自生固氮菌的分离纯化

自生固氮菌的分离纯化

一、目的要求：

1、学习微生物纯系分离、培养方法。

2、掌握划线分离纯化微生物的方法。

二、基本原理：

为了生产和科学研究的需要，往往需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离。

为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法：一种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则其培养基中是不能含有N源，这种培养基就比较适于能利用空气中N2的微生物。另一种方法是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们所不需要的微生物的生长繁殖。分离土壤中真菌，往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红，链霉素和金霉素等化学药品，目的在于抑制细菌生长，这样更有利于获得其纯培养。土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数氮素养料是由微生物固氮的结果，固氮菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。

要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培养基这种选择培养基，控制其适宜环境条件，使它在培养基上大量繁殖，然后通过稀释法和划线分离纯化法，使它在培养基上形成单菌落，如分离

所得不纯，需要进一步纯化，直到得到纯种.

三、材料与仪器

1、培养基：阿斯毕无氮培养基。

2、菜园土。

3、灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等

四、方法与步骤

（一）富集培养：

1、用已灭菌后冷却至50o C左右的阿斯毕培养基倒成平板。

2、用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园土摆入已冷凝的平板培养

基上。

3、正面放置培养箱中培养，28o C培养3~4天后，在土粒周围有混

浊半透明的胶状菌落出现，有的在后期会产生褐色的色素。（二）划线分离纯化:(下次实验)

1、用已溶化至50o C阿斯毕培养基倒入平板。

2、用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上进行划线分离，而后置28o C培养4天。

划线方法如图：

（三）纯化、镜检，得到纯种培养

1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中，28o C培养4天。

2、镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。如是粗短杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大，常呈单个或“8”字排列，在细胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌。如有杂菌，需要进一步划线纯化。

3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培养基斜面管，28o C培养3~4天，即获得纯培养菌，可冷冻保存，备用。

五、注意事项：

（1）在微生物分离、纯化每一操作环节，要严格按照无菌操作

进行。

（2）平板划线时，划线部位不可重叠。

（3）划线时，每次都要将接种环上多余菌体烧掉。

（4）培养皿要贴标签，包括班级、姓名