术从HepG2中扩增Pinx1,克隆入真核表达栽体pcDNA3-vsv,重组质粒转染Hek293细胞,免疫细胞化学法检测蛋白质的表达.结果从HepG2细胞中获得Pinx1基因,成功构建真核表达载体pcDNA3-Pinx1-vsv,将其转染Hek293细胞后,免疫细胞化学法检测结果表明PinX1在细胞核内表达.结论成功获得PinX1基因,转染后在Hek293细胞核内表达,为探索Pinx1在端粒、端粒酶调控中的作用机制奠定基础.【总页数】3页(P445-447)【作者】孙文旦【作者单位】无锡市第二人民医院检验科,江苏无锡,214002【正文语种】中文【中图分类】O78【相关文献】1.Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达 [J], 游莎;曾和松2.AR-GFP融合基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达 [J], 刘建伟;叶玲;刘静;牛东滨;杜明梅;高宇红3.SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达 [J], 罗天霞;樊红琨;芮丹丹;孙佳翕;马小芳;章茜4.人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达 [J], 李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明5.小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达 [J], 何霞;汪杨;何善阳;王铸;冯发深;关琳琳;罗燕芬;潘金成;曹开源;徐霖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
成纤维细胞生长因子受体fgfr1真核表达质粒的构建及其在hek293t细胞的表达
Amplification of Human FGFR1 Gene and Its High-level Expression in HEK293T Cells
JIN Jin-Hua ，LI Ke-yan，ZHANG Ling，WANG Yu-hui，DENG Xiao-ming （Dept. of A nesthesiology，Plastic Surgery Hospital，Chinese A cademy of Medical Sciences and Peking Union
Medical College，Beijing 100144，China）
［Abstract］ Objective To establish an efficient FGFR1 expression system. Methods Human FGFR1 cDNA was amplified by RT-PCR and then inserted into pcDNA3.1 expression vector to construct the pcDNA3.1-FGFR1 recombinant plasmid. The pcDNA3.1-FGFR1 plasmids were transfected into HEK293T cells and the expressed FGFR1 protein was detected by Western blot and Immunofluorescence. Results The results showed that the sequence of FGFR1 cDNA amplified was consistent with that previously reported. The highly efficient expression of FGFR1 in HEK293T cells was achieved after transfection. Conclusion Human FGFR1 cDNA was amplified and the high-level expression of FGFR1 in HEK293T ce lls was achieved.
人脂联素原核表达载体PQE30_ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达
天津医药2008年11月第36卷第11期脂联素（adiponectin，ADPN）是脂肪细胞特异性分泌的一种血浆激素蛋白，在循环血液中大量存在，约占人体血浆总蛋白含量的0.01％[1]。
人类脂联素基因定位于染色体3q27，全长约17kb，由3个外显子和2个内含子组成，编码244个氨基酸组成的胶原样蛋白。
大量研究证明脂联素在调节内分泌代谢及能量平衡过程中发挥了极其重要的作用，可降低血脂、血糖，改善胰岛素敏感性及拮抗动脉粥样硬化[2]。
在脂联素转基因小鼠中，脂联素的过度表达成为预防糖尿病和动脉粥样硬化的保护性因素，重组脂联素在动物模型中具有抑制内源性葡萄糖产生等作用[3]。
本研究成功构建PQE30/ADPN原核表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究脂联素信号传导机制及其生理作用奠定了基础。
1材料与方法1.1材料大肠杆菌JM109及M15均为本室储存；DNA凝胶回收试剂盒，限制性内切酶，T4DNA连接酶为大连宝生物工程公司产品；质粒PUC57为上海生工生物技术公司产品；表达载体PQE30为Qiagen产品；PCR上、下游引物为本室设计，由上海生工生物技术公司合成及测序；兔抗人脂联素抗体购自Biovem公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG 为武汉博士德生物工程有限公司产品；DAB显色试剂盒购自北京天根生物技术公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2方法1.2.1人脂肪组织总RNA提取及脂联素cDNA的克隆参考文献[4]。
人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达*史晓文刘德敏孙颖张捷摘要目的：构建人脂联素重组表达载体PQE30/ADPN，并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白，对表达产物进行鉴定。
方法：将构建好的人脂联素克隆载体PUC57/ADPN与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中。
通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体PQE30/ ADPN，并用IPTG在大肠杆菌M15中诱导表达。
人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达
人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达谢向荣;杨玉雯;汤圣兴;左广锋;程浪;汪茗;曹蘅;汪和贵;蔚有权;杨浩;芮世宝【摘要】Objective:To construct eukaryon expression vector of humanHCN4 gene and transfect it into human embryonic kidney cells (HEK293). Methods:cDNA encoding human HCN4 gene was amplified by polymerase chain reaction,then digested with the restriction endonucleases Xho1 and EcoR1 and inserted into eukaryotic expressing vector pIRES2-EGFP that was transfected into HEK293 cells by Fugene HD.Whole-cell patch clamp indicated that hHCN4 gene was transfected intoHEK293cells.Results:Double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the HCN 4 gene was completely ac-curate.GFP was observed in the transfected 293 cells under a fluorescentmicroscope.HCN4 mRNA expression was confirmed by RT-PCR.Whole-cell patch clamp recorded ionic currents of transfected HCN4.Conclusion:The pIRES-HCN4-EGFP eukaryon expression vector was successfully constructed,and pacemaker channel HCN4 gene heterologous expression was established.%目的：构建人HCN4基因的真核表达质粒并转染人胚胎肾细胞，建立异源性表达HCN4通道模型。
人脂联素基因真核表达载体的构建及表达
Ｐ１： ＡＣ ５ ＣＴＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＴｒＧ
机体 能量 平衡 、 糖脂 代谢 等作 用 。 ， 其 病 理生 理 。 但 作 用及 其 机制 尚未 完全 明确 。本研 究 拟通过 人脂 联 素基 因的 克隆及 其 真核表 达 载体 的构建 来表 达脂 联
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安 徽 医科 大 学 学报
Ａ ｔ Ｕ ｉ ｒ ｔ ｉＭｅｉ ｎｌ ｎ ｕ ２０ ｃ；１ ５ ｃ ｎ ｅ ｉ ｔ ｄ ｉ ｉＡ ｈ ｉ ０ ６Ｏ ｔ （ ） ａ ｖ ｓａ ｓ ｃａｓ ４
‘５ ５ ・ ２
人 脂 联 素 基 因真 核 表 达 载 体 的 构 建 及 表 达
成 功 诱 导 表达 出融 合 蛋 白 Ｇ Ｔｈ Ｐ Ｓ —Ａ Ｍ，为 进 一 步 获 得 大 量 可 供 实验 研 究 和 临床 应用 的 重 组 ｈ Ｐ 创 造 条件 。 ＡＭ 主题词
自 由词
码 序列 （ 斜体 部分 ） 同时 再 分 别 在 两个 酶 切 位点 前 ， 加 上两 个保 护碱 基 。② Ｐ Ｒ反应 ： Ｃ 以本实 验 室 中 国
１２２ ｈ Ｐ 基 因真 核 表 达 载体 构 建 及 鉴 定 ．． Ａ Ｍ
真核 表 达载体 Ｐ Ｅ －Ｔ １ 约 Ｇ Ｘ４ 一（
①
１ １ １ 质 粒和 菌株 ．．
载体 Ｐ Ｅ －Ｔ １和 Ｐ Ｒ纯化 产物 双酶 切 ： Ｇ Ｘ４ 一 Ｃ 根据 真核
１ ２ １ ｈ Ｐ 基 因克 隆 ． ． Ａ Ｍ
① 引物 设 计 ： 据 已报 道 根
的人 Ａ Ｍ （ Ａ Ｍ） Ｄ Ａ 序 列 设 计 一 对 引 物 ， Ｐ ｈＰ ｃＮ 并 分 别在 上 下 游 引 物 前 加 上 Ｅ ｏ １ Ｓ ｉ 切 位 点 编 ｃＲ 、ａｌ酶
SK2和JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达
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ＲＵＩ Ｄａ ｎ ｄ ａ ｎ¨
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ｏ ｆ ｔ ｈｅ ｍ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｔ ｒ ａ ｎｓ ｆ ｅ ｅ ｔ ｅ ｄ ＨＥＫ２９ ３ ｃ ｅ ｉ ｌ ｓ ．Ｍ ｅ ｔ ｈｏｄｓ：Ｔ ｈｅ ｆ ｕｌ ｌ — ｌ ｅ ｎｇ ｔ ｈ ＳＫ２ ｇ ｅ ｎ ｅ ｗａ ｓ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ａ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎａ ｎ ｔ ｖｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｐＣ— ＭＶ６一 ｅ ｎ ｔ ｒ ｙ ／Ｓ Ｋ２ ｂ ｙ ＰＣＲ ａ ｍｐｌ ｉ ｉ ｆ ｃａ ｔ ｉ ｏ ｎ，ａ ｎ ｄ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｄ ｉ ｔ ｉ ｎｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｅ ｕｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｐ Ｉ ＲＥＳ — ＥＧＦＰ． Ｔｈｅ ｎ Ｊ ＰＨ２ ｇ ｅ ｎｅ ｗａ ｓ ｉ ｎ ｓ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｐ ｌ ＲＥＳ． ＥＧＦＰ— ＳＫ２ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ａ ｎ ｄ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｅ ｎ ｄ ｏ ｎｕ ｃ ｌ ｅ ａ ｓ ｅ ｄｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ ｓ ｅ ｑ ｕｅ ｎ ｃ ｉ ｎｇ ．Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎａ ｎ ｔ ｐｌ ＲＥＳ． ＥＧＦ Ｐ／ＳＫ２ ＋ Ｊ ＰＨ２ ｗａ ｓ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ＨＥＫ２９ ３ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ａ ｌ ｉ ｐ ｏ ｓ ｏ ｍｅ ｉ ｎｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｏ ｃ ｏ １ ．Ｔ ｈｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ＳＫ２
人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达
人脂联素、球状脂联蛋白基因克隆及真核表达载体的构建与表达李丙蓉;郑丹;邓华聪;刘金波;兰丽珍;郑宏庭【期刊名称】《中国糖尿病杂志》【年(卷),期】2007(15)6【摘要】目的构建高效表达球状脂联蛋白的真核表达载体,为研究脂联素、球状脂联蛋白在2型糖尿病及动脉粥样硬化中的作用奠定基础.方法克隆人脂联素基因,构建球状脂联蛋白基因的真核表达载体,转染人脐静脉内皮细胞株(HUVEC),Western blot检测上清中球状脂联蛋白的表达.结果测序结果表明克隆的人脂联素基因序列正确;构建的球状脂联蛋白基因真核表达载体能有效转染HUVEC,并在上清中检测到该基因的表达.结论完成人脂联素基因克隆,成功构建了人球状脂联蛋白基因真核表达载体,并在HUVEC中获得分泌表达,为研究球状脂联蛋白对2型糖尿病的干预作用提供了可能.【总页数】3页(P367-369)【作者】李丙蓉;郑丹;邓华聪;刘金波;兰丽珍;郑宏庭【作者单位】400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科;400016,重庆医科大学附属第一医院内分泌科【正文语种】中文【中图分类】R9【相关文献】1.人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建[J], 吉建新;廖伟娇;刘利东;卢春生;朱伯平;范婷婷2.脂联素球状结构域真核表达载体pcDNA3.0-gAd的构建 [J], 黄敏;陈显久;王彦;杨静3.人骨形态发生蛋白-2基因克隆及真核表达载体的构建 [J], 周诺;黄旋平;廖妮;韦山良;梁飞新;麦华明4.绿色荧光蛋白标记的人脂联素真核表达载体的构建 [J], 刘德敏;杜春红;孙颖;张捷5.人热休克蛋白90β-cDNA基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 刘涛;赵菊梅;田聆;魏于全;梁传余因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达
人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2013(23)19【摘要】目的构建STAT4基因的真核表达载体,在人胚肾细胞系HEK293中表达.方法设计引物、采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中获得STAT4的cDNA 全长序列,在PCR产物两端加上SalI和BamHI限制性内切酶识别序列,将pEGFP-C1载体和PCR产物用SalI和BamHI进行双酶切,将STAT4 cD-NA定向克隆到pEGFP-C1中,从而构建了重组质粒pEGFP-STAT4;经酶切和测序鉴定正确后,将pEGFP-STAT4体外转染HEK293细胞,瞬时表达带有GFP标签的STAT4融合蛋白；采用荧光显微镜技术和免疫印迹技术检测融合蛋白的表达.结果 RT-PCR扩增了2 247 bp的STAT4 cDNA全长,经测序分析与GenBank中已知序列一致；重组质粒pEGFP-STAT4转染HEK293细胞中,可检测到瞬时表达的GFP-STAT4融合蛋白.结论成功构建重组质粒pEGFP-STAT4,在真核细胞HEK293中能被表达.【总页数】5页(P6-10)【作者】李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明【作者单位】中南大学湘雅医院骨科;中南大学湘雅医学院免疫学教研室;中南大学湘雅医学院免疫学教研室;中南大学湘雅医学院,湖南长沙410078;中南大学湘雅医院骨科;中南大学湘雅医学院免疫学教研室【正文语种】中文【中图分类】R730.2【相关文献】1.人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达 [J], 莫毅;梁方方;檀大羡;牛向丽;陈自洪;华荣;张海英;谢丹尼2.人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达 [J], 谢向荣;杨玉雯;汤圣兴;左广锋;程浪;汪茗;曹蘅;汪和贵;蔚有权;杨浩;芮世宝3.人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立 [J], 袁成福4.遗传性长QT综合征HERG基因真核表达载体的构建和在HEK293细胞中的表达 [J], 桂乐;吴翔;秦小同;魏美芳;景宏美;刘毅5.人BMI-1基因真核表达载体构建及其在人乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞中的表达 [J], 王影利;邓青;尹玉慧;李惠翔因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人脂联素基因慢病毒载体在293T细胞中的表达及意义
（ 建 医科 大 学 附属 第一 医 院 ， 建省 高血 压 研 究所 ， 建 福 州 ３ ００ ） 福 福 福 ５ ０ ５
中 国 图 书 分 类 号 ： ２． ；Ｒ ３ ３ ９ ９ — ；Ｒ ３４ ２ Ｒ ３ ９ ２ ７ ． ；Ｒ ３４３ ９ ． ；
Ｒ ４ ３９ ．３
收 稿 日期 ：０８— １ ２ ， 回 日期 ：０ ８— ４—１ ２０ ０ — ６ 修 ２０ ０ ８
关键词 ： 脂联素 ； 慢病毒载体 ； ９ ２３Ｔ细胞 ； 管平滑肌细胞 血
最近 的研究 表明 ， 联素 （ ｄｐｎ ｃｉ，ｐ ） 脂 ａｉｏ ｅｔ ａＭ１ 有 ｎ
刺激 血 管新 生 、 善心 肌 缺血／ 改 再灌 注损 伤 、 降低 血
病毒载体上 ， 构建重组慢病毒载体质粒 。在脂质体介导下 与 包装质粒 Ｈ Ｌ Ｅ 包膜 质粒 Ｖ Ｖ Ｅ Ｐ Ｒ、 Ｓ Ｇ共转染 ２３Ｔ细胞包装 ９ 生产慢病毒 。慢 病毒感染 ２３Ｔ细胞后 ， ＴＰ Ｒ 和 Ｗｅｔｒ ９ Ｒ ．Ｃ ｓ ｎ ｅ
ｂｏ 法 检测 在 ２ ３Ｔ细 胞 中 ｈｐ ｌ ｔ ９ ａＭ１基 因 的 表 达 。采 用 抑 制 血 管平 滑肌 细 胞 增 殖 实验 ， 测 表 达产 物 的生 物 学 活 性 。 结 检 果 ｈｐ 基 因 经 测 序 后 与 Ｇ ｎ ａ ｋ报 道 序 列 完 全 一 致 。 ａＭ１ ｅＢｎ 重 组 慢 病 毒 载 体 质 粒 Ｐ Ｌｈｐ ． Ｅ Ｅ Ｆ 经 鉴 定 正 确 。 Ｎ —ａ Ｍ１Ｉ Ｓ 一Ｇ Ｐ Ｒ 三 质 粒 共 转 染 ２ ３Ｔ 细胞 成功 ， 集 、 缩 病 毒 后 测 定其 滴 ９ 收 浓
度为 ２０×１ Ｕ・ ～。感染 ２３Ｔ细胞后 Ｒ —Ｃ 、 ｓ ． ０Ｔ Ｌ ９ ＴＰ Ｒ Ｗｅｔ — ｅ ｌ 检测 ｈｐ ｎ ｒ ｂｏ ｔ ａＭ１组 细胞 有 ｈｐ ａ Ｍ１蛋 白表 达 ， 其余 两 组
人HNA3a基因的克隆及其在HEK293细胞的表达
[收稿日期]2018-11-12 [修回日期]2018-12-29[基金项目]蚌埠医学院自然科学基金重点项目(BYKY1720ZD)[作者单位]蚌埠医学院第一附属医院输血科,安徽蚌埠233004[作者简介]陈 丽(1985-),女,主管技师.[通信作者]管 政,副主任技师.E⁃mail:2993049833@.[文章编号]1000⁃2200(2019)01⁃0006⁃04㊃基础医学㊃人HNA⁃3a 基因的克隆及其在HEK⁃293细胞的表达陈 丽,周 浩,何宏天,管 政[摘要]目的:构建人HNA⁃3a 基因全长的真核表达载体,探索一种检测抗人HNA⁃3a 抗体的实验方法,观察HNA⁃3a 蛋白表达情况㊂方法:参照GeneBank 中人HNA⁃3a 基因序列,设计并合成引物,采用RT⁃PCR 方法反转录HNA⁃3a 基因外显子片段全长,定向克隆到pEGFP⁃N3载体中,然后采用Lipofectamine TM 2000试剂将含目的基因的pEGFP⁃N3表达载体转染至HEK⁃293细胞中进行稳定表达,并以免疫荧光和蛋白质免疫印迹法(WB)鉴定目的基因的表达情况㊂结果:免疫荧光和免疫印迹结果显示,目的基因在HEK⁃293细胞中获高效表达㊂结论:成功构建了高效表达HNA⁃3a 蛋白的真核表达载体,为检测人血浆中抗HNA⁃3a 抗体奠定了基础㊂[关键词]基因表达;克隆;HNA⁃3a;HEK293细胞[中图法分类号]Q 343 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2019.01.002Cloning of human HNA⁃3a gene and its expression in HEK⁃293cellsCHEN Li,ZHOU Hao,HE Hong⁃tian,GUAN Zheng(Department of Blood Transfusion ,The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College ,Bengbu Anhui 233004,China )[Abstract ]Objective :To construct an eukaryotic expression vector containing full⁃length sequences of human HNA⁃3a gene,explore an experimental method for detecting human anti⁃HNA⁃3a antibody,and observe the protein expression of HNA⁃3a.Methods :The primers were designed and synthesized according to human HNA⁃3a gene sequences in Genebank.The full⁃length of HNA⁃3a gene was reversely transcribed using RT⁃PCR,and cloned into pEGFP⁃N3vector.The pEGFP⁃N3expression vector containing human HNA⁃3a gene was transfected into the HEK⁃293cells for transient expression using Lipofectamine TM 2000reagent,and the expression of the target gene was identified by Western blotting.Results :The eukaryotic expression vector containing the full⁃length sequences of humanHNA⁃3a gene was successfully constructed,and the target gene was highly expressed in HEK⁃293cells.Conclusions :The eukaryotic expression vector with high expression of HNA⁃3a protein is successfully constructed,which lays the foundation for the detection of the anti⁃HNA⁃3a antibody in human plasma.[Key words ]gene expression;clone;HNA⁃3a;HEK⁃293cells 输血相关急性肺损伤(transfusion⁃related acutelung injury,TRALI)是临床输血并发的急性呼吸窘迫综合征,一般在输入血液㊁血浆及相关血制品6h 内发生,是输血相关死亡的首要原因[1-2];目前尚未引起我国广大临床医生和输血医学工作者的重视,临床上无法获得准确的诊断和及时有效的治疗㊂TRALI 的发病机制尚未完全阐明,普遍接受的抗原抗体反应学说认为,人类中性粒细胞抗原(HNA)抗体是导致TRALI 的最重要的抗体,其中针对HNA⁃3a 抗原的同种抗体常可引起致命的TRALI [3]㊂HNA⁃3a 抗原存在于粒细胞㊁血小板㊁淋巴细胞㊁内皮细胞和肾脏㊁脾脏㊁胰腺等细胞上㊂1964年VANLEEUWAN 等[4]在血清学水平鉴定到HNA⁃3a 抗原,2010年HNA⁃3a 抗原的分子基础被阐明,HNA⁃3a 抗原位于胆碱转运样蛋白⁃2(CTL⁃2)上㊂CTL⁃2蛋白是一种跨膜蛋白,由19号染色体19p13.1区域中的SLC44A2基因编码,其外显子7中的单个核苷酸替换(461G >A;Arg154Gln)导致基因多态性引起HNA⁃3系统的多样性[5]㊂因为HNA⁃3a 的免疫原性较强,有妊娠史或输血史的HNA⁃3b /3b 的纯合子个体被免疫产生HNA⁃3a 抗体的可能性较大㊂目前没有方便快捷检测人群中HNA⁃3a 抗体发生频率的实验方法,本课题克隆了人HNA⁃3a 基因,并构建pEGFPN3⁃HNA⁃3a 真核表达载体,在HEK⁃293细胞中进行瞬时表达和鉴定,为今后运用HNA⁃3a 抗原检测HNA⁃3a 抗体打下实验基础㊂1 材料与方法1.1 实验材料 HEK⁃293细胞和DH5α菌为蚌埠医学院病理生理实验室保存㊂高糖DMEM (美国Gibico 公司);胎牛血清(杭州四季青);Trizol 试剂(美国Gibico公司);PBS缓冲液(美国Solarbio公司);CO2恒温培养箱(美国Thermo Fisher Scientific 公司);真核表达载体pEGFP⁃N3㊁限制性内切酶Hin dⅢ和Kpn均购自上海吉凯基因化学技术有限公司㊂T4连接酶㊁PfuDNA聚合酶和逆转录试剂盒均购自Promega公司㊂质粒纯化试剂盒及胶回收试剂盒为上海华舜生物公司产品㊂Lipofectamine TM2000转染试剂盒为美国Invitrogen公司产品㊂鼠单克隆抗体Flag(M2⁃3165)购自Sigma⁃Aldrich公司㊂抗GADPH抗体购自天津三箭公司㊂HRP二抗购自Santa Cruz㊂1.2 方法 1.2.1 人HNA⁃3a cDNA合成和RT⁃PCR GeneBank调取表达HNA⁃3a抗原的纯合子的CDS 基因序列(SLC44A2),利用Vector NTI设计引物㊂用Trizol试剂抽提HNA⁃3a纯合子个体RNA并逆转录为cDNA,以该cDNA为模板进行PCR扩增㊂上游引物:5′⁃TTT GTT AGA CGA AGC TTG GGC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC⁃3′,在5′端引入XhoⅠ的酶切位点;下游引物:5′⁃CCG GTC GCC ACC ATG GTG AGC AAG GG⁃3′,在5′端引入KpnⅠ的酶切位点;反应条件:98℃预变性5min,98℃变性10s,55℃退火10s,72℃延伸90s,共30个循环,最后于72℃延伸8min㊂将RT⁃PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察结果㊂1.2.2 人HNA⁃3a基因真核表达质粒的构建和鉴定 PCR产物经胶回收纯化后与pEGFP⁃N3载体分别以XhoⅠ㊁KpnⅠ进行双酶切㊂将酶切后的目的基因与载体经T4DNA连接酶于4℃连接过夜,并转化DH5a菌㊂挑取阳性克隆经振荡培养后提取质粒,以XhoⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定,酶切鉴定符合的克隆送上海吉凯公司进一步测序鉴定㊂1.2.3 质粒转染HEK⁃293细胞及稳转细胞株的筛选 HEK⁃293细胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中,于37℃㊁5%CO2常规培养㊂融合取对数生长期细胞按5×105/孔接种至6孔板,每孔加入2mL DMEM,待细胞增殖融合达80%面积时进行转染㊂转染前更换Opti⁃MEM无血清培养基,转染的步骤及方法参照Lipofectamine TM2000试剂说明书,同时转染pEGFP⁃N3空载体作为阴性对照,转染48h后观察转染效率㊂按文献[6]报道方法,用0.6μm/mL G418培养基筛选阳性转染细胞㊂筛选2.5周后接种24孔板,连续稀释㊁挑选单克隆细胞扩增㊂筛选出的目的基因稳转株置于显微镜下,蓝光激发,观察绿色荧光蛋白表达情况㊂1.2.4 Western blotting检测转染后细胞中HNA⁃3a 蛋白的表达 质粒转染后第3天收集培养板中的细胞,用1%NP⁃40裂解缓冲液裂解并提取蛋白㊂利用BSA标准品绘制标准曲线后算得待测品蛋白浓度㊂配制浓度为10%的分离胶,将细胞裂解液进行SDS⁃PAGE电泳㊂电泳结束后进行转膜,将蛋白条带电转至PVDF膜上㊂用5%脱脂牛奶封闭并室温孵育1h,减少非特异性结合后,按1∶1000的比例稀释的鼠单克隆抗体Flag(C端融合Flag标签) 4℃孵育过夜㊂次日,用0.1%的PBST洗膜3次后,加入1∶5000倍稀释的二抗,室温孵育1h㊂洗膜3次后加显影液,观测蛋白条带㊂2 结果2.1 人HNA⁃3a cDNA的RT⁃PCR扩增 人HNA⁃3a基因的PCR扩增产物的凝胶电泳结果见图1,在2167bp处出现一条明亮的条带,与预期的目的基因大小相符㊂2.2 pEGFP⁃N3⁃HNA⁃3a表达质粒的构建和鉴定 PCR扩增后的片段经XhoⅠ㊁KpnⅠ双酶切后,克隆到同样经XhoⅠ㊁KpnⅠ双酶切的真核表达质粒pEGFP⁃N3中㊂转化感受态细胞后筛选出对相应抗生素具有抗性的阳性克隆,制备少量的质粒,用Xho Ⅰ和KpnⅠ双酶切鉴定重组质粒,可切出约986bp 大小的片段,同预期的结果一致(见图2)㊂阳性克隆测序结果经比对,序列完全正确,说明HNA⁃3a基因已成功克隆至pEGFP⁃N3载体中㊂2.3 pEGFP⁃N3⁃HNA⁃3质粒在HEK⁃293T细胞中的表达与鉴定 将pEGFP⁃N3⁃HNA⁃3a重组质粒和pEGFP⁃N3空载体分别转染到HEK⁃293T细胞中,转染后24h即可在荧光显微镜下观察到转染细胞中GFP荧光的表达,但表达量较少,GFP的表达量随着时间的延长逐渐增加,至72h最强(见图3)㊂Western blotting检测表明,稳转细胞株HNA⁃3a蛋白水平有表达,而未转染及转染空载体的细胞上HNA⁃3a不表达(见图4)㊂3 讨论 目前,TRALI 仍然是输血相关死亡的首要原因[1-2]㊂据美国FDA 统计显示,在2011-2015年,每年TRALI 死亡病例数占输血相关死亡人数的38%[7]㊂在已知的TRALI 的发病案例中,HNA⁃3a抗体是导致致死性TRALI 的主要原因㊂HNA⁃3a 抗原的免疫原性较强,一般由输血或妊娠产生㊂因此,采供血机构应对有妊娠史或输血史的供者血浆进行HNA⁃3a 抗体的筛查,以减少或避免TRALI的发生㊂可是由于我国国情的限制,并未像欧美等一些发达国家一样禁止使用有妊娠史或输血史的供血者血浆,同时由于种种原因我们目前不仅不了解HNA⁃3a 抗体在特定人群中的发生频率,更没有开展HNA⁃3a 的筛查工作,这就可能大大增加了TRALI 发生的概率㊂迄今HNA⁃3a 抗体的检测没有商业化的抗原可供使用,用细菌表达出的可溶性肽类运在ELISA 方法中并不能检测出目标抗体,这可能与抗原表达中的转录后糖基化修饰有关[8-9]㊂目前,国际上通用的检测HNA 抗体的方法是ISBT 工作组推荐的两种经典实验方法,分别是中性粒细胞聚集实验(GAT)和中性粒细胞免疫荧光实验(GIFT)㊂不过这两种实验在检测过程中需要从确定HNA 基因型的志愿者中分离出新鲜的粒细胞,既艰苦又耗时,不适用于常规的筛选工作[10]㊂因此,研究出一种更加简便㊁快速的HNA⁃3a 抗体检测方法对预防TRALI 具有重要的现实意义㊂BAYAT 等[11]在研究中分别构建了含不同长度HNA⁃3基因外显子的表达载体,结果显示缩短的外显子构建的载体表达的蛋白不识别HNA⁃3a 的特异性,只有全长外显子序列表达的抗原的免疫原性才能识别所有抗体㊂另WOZNIAK 等[6]也证实了这一研究,并且在SLC44A2全长序列的153㊁154㊁301位置必须为精氨酸㊁亮氨酸㊁苏氨酸,这样表达的蛋白才具有HNA⁃3a 的抗原性㊂因此,本研究将153㊁154㊁301位置分别突变为精氨酸㊁亮氨酸㊁苏氨酸的SLC44A2基因全长编码序列克隆到了pEGFP⁃N3真核表达载体中,并转染到HEK293细胞中㊂G418筛选出稳定转染的细胞株,转染后细胞的HNA⁃3a 免疫印迹结果和绿色荧光均证实了HNA⁃3a 在HEK293细胞中得到了稳定有效的表达,表明了我们成功地构建了能够稳定高效表达HNA⁃3a 的稳转细胞株,这为我们下一步研究检测血浆中的HNA⁃3a 抗体的方法打下了实验基础,从而为开展人群中HNA⁃3a 抗体筛检工作提供技术上支持㊂[参考文献][1] MCKENZIE CG,KIM M,SINGH TK,et al .Peripheral blood monocyte⁃derived chemokineblockadepreventsmurinetransfusion⁃related acute lung injury (TRALI)[J].Blood,2014,123(22):3496.[2] PETERS AL,VAN HEZEL ME,JEFFERMANS NP,et al .Pathogenesisof non⁃antibody mediated transfusion⁃related acute lung injuryfrom bench to bedside[J].Blood Rev,2015,29(1):51.(下转第13页)抗体组进行对比研究,探讨是否加入IL⁃33抗体后会加重LIRI㊂以上是本研究的两个不足之处,本课题在以后的研究中将进一步完善㊂综上所述,IL⁃33能保护小鼠LIRI,其可能机制与IL⁃33抑制IL⁃17A表达㊁从而抑制中性粒细胞浸润有关㊂[参考文献][1] ELTZSCHIG HK.ECKLE T.Ischemia and reperfusion⁃⁃frommechanism to translation[J].Nat Med,2011,17(11):1391.[2] HODZIC Z,SCHILL E M,BOLOCK AM,et al.IL⁃33and theintestine:The good,the bad,and the inflammatory[J].Cytokine,2017,100:1.[3] DRAKE LY,KITA H.IL⁃33:biological properties,functions,androles in airway disease[J].Immunol Rev,2017,278(1):173.[4] ZHU P,DUAN L,CHEN J,et al.Gene silencing of NALP3protects against liver ischemia⁃reperfusion injury in mice[J].Hum Gene Ther,2011,22(7):853.[5] CHEN J,DUAN L,XIONG A,et al.Blockade of IL⁃33amelioratesCon A⁃induced hepatic injury by reducing NKT cell activation andIFN⁃gamma production in mice[J].J Mol Med(Berl),2012,90(12):1505.[6] FREITAS MC,UCHIDA Y,ZHAO D,et al.Blockade of Januskinase⁃2signaling ameliorates mouse liver damage due toischemia and reperfusion[J].Liver Transpl,2010,16(9):600.[7] MASUDA T,IWASHITA Y,HAGIWARA S,et al.Dihydrolipoylhistidinate zinc complex,a new antioxidant,attenuates hepaticischemia⁃reperfusion injury in rats[J].J Gastroenterol Hepatol,2011,26(11):1652.[8] DUAN L,CHEN J,ZHANG H,et al.Interleukin⁃33amelioratesexperimental colitis through promoting Th2/Foxp3(+)regulatoryT⁃cell responses in mice[J].Mol Med,2012,18(18):753. [9] CAYROL C,GIRARD JP.The IL⁃1⁃like cytokine IL⁃33isinactivated after maturation by caspase⁃1[J].Proc Natl Acad SciU S A,2009,106(22):9021.[10] TALABOT⁃AYER D,LAMACCHIA C,GABAY C,et al.Interleukin⁃33is biologically active independently of caspase⁃1cleavage[J].J Biol Chem,2009,284(29):19420. [11] LUTHI AU,CULLEN SP,MCNEELA EA,et al.Suppression ofinterleukin⁃33bioactivity through proteolysis by apoptoticcaspases[J].Immunity,2009,31(1):84.[12] SEKI K,SANADA S,KUDINOVA AY,et al.Interleukin⁃33prevents apoptosis and improves survival after experimentalmyocardial infarction through ST2signaling[J].Circ Heart Fail,2009,2(6):684.[13] SAKAI N,VAN SWERINGEN HL,QUILLIN RC,et al.Interleukin‐33is hepatoprotective during liver ischemia/reperfusion in mice[J].Hepatology,2012,56(4):1468. [14] LUO Y,ZHOU YQ,XIAO W,et al.Interleukin⁃33amelioratesischemic brain injury in experimental stroke through promotingTh2response and suppressing Th17response[J].Brain Res,2015,9(1597):86.[15] KONO H,FUJII H,OGIKU M,et al.Role of IL⁃17A in neutrophilrecruitment and hepatic injury after warm ischemia⁃reperfusionmice[J].J Immunol,2011,187(9):4818.[16] AKCAY A,NGUYEN Q,HE Z,et al.IL⁃33exacerbates acutekidney injury[J].J Am Soc Nephrol,2011,22(11):2057. [17] DUAN L,WANG CY,CHEN J,et al.High⁃mobility group box1promotes early acute allograft rejection by enhancing IL⁃6⁃dependent Th17alloreactive response[J].Lab Invest,2011,91(1):43.(本文编辑 刘畅)(上接第8页)[3] DAVORAN A,CURTIS BR,SHULMAN IA,et al.TRALI due togranulocyte⁃agglutinating human neutrophil antigen⁃3a(5b)alloantibodies in donor plasma:a report of2fatalities[J].Transfusion,2003,43(5):641.[4] VAN LEEUWEN A,EERNISSE JG,ROOD JJ.A New LeucocyteGroup with Two Alleles:Leucocyte Group Five[J].VoxSanguinis,1964,9:431.[5] STORCH EK,HILLYER CD,SHAZ BH.Spotlight on pathogenesisof TRALI:HNA⁃3a(CTL2)antibodies[J].Blood,2014,124(12):1868.[6] WOZNIAK MJ,BOWRING C,LUCAS G,et al.Detection ofHNA⁃3a and HNA⁃3b antibodies using transfected cell lines andrecombinant proteins[J].Transfusion,2012,52(7):1458. [7] FDA.Fatalities reported to FDA following blood collection andtransfusion:annual summary for fiscal year2015.[8] BERTHOLD T,WESCHE J,KUHNERT K,et al.Epitopemapping of antibodies directed against the human neutrophilalloantigen3a[J].Transfusion,2011,51(10):2160. [9] CURTIS BR,SULLIVAN MJ,HOLYST MT,et al.HNA⁃3a⁃specific antibodies recognize choline tranporter⁃like protein⁃2peptides containing arginine,but not glutamine at Position154[J].Transfusion,2011,51(10):2168.[10] KANACK AJ,PETERSON JA,SULLIVAN MJ,et al.Full⁃lengthrecombinant choline transporter⁃like protein2containing arginine154reconstitutes the epitope recognized by HNA⁃3a antibodies[J].Transfusion,2012,52(5):1112.[11] BAYAT B,TJAHJONO Y,WERTH S,et al.Implication oftransfected cell lines for the detection of alloantibodies againsthuman neutrophil antigen⁃3[J].Transfusion,2012,52(3):613.(本文编辑 刘璐)。
CD真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达
CD真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达张巨峰;韦芳;李惠明;黄陈;于慧;裘玮;黄倩【期刊名称】《现代生物医学进展》【年(卷),期】2006(006)010【摘要】目的:构建含自杀基因胞嘧啶脱氨酶(CD)的真核表达载体pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z-CD,并进行哺乳动物细胞HEK293转染研究.方法:以本实验室保存的含CD基因全长的质粒为模版,用PCR方法扩增CD基因阅读框序列,并定向克隆到带有HAtag的pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z载体上,使目的基因与HAtag在同一阅读框.重组体质粒经EcoRI和BamHI双酶切鉴定,并对插入的CD基因片段进行测序,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z-CD 用脂质体介导转染HEK293,提取细胞蛋白,western blot检测CD基因的表达情况.结果:阳性重组质粒pcDNA3.1/HA-myc-His(-)Z CD经EcoRI和BamHI双酶切后,获得约为5.5kb片段和1.3kb插入片段,序列分析表明插入的片段与GenBank 发布的序列一致,western blot检测到CD基因的表达.结论:成功构建了含自杀基因CD的真核表达质粒.【总页数】3页(P11-13)【作者】张巨峰;韦芳;李惠明;黄陈;于慧;裘玮;黄倩【作者单位】上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院普外科,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080;上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.pcDNA3.1/eIF5A真核表达载体的构建及其在真核细胞CCRF-CEM中的表达[J], 朱金武;钱之玉;关勇彪2.SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达 [J], 罗天霞;樊红琨;芮丹丹;孙佳翕;马小芳;章茜3.人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达 [J], 李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明4.牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 庞峰;史巧芸;朱华培;徐开莲;赵天靖;李亚颖;彭冬梅;李国华;周海龙5.pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达 [J], 徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达
人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达林月霞;吴志坚;袁茵;董斌;田素娟【摘要】Objective To construct eukaryotic expressing vector of human heparanase (HPA ) gene ,pEGFP-NX/HPA and test its expression in 293T cells. Methods pOTPl/HPA plasmid used as a template, HPA cDNA was amplified by PCR and digested by restriction enzyme. Then the gene segment was inserted into pEGFP-N vector and identified by restriction enzyme digestion as well as by DNA sequencing. Subsequently, the recombinant pEGFP-Nl/HPA plasmid was transfected into 293T cells with Iipofectamine2000. Results The sequence of pEGFP-Nl/HPA vector was confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. There were two genetic mutations at 771 bp and 919 bp. But both of mutations belonged to samesense mutations. After transfection at 48 h, the expression of green fluorescent protein was present. Conclusion The recombinant vector pEGFP-N/HPA has been successfully constructed and expressed in 293T cells.%目的构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmine2000为介导转染至293T细胞中,观察该基因在293T细胞中的表达情况.结果经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1/HPA基因在771 bp处碱基c突变成t；在919 bp处碱基a突变成g,两处突变均为同义突变.该基因转染293T细胞48 h后,在荧光显微镜下可见转染的293T细胞有绿色荧光蛋白表达.结论成功构建人乙酰肝素酶基因的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,并在人293T细胞中成功表达.【期刊名称】《广东药学院学报》【年(卷),期】2011(027)004【总页数】3页(P427-429)【关键词】人乙酰肝素酶基因;真核表达载体;转染【作者】林月霞;吴志坚;袁茵;董斌;田素娟【作者单位】广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q785近年来研究[1-2]表明，乙酰肝素酶(HPA)与肿瘤的转移有极为密切的相关性，通过抑制乙酰肝素酶可以阻止肿瘤细胞的转移，提示乙酰肝素酶可成为肿瘤转移治疗的新靶点。
pSNAV_2-CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达
pSNAV_2-CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达魏见伟;王德春;胡有谷【期刊名称】《青岛大学医学院学报》【年(卷),期】2007(43)5【摘要】目的构建含人结缔组织生长因子(CTGF)的腺相关病毒(AAV)表达载体,并观察其在人胚肾293(HEK293)细胞中的表达。
方法以含有人CTGF基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板,应用PCR克隆出CTGF基因,采用分子克隆的方法把CTGF克隆到AAV表达载体pSNAV2.0上构建重组质粒pSNAV2-CTGF。
把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光法对重组质粒目的蛋白的表达进行研究,MTT 法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性。
结果成功构建完全正确的CTGF基因序列的AAV表达载体pSNAV2-CTGF,将其转染HEK293细胞后,免疫荧光检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性。
结论成功构建了真核表达载体pSNAV2-CTGF,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的CTGF蛋白。
【总页数】4页(P377-379)【关键词】结缔组织生长因子;腺相关病毒;质粒;基因转染;椎间盘【作者】魏见伟;王德春;胡有谷【作者单位】青岛大学医学院附属医院脊柱外科【正文语种】中文【中图分类】R68;R37-33【相关文献】1.人胚肾293细胞中乙酰转移酶p300对二甲基精氨酸二甲胺水解酶2基因表达的调节 [J], 李英慧;李家亓;孙陆;初国铭;孙志军2.戊型肝炎病毒ORF2基因在人胚肾293细胞中的表达 [J], 张强;高正琴;周育森;贺争鸣;吴昊3.GFP基因真核表达质粒的构建及其在人胚肾293细胞中的表达 [J], 李德良;马文丽;师永霞;李凌;郑文岭4.重组人pEGFP-C2-NPHS2表达载体的构建及其在人胚胎肾293细胞中的表达[J], 沙玉根;赵非;张爱华;黄松明5.整合素β4结合蛋白与P311在人胚肾293细胞中的表达及共定位 [J], 易绍萱;袁顺宗;马兵;贺伟峰;陈希炜;胡晓红;张小容;彭旭;周丽娜;罗高兴;吴军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用基因工程技术构建人WWP2基因的真核表达载体
利用基因工程技术构建人WWP2基因的真核表达载体雷子宸[1];刘姿[2];马亮[2]【期刊名称】《九江学院学报：自然科学版》【年(卷),期】2018(033)001【摘要】目的构建E3泛素连接酶WWP2基因的真核表达载体,并鉴定其表达。
方法利用PCR扩增技术扩增人WWP2基因的编码序列,把WWP2基因插入酶切后的pcDNA3.1-Flag空载体,用PCR法、酶切法及基因测序的方法检测重组质粒的正确性,然后将所构建质粒pcDNA3.1-Flag-WWP2转染入人胚肾细胞HEK293T 中,并利用免疫印记法检测其表达情况。
结果pcDNA3.1-Flag-WWP2真核表达载体构建成功,且能实现在HEK293T细胞中的表达。
结论文章成功构建了带Flag标签的人WWP2真核表达载体,为后续的WWP2基因功能以及作为肺癌治疗新靶点的可行性研究奠定了基础。
【总页数】4页(P74-77)【作者】雷子宸[1];刘姿[2];马亮[2]【作者单位】[1]安徽省马鞍山市第二中学;;[2]安徽工业大学化学与化工学院安徽马鞍山243000;;[2]安徽工业大学化学与化工学院安徽马鞍山243000【正文语种】中文【中图分类】R789【相关文献】1.PCR克隆技术构建抑癌基因NOEY2真核表达载体 [J], 施宗高;许良中;药锦娟;杨文涛;朱伟萍2.利用基因工程技术构建人WWP2基因的真核表达载体 [J], 雷子宸;刘姿;马亮3.利用基因工程技术构建重组人血小板因子4真核表达载体 [J], 陈衍;杨岚;朱帮福;纪宗玲;陈苏民;任军4.利用同源重组技术构建DKK1、BMP4真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究 [J], 张梦瑶;杨峰;刘开东;刘积凤;贺建宁;柳楠5.利用同源重组技术构建Hoxa5、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达[J], 李晶;张梦瑶;刘开东;柳楠;贺建宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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ＡＰＭ】是单拷贝基因，长约１７ ｋｂ，由３个外显子 和２个内含子组成。３个外显子分别长１８、２２２和 ４ ２７７ ｂｐ，其上含有可识别的剪切位点；２个内含子分 别长约０．８和１２ ｋｂ。人体内的脂联素由２４４个氨基 酸组成，相对分子质量为３０ ０００，共有３个区域：氨基 端信号肽序列（ａａ ｌ—１８）、胶原样结构域（ａａ １９—１０７）和 羧基末端的球形结构域（ａａ １０８—２４４）。人脂联素基因 定位于３ｑ２７，全基因组扫描显示该区域存在２型糖尿 病和代谢综合征的易感位点，也是冠状动脉疾病的候 选位点。脂联素的水平降低与多种动脉硬化相关性疾 病或综合征有关，如糖尿病、血脂紊乱、内皮细胞功能 障碍、高血压和肥胖。２型糖尿病患者血中脂联素水 平低于有动脉粥样硬化危险的因素（如肥胖、高血压、 年龄、家族史、吸烟、脂代谢紊乱）但未患糖尿病的患 者。控制良好的糖尿病患者血中脂联素水平高于控制 不佳的患者，因此，脂联素可作为具有动脉粥样硬化高 危险因素的患者代谢控制的一个指标。７１。
图１
Ｆｉｇ ｌ
质粒与插入片段连接处的测序图谱
Ｐａｒｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐＣＤＥＦ—ＡＰＭｌ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
六、ｐＣＤＥＦ－ＡＰＭｌ转染ＨＥＫ２９３细胞 用含１０％ＦＢｓ的ＤＭＥＭ高糖培养基培养ＨＥＫ２９３ 细胞，让其生长良好。按１×１０５个细胞／孑Ｌ接种于无 菌６孑Ｌ板中，在转染前１ ｄ换液，加入２ ｍｌ培养基，待 细胞生长至６０％～７０％融合时。按试剂盒推荐的优 化条件进行转染，２４ ｈ后加入２ ｍ１培养基（含Ｏ．５％ ＦＢｓ），４８ ｈ后检测转染效率，收集细胞上清。 七、ＥＬＩＳＡ法检测脂联素表达水平
ｇｃｃｔｃｔａａｇｇｃｃＴＣＡＧ’Ｉ丫ＦＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧ—
ｃＣＴ。以ｐＧＥＭ—Ｔ—ＡＰＭｌ质粒为模板进行ＰｃＲ反应， 目标产物为两端带有Ｓ６ Ｉ酶切位点的全长型人脂联 素基因。反应体系（５０¨１）：１０×缓冲液（５斗１）；４× ｄＮＴＰ（２卜Ｌ１）；ａｍｐｌｆ（１０斗ｍｏｌ／Ｌ）２斗ｌ；ａｍｐｌ ｒ（１０斗ｍｏＬ／ Ｌ）２斗ｌ；ｄｄＨ２０ ３８．５斗ｌ；模板５０ ｎｇ；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶５ ｕ。反应条件：９５℃预变性５ ｍｉｎ；然后９５℃变性３０ ｓ， ５８℃退火４５ ｓ，７２℃延伸２ ｍｉｎ，反应２５个循环；最后 ７２℃再延伸ｌｏ ｍｉｎ。ＰｃＲ产物经１．ｏ％琼脂糖凝胶电 泳分析后，用ＰＣＲ纯化试剂盒进行纯化、回收。
结果
用所设计合成的一对引物从质粒ｐＧＥＭ．Ｔ·ＡＰＭｌ 上成功扩增出７５０ ｂｐ左右的两端带有ｓ６ Ｉ酶切位点 的ＡＰＭｌ片段，与理论值相符。ＰｃＲ产物用ＰｃＲ纯化
万方数据
图３ ｐＣＤＥＦ．ＡＰＭｌ转染ＨＥｌ（２９３细胞（生长良好） Ｆｉｇ ３ ＨＥＩ（２９３ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｃＤＥＦ／ＡＰＭｌ（ｇｒｏｗ ｗｅｌｌ）
ＤＮＡ ｒｅｃｏＨ幽ｎ粕ｔ ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｘｐ陀ｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ＤＣＤＥＦ．ＡＰＭｌ
ｉｎｔｏ ＨＥＫ２９３ ｃｅｕｓ
ｒｅａ鼯ｎｔ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｈｕＩｎａｎ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｐｅｍ砒ａｎｔ ｏｆ ｃｅＵ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｕｂｌｅ
基金项目：国家自然科学基金（３０３７０６７０，３００７０３５６） 作者单位：４０００１６重庆医科大学附属第一医院 通讯作者：邓华聪，Ｅｍａｉｌ：ｄｅ“ｇ－ｈｕａｃｏｎｇ＠ｙ８Ｉ１００．ｃｏｍ．ｃｎ
材料和方法
一、主要试剂 ｐＧＥＭ—Ｔ－ＡＰＭｌ质粒的构建由本课题组完成，测序 结果与ＧｅｎＢａｎｋ发表的资料一致；ＤＨ５仪菌和ＨＥＩ（２９３ 细胞由第三军医大学野战外科研究所七室保存。ＰＣＲ 引物（Ｔａｋａｒａ）；Ｔ载体和ＰＣＲ酶（Ｐｒｏｍｅｇａ）；胶回收试 剂盒（ＱＩＡＧＥＮ）；Ｓｆｉ Ｉ限制性内切酶（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；快速连接试剂盒（Ｆｅｎｎｅｎｔａｓ）；胎牛血清 （ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）；ＤＭＥＭ高糖培养基（Ｇｉｂｃｏ）；高纯度质 粒抽提试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ＰｃＲ产物纯化试剂盒 （Ｏｍｅｇａ）；转染试剂（ＱＩＡＧＥＮ）；人脂联素ＥＬＩＳＡ检测 试剂盒（Ｒ＆Ｄ）；ｐＣＤＥＦ质粒（上海交通大学生命科学 技术学院）；序列分析（上海鼎安生物科技有限公司）。 二、ＰＣＲ扩增ＡＰＭｌ
三、ＰＣＲ产物亚克隆到Ｔ载体 将纯化的ＰＣＲ产物与Ｔ载体用快速连接试剂盒
试剂盒纯化后，连接到Ｔ载体，通过蓝白斑筛选出阳 性克隆。含有ＡＰＭｌ的Ｔ载体和空载体ｐｃＤＥＦ一起 用ｓ６ Ｉ酶切后获得７５０ ｂｐ左右的ＡＰＭｌ片段和大于 ５ ｋｂ左右的ｐＣＤＥＦ片段，与理论值相符。挑取的４个 克隆抽提质粒后，ＰｃＲ均扩增出７５０ ｂｐ左右的ＡＰＭｌ 片段，与理论值相符，而对照质粒则只扩增出了引物二 聚体，提示挑取的４个克隆均为阳性克隆。双向测序 结果表明送测的两个质粒序列完全正确，与ＧｅｎＢａｎｋ 报道的ＡＰＭｌ（ＧＩ：８７１８８６）序列一致，质粒与插入片段 连接处的测序图谱见图ｌ，显示阅读框正确。
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·基础研究·
人脂联素基因真核表达载体的构建 及在ＨＥＫ２９３细胞中的表达
李丙蓉邓华聪 兰丽珍郑宏庭刘金波
【摘要】 目的构建人脂联素（ＡＰＭｌ）基因真核表达载体，并检测其在ＨＥｌ（２９３细胞中的表达水平。 方法用ＰｃＲ法从测序正确的ｐＧＥＭ—Ｔ．ＡＰＭｌ质粒上，扩增出两端带有踮Ｉ酶切位点的人脂联素基因， 再将扩增出的片段亚克隆到Ｔ载体上，用踮Ｉ酶切Ｔ载体和ｐｃＤＥＦ空载体，将酶切后的片段进行连接、 转化、筛选、鉴定、测序。将成功构建的ｐｃＤＥＦ—ＡＰＭｌ质粒转染ＨＥＫ２９３细胞，ＥｕｓＡ检测培养上清中脂联 素的水平。结果 构建的ｐｃＤＥＦ．ＡＰＭｌ质粒能有效转染ＨＥＫ２９３细胞，并在培养上清中检测到较高水平 的脂联素蛋白。结论成功地构建了人脂联素基因的真核表达载体，并在ＨＥＫ２９３细胞中获得高效表达。
哺乳动物的脂联素一旦合成，经过翻译后羟基化 和糖基化修饰形成８种亚型。其中６种亚型是糖基化 的，胶原结构域内的６８、７ｌ、８０和１０４位的赖氨酸残 基，９４位的脯氨酸残基是氧连接的糖基化位点¨ｏ。糖 基化的脂联素作为胰岛素增敏剂的效应远远强于细菌 合成的非糖基化的脂联素，提示脂联素翻译后的修饰 对其发挥最佳的生物学活性是必需的。由于哺乳动物 细胞可以对表达的真核蛋白进行翻译后加工修饰，包 括：二硫键形成，多聚化，蛋白酶加工，适当的糖基化以 及在分子伴侣的作用下正确折叠。因而，构建真核表 达载体，并在真核系统中表达人脂联素蛋白，将为进行 脂联素蛋白的纯化、鉴定和制备，以及鉴定单克隆抗体 和进行脂联素的功能研究奠定基础。
ｔｍｎｓｆｅｃｔｅｄ’１，ｉｔｈ ｐＣＤＥＦ．ＡＰＭｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ；ｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ；Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｕｓ
（劬ｉｎ．，Ｅ蒯。硎加Ｚ胁￡０６。２００６．２２：４６４＿４６６）
２９３ ｃｅＵｓ
Ⅱ
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【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ７ｒｏ ｃ０Ｉｌｓｔｍｃｔ ａｎ ｅｕｋ８ｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｈｕｍ蛐８ｄｉｐｏｓｅ ｍｏｓｔ ａｂｕｎｄａｎｔ
用蹦ｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计两端带有ｓ６ Ｉ酶
万方数据
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进行连接，取连接反应产物３斗ｌ转化感受态细胞 ＤＨ５仪，并和ＩＰＴＧ、ｘ—Ｇａｌ一起混合涂布在氨苄青霉素 抗性的ＬＢ平板上，３７℃培养过夜。分别挑５个白色 单菌落到５支５ ｍ１氨苄青霉素抗性的培养管中３７℃ 摇床过夜培养。用０ｍｅｇａ质粒抽提试剂盒提取质粒。
四、酶切、连接 含有ＡＰＭｌ的Ｔ载体和载体ｐｃＤＥＦ一起用ｓｆｉ Ｉ 酶切。电泳后用ＱＩＡＧＥＮ胶回收试剂盒回收ＡＰＭｌ和 ｐｃＤＥＦ载体，连接并转化到ＤＨ５仅感受态细胞涂板 （氨苄青霉素抗性）培养。 五、特异性ＰＣＲ鉴定阳性克隆 挑取４个克隆和一个阴性对照克隆（来源于载体 自连板），加入ＬＢ培养基培养。用基因特异的５’端引 物和载体特异的３ ７端引物ＰｃＲ鉴定挑取的克隆。取 其中两个阳性克隆抽提质粒送测序。
【关键词】脂联素；克隆，分子；基因表达；真核细胞
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ＨＥＫ２９３细胞的转染效率约为６０％，对照质粒转 染ＨＥＫ２９３细胞后表达荧光蛋白的情况见图２。 ｐｃＤＥＦ—ＡＰＭｌ转染ＨＥＫ２９３细胞后，细胞生长良好，见 图３。
ＥＬＩｓＡ法检测结果显示，转染真核表达载体 ｐｃＤＥＦ／ＡＰＭｌ的ＨＥＫ２９３细胞上清液中人脂联素蛋 白质浓度为（１５０±１２）¨∥Ｌ，而其余对照组均未检测 到脂联素蛋白。
Ｆｉｇ ２
图２表达ＧＦＰ的对照质粒转染ＨＥｌ＜２９３细胞