各种表达载体
表达载体名词解释
表达载体名词解释
载体是指承载或传递某种信息、物质或功能的任何媒介、器具或组织形式。
在不同领域中，载体的类型和特征也不尽相同。
以下是一些常见领域的载体：
1.生物学中，载体通常指承载遗传信息并传递给后代的DNA或RNA 分子；或者指传播病菌或病毒的生物体或物质。
2.化学中，载体可以是纳米材料、分子筛、药物递送系统等，用于输送分子或化合物，提高药物的效果或减少不良反应。
3.通信技术中，载体是指用于传输声音、图像、数据等信息的信号媒介，如光纤、无线电波、互联网等。
4.文化传播中，载体可以是文学、音乐、电影、艺术品等，用于传达思想、文化、美学价值等。
5.商业中，载体可以是广告、促销活动、商标等，作为产品或服务的宣传和推广手段，吸引消费者。
考虑到载体的多样性和变化性，有时需要同时考虑载体和信息、物质或功能之间的相互作用和影响，更好地理解和应用它们。
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
植物表达载体构建
植物基因工程常用的报告基因
指其编码产物能够被快速地测定、常用 来判断外源基因是否已经成功地导入寄 主细胞（器官或组织）并检测其表达活 性的一类特殊用途的基因。
作为报告基因的条件
在转化的寄主细胞中应不存在相应的内 源等位基因的活性，
其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而 且还应具有快速、灵敏、定量和可重复 的检测特性。
检测方法
用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性
组织化学染色定位法
该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，
cells).
Left, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体 真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
真核表达载体
真核细胞常见表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
表达型载体
表达型载体2009-3-5 15:36:02前面已经介绍了基因工程中常用的几种载体系统，包括质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体和M13克隆载体等等。
这些载体都由三个基本组成部分——复制基因、选择标记基因和克隆位点组成。
只要具备这三个部分，就可以在基因工程中大显身手。
为了使这些载体更有利于外源DNA片段插入后的筛选工作，不断地引进优秀的选择标记基因，使重组载体分子导入寄主细胞后，寄主细胞可以迅速地表现出抗药性、颜色变化或者其它的表型特征的改变。
为了DNA操作更方便，不断地将克隆位点由单限制酶位点发展成多克隆位点，更有甚者，将克隆位点区的整个核苷酸序列方向变成相反方向，制造出一对一对仅仅只是多克隆位点区取向相反的载体体系。
大部分的改良工作几乎都围绕这几个方面。
但是我们讨论的，仅仅限于用这些载体在较短的时间内获得大量的DNA片段。
至于能否获得基因产物，得到基因编码的蛋白质产物，基本上尚未涉及。
获得基因，除为了分析这个基因外，另外一个重要目的是为了利用这个基因获得这个基因的产物，这需要使该基因实现表达，这正是本节讨论的内容。
1．基因表达的基本过程在这里所指的基因表达过程是指遗传信息从DNA到蛋白质的整个过程。
从“基因与基因工程”一章中已经知道，这也是中心法则所描述的遗传信息流的过程，它包括转录和转译两大阶段。
转录是基因表达的第一步，是遗传信息从DNA分子转移到RNA分子的过程。
实质上就是RNA分子的生物合成过程。
转录过程是以DNA分子中的一条转录链为模板，在RNA聚合酶的催化作用下进行的一系列的RNA 的合成反应。
在“基因与基因工程”一章中我们提到过基因结构。
如果我们把乳糖操纵子结构简单化，可以把它看成由5′端的操纵子结构和随后的基因编码区两大部分组成。
基因编码区对应着蛋白质的各个氨基酸。
5′端的操纵结构是基因的非编码区，对基因表达过程起着重要的控制作用。
它主要由操纵子和启动子组成，又叫做启动子区。
转录的过程恰如一场“田径赛”。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
毕赤酵母常用表达载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
植物表达载体及有关载体质谱图
pCAMBIA super1300-GFP, pCAMBIA super 1300-EGFP，
pCAMBIA1390-GFP
• 3.农杆菌：LBA4404，EHA103、105，GV3101
2、其他植物载体
• 4. pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-RFP , pRTL2-YFP
• 5. pH7FWG2，pH7WGF2 6. pK2GW7
• 7. pBGWFS7
• 10. pHANNIBAL
8. pIFGW7
11. pKANNIBAL
9. pFGC5941
12. pDONR221，
• 13. pART27
14. pPD49.83
15. pBIN-GFP，
• 16. pPZP212, pPZP2121；pPZP212-GFP
二、载体信息
• 1. pBI121质粒图谱及载体信息
启动子：CaMV35S 终止子：Nos 报告基因：GUS 抗性基因：NptII
pBI121
2. pBI221
3.pCAMBIA系列载体
• pCAMBIA1300无gus报告基因； • pCAMBIA2301以gus基因作为报告基因； • pCAMBIA1303以gus基因作为报告基因，且 pCAMBIA1303载体含有绿色荧光蛋白GFP的报告 基因；
植物表达载体表达载体原核表达载体真核表达载体的构建双元表达载体真核表达载体如何构建表达载体构建表达载体过表达载体超表达载体
植物表达载体
一、植物表达载体的分类 二、其中常用载体的载体信息
1、常用植物表达载体
基因载体名词解释
基因载体名词解释基因载体是指能够携带外源DNA进入细胞并使其复制繁殖的分子，通常是一种圆形、线性或环形的DNA分子。
基因载体在基因工程和生物技术中扮演着非常重要的角色，可以被用于DNA序列的克隆、表达和传递等方面。
下面是一些常见的基因载体名词解释：1.质粒（Plasmid）质粒是一种环形DNA分子，通常存在于细菌和酵母等微生物细胞内。
质粒可以被用作基因工程的载体，通过插入外源DNA序列来实现基因克隆和表达。
2.噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌细胞内的病毒，可以感染并复制繁殖在细菌细胞内。
噬菌体可以被用作基因工程的载体，通过插入外源DNA 序列来实现基因克隆和表达。
3.表达载体（Expression Vector）表达载体是一种专门用于外源基因表达的基因载体，通常包含有启动子、转录终止子、选择标记等功能元件，可以实现对外源基因的高效表达。
4.病毒载体（Viral Vector）病毒载体是一种基因载体，可以将外源基因导入宿主细胞中，并利用病毒的自身复制机制实现外源基因的表达。
病毒载体可以用于基因治疗、基因疫苗等方面。
5.贝壳素粒子（Shell Vial Particle）贝壳素粒子是一种基于病毒样颗粒（VLP）的基因载体，可以用于疫苗研究和制备。
贝壳素粒子在疫苗制备中具有很高的应用价值，可以实现对多种病原体的有效预防和控制。
6.人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是一种基因载体，可以模拟自然染色体的结构和功能，用于基因治疗、基因修复等方面。
人工染色体可以携带大量的外源DNA序列，并实现稳定的遗传转移和表达。
7.负载（Payload）负载是指基因载体中携带的外源DNA序列，通常包括了目标基因、选择标记、报告基因等。
负载的设计和选择对于基因工程的成功非常关键，需要考虑到载体的适应性、表达效率、稳定性等因素。
8.选择标记（Selection Marker）选择标记是指基因载体中用于筛选转化细胞的标记基因，通常包括了抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
克隆载体与表达载体
分类
结构组成及表达兀件
特点或优点
备注
质 粒 表 达 载 体
原核表达载 体
1启动子、
2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干
扰载体的稳定性）
（1）基因组大小；去除非必需区，建立 外源DNA片段的克隆或替换位点（2） 在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ基因；基因cl失活（cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型人 噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型， 称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏 感）
YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核 细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中 繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力
5
色
体
细菌人工染色体 载体
BAC
是基于大肠杆菌 的F质粒构建 的，高通量低拷 贝的质粒载体
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标 记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子） 的严谨型控制的复制子oriS（Shizuya et al.
主要使用EcoR I
ColEl
天然质粒，属松弛型多拷贝型
6.3 kb
大肠杆菌素（colicin） E1和对E1免疫的 基因（immE1）
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1 （ColE1-），但仍然 表现出对E1免疫型（皿1^1+）
pBR322
兀件来源①复制起点orip
酵母人工染 色体载体YAC细菌人工染 色体载体BAC
P1噬菌体人 工染色体载 体PAC
质粒载体总结
质 粒 载 体
类型
长度
选择标记
克隆位点
pSC101
质粒载体种类
质粒载体种类质粒载体是分子生物学实验中常用的工具，用于在细胞中携带外源DNA序列，并实现其在细胞内的复制和表达。
根据其结构和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型。
本文将介绍常见的几种质粒载体及其特点。
一、表达质粒载体表达质粒载体是常用的质粒载体类型之一，用于外源基因的表达。
其中，pUC18是常用的表达质粒载体，其大小为2686bp，含有多个重要的功能元件。
例如，pUC18包含了抗生素耐受基因，如AmpR基因，使得细菌能够在含有抗生素的培养基上生长。
此外，pUC18还包含了启动子、终止子和复制起始位点等重要序列，能够实现外源基因在细菌中的高效表达。
二、克隆质粒载体克隆质粒载体是用于基因克隆的质粒载体类型。
pBluescript II KS+是常用的克隆质粒载体，其大小为2960bp。
pBluescript II KS+含有多个克隆位点，如多克隆位点（MCS），能够方便地进行DNA片段的插入和克隆。
此外，pBluescript II KS+还包含了T7和T3启动子，使得插入的DNA片段能够通过转录和转录后修饰的方式进行进一步研究。
三、RNA干扰质粒载体RNA干扰质粒载体是用于RNA干扰实验的质粒载体类型。
pSUPER是常用的RNA干扰质粒载体，其大小为3144bp。
pSUPER含有特定的siRNA序列，能够通过RNA干扰技术抑制特定基因的表达。
此外，pSUPER还包含了启动子和选择性标记基因，使得转染细胞后能够通过选择性培养基筛选出抑制特定基因表达的细胞株。
四、双杂交质粒载体双杂交质粒载体是用于蛋白质相互作用研究的质粒载体类型。
pGBKT7和pGADT7是常用的双杂交质粒载体，分别用于检测靶蛋白的DNA结合活性和激活活性。
pGBKT7和pGADT7含有启动子、选择性标记基因和多克隆位点等重要元件，能够实现蛋白质相互作用的检测和分析。
五、表面显示质粒载体表面显示质粒载体是用于细胞表面展示外源蛋白的质粒载体类型。
质粒载体种类
质粒载体种类质粒载体是在基因工程和分子生物学研究中广泛应用的一种工具，它可以用来携带和传递外源基因。
根据其特性和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型，下面将介绍几种常见的质粒载体。
1. 表达质粒载体表达质粒载体是用于表达外源基因的载体。
它通常包含一个启动子、一个编码区和一个终止子。
启动子可以使外源基因在宿主细胞内得到转录和翻译，编码区则包含了外源基因的编码序列，终止子用于终止翻译过程。
常用的表达质粒载体包括pUC19、pET28a等。
这些载体具有高拷贝数和广谱宿主范围的特点，适用于大多数细菌和酵母的表达。
2. 克隆质粒载体克隆质粒载体用于将外源DNA片段克隆到质粒中。
它通常包含一个多克隆位点，用于插入外源DNA片段，以及一些选择标记，如抗生素抗性基因。
常见的克隆质粒载体有pGEM-T、pBluescript 等。
这些载体具有较高的拷贝数和较大的插入容量，适用于DNA 片段的克隆和扩增。
3. RNAi质粒载体RNAi质粒载体用于介导RNA干扰（RNA interference）。
它通常包含一个RNAi导体，其中包含外源基因的靶向序列，以及一个RNAi表达序列。
外源基因的靶向序列可以与目标基因的mRNA相互配对，从而介导其降解或抑制其翻译。
常见的RNAi质粒载体有pSUPER、pLKO等。
这些载体具有较高的RNAi效率和较强的基因沉默能力，适用于基因功能研究和基因治疗。
4. 荧光蛋白质粒载体荧光蛋白质粒载体用于表达荧光蛋白基因，常用于研究基因的表达和定位。
它通常包含一个荧光蛋白基因，如绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP），以及一个启动子和终止子。
外源基因的表达可以使细胞或生物发出荧光信号，从而实现基因的可视化。
常见的荧光蛋白质粒载体有pEGFP、pRSET等。
这些载体具有较高的表达效率和较强的荧光信号，适用于细胞标记和蛋白定位等研究。
5. 敲入质粒载体敲入质粒载体用于将外源DNA片段整合到宿主基因组中。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体载体是基因工程中常用的一种工具，用于将外源基因导入宿主细胞中并进行表达。
常见的载体有质粒、病毒和人工染色体。
本文将分别介绍这三种载体的特点、用途和优缺点。
1. 质粒：质粒是圆形、双链DNA分子，广泛应用于基因工程中。
质粒的构建相对简单，可以通过DNA重组技术来插入外源DNA 片段。
质粒通常包含由宿主细胞识别的来源于细菌或酵母的起源序列，以实现在细胞中的复制和维持。
此外，质粒上还包含选择性标记基因和表达调控元件，以便筛选和调控目标基因的表达。
质粒在基因工程中有着广泛的应用。
首先，质粒载体可以在大肠杆菌等常见细菌中表达外源基因，用于重组蛋白的产生和纯化，或进行功能研究。
此外，质粒也可以构建用于植物和动物细胞的转染，用于基因转导和基因治疗等领域的研究。
质粒的优点在于构建简单，易于操作，并且可以在多种细胞中进行表达。
然而，质粒的转染效率较低，不适合大规模基因转导。
此外，在某些细胞中，质粒的稳定性较差，易丧失外源基因。
2. 病毒：病毒是一类依赖于细胞代谢活动的生物体，可以将外源基因导入宿主细胞并进行复制和表达。
常见的基因工程病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腱实病毒等。
病毒载体的主要特点是高效的基因转导能力和细胞特异性。
由于病毒依赖于细胞进行复制和表达，因此病毒载体能够实现高效转导和表达目标基因。
此外，病毒载体还可以通过选择性修饰病毒表面蛋白来实现对特定细胞的特异性转染，进一步提高基因转导效率。
病毒载体被广泛应用于基因治疗和基因敲除等研究领域。
在基因治疗中，病毒载体能够将替代基因导入患者细胞中，以治疗某些遗传性疾病。
在基因敲除中，病毒载体则可以导入携带某种特殊序列的DNA片段，进而敲除靶基因。
然而，病毒载体也存在一些限制。
首先，病毒复制过程中可能引起细胞毒性反应，对细胞造成伤害。
其次，病毒载体的构建和生产相对复杂，需要严格的无菌操作和关键的质控步骤。
3. 人工染色体：人工染色体是一种合成的染色体模拟体，可用于将大片段基因组DNA导入宿主细胞中。
克隆载体与表达载体介绍
（二）质粒载体的构建
天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：
（1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点
（MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。
（三）常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体
2. pUC18和pUC19质粒载体
3. TA载体
二、噬菌体载体
（一） λ 噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质
λ噬菌体Βιβλιοθήκη 外壳蛋白 线性，全长48502bp
λDNA 5’端含12bp的黏性末端
2 λ 噬菌体的构建 构建λ 噬菌体的依据：
a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。
该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb
2.6kb
3 代表性λ 噬菌体
(1) 插入型载体
装载容量为：0-10.18kb
(2) 置换型噬菌体载体载体 克隆外源DNA片段范围为：9-23kb
（二） M13 噬菌体载体
1.M13噬菌体的增值
M13噬菌体是单链丝状噬菌体； 长6407bp， 507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造； M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的 M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。
2.M13噬菌体载体 1) 插入选择标记基因； 2) 组装合适的多克隆位点。
三、噬菌体-质粒杂合载体
三大类病毒表达载体
逆转录病毒载体系统
杰特伟
选用的背景：由于重组腺病毒对于一些细胞类型难以转染，比如
各种类型的原代细胞、体内细胞，同时希望基因永久性表达，即将基 因整合入靶细胞的基因组中，此时可以考虑选用逆转录病毒。
逆转录病毒简介： 反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是
由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细 胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝 并高效准确地整和到宿主染色体 。
杰特伟杰特伟基因载体系统基因载体系统病毒载体系统病毒载体系统非病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体体腺病毒载反转录病毒载体体反转录病毒载腺伴随病毒载体体腺伴随病毒载单纯疱疹病毒载体体单纯疱疹病毒载慢病毒载体体慢病毒载裸裸dnadnadna阳离子脂质复合物dna阳离子脂质复合物dna蛋白质复合物dna蛋白质复合物细胞内包装细胞内包装细胞外包装细胞外包装dna阳离子多聚物dna阳离子多聚物dnarna嵌合物dnarna嵌合物杰特伟杰特伟公司相应的病毒表达载体质粒sirna表达载体去除去除cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白质粒较小质粒较小最好最好使用使用的的荧rnai质粒之一质粒之一杰特伟杰特伟质粒sirna表达载体cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白荧杰特伟杰特伟诱导性的sirna表达启动子四环素四环素强力霉素强力霉素杰特伟杰特伟teton基因表达系统的小常识gossen等构建了受四环素负调节的teton基因表达系统
常用的病毒载体的特点：
杰特伟
病毒载体
反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb
腺病毒载体 双链 DNA 病毒 36kb
A AV 病 毒 载 体 单链 DNA 病毒 ~5kb
HSV 病 毒 载 体 双链 DNA 病毒 152kb
生物技术制药基因表达载体的构建：常用载体的序列启动子复制原点终止子
翻译终止信号
LTR
逆转录病毒载体
特殊5’和3’端长末端重复序列
COS
黏性末端
MAR
显微注射载体
rrnB
基因终止信号
cIts 857
温度敏感的阻抑物
Col E1
大肠杆菌素基因
起始密码子
ATG、AUG
原核细胞
lacZ（X-gal）
α-互补筛选、蓝白筛选
trp1（色氨酸）、dhfr（二氢叶酸）
营养缺陷性筛选
融合表达（方便纯化）
化学或者蛋白酶法切除
6xHis
Ni+柱稳定、his标签便于纯化
GST（glutathione S-transferase）
GST（谷胱甘肽s转移酶）柱
FBD
SPA柱
myc
Myc标签——用于检测重组蛋白的表达情况。
哺乳
CMV、IE
逆转录病毒
终止子
T7 terminator
复制子
pUCori、SV40 ori、pBR322
ori、f1 origin
选择标记
AmpR(amp)、Kanr（Kan）、Neor（neo/G418）、TetR、Cm、G418、Zeocin
抗生素抗性基因
氨苄西林、卡那霉素、新霉素、四环素、氯霉素
MBP
麦芽糖结合蛋白
IgGFc
IgG融合
报告基因
GFP
绿荧光
GUS
植物
GAT
MCS
EcoR I、Age I、BamH I、Not I、Sca I等
其他
PA（SV40pA、BGHpA）
mRNA polyA信号
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱRBS（SD序列）
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。
3、pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
表达载体
一、大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体都是质粒载体。
作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。
在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。
各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。
1．表达融合蛋白的表达载体当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。
通过以融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。
用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase, GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6）、蛋白质 A（protein A）和纤维素结合位点（cellulose binding domain）等。
1.1 表达 LacZ 融合蛋白的载体如 pEX1/2/3 载体（图 3-31），P R 受 cIts857 控制，宿主 M5219 含缺陷性原噬菌体，编码 cIts857 和 N 蛋白。
cIts857 强烈抑制基因转录。
N 基因可使 RNA polymerase 跨过基因内部潜在终止位点。
一般采用 42-45 ℃灭活 cIts857 阻遏物，此处采用40℃ 以减少热激蛋白的诱导并使细菌能继续生长。
因为温度转换不仅可诱导 PL/PR 启动子，也可诱导热激基因，而后者有些可编码蛋白酶。
1.2 表达 GST 融合蛋白的表达载体GST 表达载体在启动子tac 和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列，其一是谷胱甘肽转移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位点的编码序列。
当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。
GST 是来源于血吸虫的小分子酶（ 26kDa），在E.coli 易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。
将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。
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表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体:特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。
请注意:1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。
同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。
2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。
本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域SDP BAD….TACCCGTTTTTTTCC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M ATTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Pst1 Hind111 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1P BAD….TACCCGTTTTTTTGG.GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。
因此，该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。
此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。
此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。
(a). Pcal-nBamH1 Sma1 EcoR1 Nco1 Sal1 Xho1 Sac1 Hnd111(b). Pcal-PelB:Nde1actggagact cat ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG GGCM K Y L L P T A A A G L L L L A A Q PNco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1GCC ATG GCC taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtct agagccc cgacgcgctgggA M A * * * * * *3. pPOW3.0 表达载体特点: 该原核表达质粒含有噬菌体的重叠λP R P L热诱导启动子和编码热敏感抑制子的C1857基因，可使宿主细胞在合成蛋白前获得高密度的宿主细菌，进行高水平目的蛋白表达，并对蛋白合成提供紧密控制。
PelB分泌信号肽能指引合成的外源蛋白通过胞浆膜进入胞质。
特别提示: 在进行重组质粒时，最好在N-未端用Nco1或Msc1位点，C-末端则可用BamH1、EcoR1位点进行拼接。
图示为启动子、PelB分泌信号肽和多克隆位点区域Xho1λP R P L 启动子ggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggcgcc tcgagt aatttaccaacactactacgttttaactgaaacaa RBS Nde1actggagact catATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCGM K Y L L P T A A A G L L L L ANco1 Msc1 BamH1 EcoR1 Sal1GGC GCC ATG GCC taagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtct agagcccA Q P A M A * * * * * *说明: RBS 为核糖体结合位点; * 为终止密码子二、真核细胞表达载体1.pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
扦入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2.pEGF P, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：gcc acc Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子和多克隆位点区域：.Nhe1….Age1…Bgl11BamH14. pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。
SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。
此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。
图示为启动子和多克隆位点区域：5．CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。
含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。
但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。
图示为启动子和多克隆位点区域：CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1其他常用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug保存液: TE BufferTE Buffer组成:10 mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1 mM EDTA 产品说明:pBluescript II kS、pUC18 & Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。
这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA 片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。
此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。
用途:•克隆外源DNA片断.•进行基因表达.•使用M13、T7和T3引物进行测序.Welcome To Download !!!欢迎您的下载，资料仅供参考！。