自生固氮菌的分离纯化 ppt

2、镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜 检。如是粗短杆状或球状的单一形态的菌 体细胞较大，常呈单个或“8”字排列，在 细胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮 菌。如有杂菌，需要进一步划线纯化。
3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培 养基斜面管，28oC培养3~4天，即获得纯 培养菌，可冷冻保存，备用。
养基中,经培养后,由单个细胞生长 繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可 计算出样品中的含菌个数.
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源自文库
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十倍稀释法示意图: 依次各1ml
1g 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
10-7
样品 99ml 每管各9ml无菌水
无菌水
每皿15ml 1 琼脂培养基
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10-8 10-9
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十倍稀释法示意图: 依次各1ml
自生固氮菌的分离纯化
一、目的要求：
1、学习微生物纯系分离、培养方法。
2、掌握划线分离纯化微生物的方法。
二、基本原理：
为了生产和科学研究的需要，往往需 要从自然界混杂的微生物群中分离单一的 菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称 为微生物的分离。
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为了获得某种微生物的纯培养，可采用 下列两种方法：一种是提供有利于该微生物 生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从 土壤中分离自生固氮菌，则其培养基中是不 能含有N源，这种培养基就比较适于能利用空 气中N2的微生物。另一种方法是在培养基中 加入某种化学物质，以抑制人们所不需要的 微生物的生长繁殖。分离土壤中真菌，往往 在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加 拉红，链霉素和金霉素等化学药品，目的在 于抑制细菌生长，这样更有利于获得其纯培 养。
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土壤中微生物数量众多，在肥沃土 壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数 氮素养料是由微生物固氮的结果，固氮 菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌 两类。
要分离自生固氮菌，常用阿斯毕 无氮培养基这种选择培养基，控制其适 宜环境条件，使它在培养基上大量繁殖， 然后通过稀释法和划线分离纯化法，使 它在培养基上形成单菌落，如分离所得 不纯，需要进一步纯化，直到得到纯种.
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（二）划线分离纯化:(下次实验)
1、用已溶化至50oC阿斯毕培养基倒入平板。 2、用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平 板上进行划线分离，而后置28oC培养4天。 划线方法如图：
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（三）纯化、镜检，得到纯种培养
1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿 斯毕培养基斜面试管中，28oC培养4天。
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五、注意事项：
（1）在微生物分离、纯化每一操作 环节，要严格按照无菌操作进行。
（2）平板划线时，划线部位不可重 叠。
（3）划线时，每次都要将接种环上 多余菌体烧掉。
（4）培养皿要贴标签，包括班级、 姓名
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六、思考题
1、分析阿斯毕培养基成分，说明其 适用于分离自生固氮菌的原因。
2、划线分离时，为什么每次都要将 接种环上多余的菌体烧掉？划线为何 不能重叠？
1g 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
10-7 10-8
10-9
样品 99ml 每管各9ml无菌水 无菌水
1
1
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每皿15ml
琼脂培养基
操作步骤: 1、稀释样品(十倍稀释法）
2、稀释液的分离：
3、观察计数结果：(下次实验 做)
总活菌数/1克样品=同一稀释 度菌落平均数 X 稀释倍数.
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3、如何从自然界中分离自己所需要 的纯培养？应注意哪些问题。
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稀释平板计数法
微生物的平板计数是根据在固 体培养基上所形成的菌落,即是 由一个单细胞繁殖而成,且肉眼 可见的子细胞群体这一生理及 培养特征进行的.也就是说一个 菌落即代表一个单细胞.
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计数时,首先将待测样品制成均匀的,
一系列不同浓度的稀释液,并尽量使 样品中的微生物细胞充分分散开来, 使成单个细胞存在(否则一个菌落就 不是代表一个菌),再取一定稀释度, 一定量的稀释液接种到培养皿中,并 使其均匀分布于培养皿中的固体培
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三、材料与仪器
1、培养基：阿斯毕无氮 培养基。
2、菜园土。
3、灭菌培养皿、镊子、 剪刀、接种针、酒精灯等
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四、方法与步骤
（一）富集培养：
1、用已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯 毕培养基倒成平板。
2、用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园 土摆入已冷凝的平板培养基上。
3、正面放置培养箱中培养，28oC培养 3~4天后，在土粒周围有混浊半透明的 胶状菌落出现，有的在后期会产生褐色 的色素。