固氮菌筛选

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植物固氮菌的筛选和鉴定技术

植物固氮菌的筛选和鉴定技术植物固氮菌是一种能够将空气中的氮气转化为可供植物使用的氨的微生物。

它们是农业生产和生态环境中的重要成分，能够大幅度减少化肥的使用，提高作物产量，改善土壤环境。

因此，对植物固氮菌的筛选和鉴定技术的研究非常重要。

一、植物固氮菌的筛选植物固氮菌的筛选技术可以分为两类：直接筛选和间接筛选。

直接筛选是指根据植物中常见的固氮菌的特征(如罗德菌、艰难菌等)，利用分离富集技术，直接从土壤或根际中分离和筛选固氮菌。

这种方法简单易行，但它的筛选能力比较有限。

间接筛选则是以作物生长促进、氢气释放等作为固氮菌筛选的指标，通过对具备这些特征的细菌进行分离富集和筛选，如何同时兼顾作物生长和氮固氮的效果对筛选提出了更高的要求。

目前，常用的筛选技术包括荧光快速测量、Si膜过滤技术、PCR技术、微生物组培技术等。

荧光快速测量技术是一种常见的筛选方法。

通过荧光探针（如Acridine Orange, SYBR Green I）所发出的荧光信号，能够快速检测出生长在土壤和根际环境中的植物固氮菌，这些菌具有特有的荧光特征。

这种方法适用于样本量较少的情况下，但也存在着对设备要求高等问题。

Si膜过滤技术则是一种利用Si膜实现细菌分离、鉴定的技术。

通过先将样本在Si膜上培养，然后将培养基滴在Si膜中心，并让Si膜在培养基中浸透一定时间。

接下来，将Si膜转移到一盘培养基中进行进一步的培养，即可快速筛选出该环境下的植物固氮菌。

这种技术不仅能很好地保留样本的特征，还可以落实样本归档和保留的规范要求。

微生物组培技术则是一种基于微生物的分生技术，将固氮菌纯化分离后分别接种到富含养分的固定培养基中，经过培养后，细菌以生长点的形式展示出来。

这种技术的特点是检测灵敏度高，需要专门的设备和技术。

二、植物固氮菌的鉴定鉴定植物固氮菌的主要依据是形态学、生理学与分子生物学。

形态学鉴定主要包括形态学特征的摄影、显微镜观察和染色体及孢子的研究等。

植物固氮菌菌种筛选及其应用

植物固氮菌菌种筛选及其应用植物固氮菌是一种可以固定大气氮的细菌，这种细菌可以和许多植物建立共生关系，为植物提供固氮服务，同时也可以促进植物的生长和免疫系统的功能。

因此，植物固氮菌的选育和应用具有广泛的应用前景。

一、植物固氮菌的筛选为了从细菌中选出能够固氮并与植物形成共生关系的菌株，必须进行严格的筛选。

目前，常用的筛选方法包括以下几种：1、土壤样品筛选法：这种方法适用于从自然环境中筛选具有固氮能力的细菌。

首先从土壤中取样，然后通过培养来寻找具有固氮能力的细菌。

2、植物根系筛选法：这种方法适用于从植物根系中筛选具有固氮能力的细菌。

首先从植物根系中取样，然后通过培养来寻找具有固氮能力的细菌。

3、分子筛选法：这种方法适用于从分子水平上筛选具有固氮基因的细菌。

通过分子生物学技术，可以检测出具有固氮基因的菌株。

通过以上的筛选方法，可以获得具有固氮能力的细菌。

但是，在进行实际应用之前，还需要对这些细菌进行进一步的鉴定和优化。

二、植物固氮菌的应用植物固氮菌具有广泛的应用前景。

以下是植物固氮菌的几个常见的应用领域：1、农业领域：植物固氮菌可以与许多农作物建立共生关系，为作物提供固氮服务。

在农业生产中广泛应用的菌种包括大豆根瘤菌、豌豆根瘤菌等。

2、生态修复领域：植物固氮菌可以帮助植物生长，并提高植物的抗逆能力，从而促进生态修复。

例如，在荒漠化地区种植沙生植物，可以通过与固氮菌的共生来提高沙生植物的生长速度和适应性。

3、生物肥料领域：植物固氮菌可以作为纯菌肥料，用于改良土壤和提高作物产量。

这种肥料可以减少人工施肥的使用，从而减少土地污染和环境压力。

此外，植物固氮菌还被广泛应用于生态保育、饲料添加剂等领域。

三、植物固氮菌的未来展望未来，植物固氮菌的研究方向将主要包括以下几个方面：1、新菌种的发现和筛选。

为了更好地适应各种环境和作物，需要不断地发现和筛选具有特殊性能的新菌株。

2、生物技术手段的应用。

近年来，生物技术手段的日益完善，为植物固氮菌的研究提供了新的思路和方法。

生物固氮菌的分离筛选与应用研究

生物固氮菌的分离筛选与应用研究生物固氮是一种供应植物氮素源的重要途径，常见于土壤和根际中的一些细菌和蓝藻。

其中，生物固氮菌是固氮最为有效的一类生物。

它们能够将气态氮转化为植物能够利用的形式，提供植物的营养需求，从而促进植物的生长和发育。

因此，生物固氮菌的分离筛选和应用研究在农业生产中具有广阔的发展前景。

生物固氮菌的分离筛选是其应用研究的基础。

通常，采用土壤酸溶法、膜滤法、全白化法等方法进行分离筛选。

其中，土壤酸溶法是一种常用的分离方法。

将土壤样品放入酸性溶液中，使固氮菌在条件下释放出胞内固氮酶，从而使其在测定器中升高，然后通过对菌液进行稀释，最后计算出菌落总数和固氮菌含量。

膜滤法则是一种比较快速和方便的分离方法，对于筛选出的固氮菌进行进一步的鉴定和筛选。

全白化法则是一种比较精确的分离方法，它能够筛选出胞内固氮酶高效的菌株，但也相应需要更长的时间和更复杂的条件。

生物固氮菌分离筛选出的菌株需要进行一系列的确认鉴定。

在生物固氮菌应用的过程中，常用的鉴定方法是通过细菌形态、生理生化特性和基因测序等多种方式进行鉴定。

其中基因测序是最为准确和可靠的一种方法，它能够从分子水平上确定分离菌株的亲缘关系和物种分类。

此外，对固氮菌对于环境因素的适应性和生物活性也要进行评估。

生物固氮菌在农业生产中有着广泛的应用前景。

固氮菌可以有效地提高农作物的产量和品质，降低农业生产过程中对化肥的用量，达到环保和节能的目标。

同时，生物固氮菌还可以提高土壤的养分含量，改善其物理性质和化学特性，从而提高土壤综合质量，实现土壤修复和保护的目标。

因此，生物固氮菌已经成为现代农业生产中的重要组成部分。

生物固氮菌的应用也面临着一些挑战和难题。

受到环境影响和栽培管理等多种因素的影响，生物固氮菌的固氮效率和生物活性可能会有所下降。

此外，不同固氮菌株之间的固氮能力和菌液中其他微生物的干扰也需要进一步研究。

针对这些问题，需要在生物固氮菌的筛选和应用中进行更多的基础研究。

固氮菌、解磷菌的分离筛选讲课教案

PH试纸等。
:
、根据要求，配置好三种培养基，115℃条件下高压灭菌25min。
、将灭菌后的培养基在超净工作台倒平板，备用。
、在离心管中，将自带土壤样品按5g土样\10ml无菌水的比例溶解，土壤样品
、样品溶解后，将离心管放在离心机中，3000r\min，离心5min。
、在超净工作台，用灭菌的接种环蘸取离心后上清液，用平板划线分离法分别
～7.0
葡萄糖 10.0 g
?)?SO? 0.5 g
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?(PO?)? 10 g
18 g
1000 ml
实验材料:
、试剂及样品： Ashby培养基、无机磷培养基、无菌水、土壤样品（自带）。
、仪器及其它用具：培养皿、玻璃棒、烧杯、量筒、天平、高压蒸汽灭菌锅、
Ashby培养基和无机磷培养基上接种土样各一个平板。
、接种完成后在培养基上贴上标签，注明培养基名称和样品编号，接种日期。
Ashby①，2011.8.27；无机磷③2011.8.27。
、将培养皿放在恒温培养箱中28℃培养。
(MgSO4·7H2O) 0.2 g
(NaCl) 0.2 g
(CaCO3) 5.0 g
(C6H14O6) 10.0 g
(CaSO4·2H2O) 0.1 g
18.0 g
1000 mL
:
、掌握选择培养基的筛选原理。
、掌握固氮菌、解磷菌的分离方法。
、学习平板划线分离法。
利用这种培养基可以将所需的微生物从混杂的微生物中
固氮菌可以利用空气中的氮作为氮源进行自身代谢，根据这一原理可

固氮菌菌剂的筛选和鉴定方法研究

固氮菌菌剂的筛选和鉴定方法研究固氮菌是一类能够将大气中的氮气转化为可利用形式的氮化合物的微生物。

固氮菌在农业生产中具有重要的作用，能够促进植物生长、提高产量、减少化肥使用量、改善土壤质量等。

而固氮菌菌剂作为一种生物肥料广泛应用于农业领域。

然而，在开发和应用固氮菌菌剂的过程中，如何筛选有效菌株、运用可靠的鉴定方法依然是一个挑战。

本文将对固氮菌菌剂的筛选和鉴定方法进行研究。

一、固氮菌菌株的筛选方法1. 土壤采样及分离固氮菌通常存在于土壤中，因此，首先要对不同生态环境中的土壤进行采样。

采样点的选择应该覆盖到农田、林地等不同土壤类型，并且要避免污染源的干扰，以保证采样质量。

采样时要注意避免高温、阳光直射等影响固氮菌活性的因素。

采样回来后，需要将土壤样品进行稀释并在适宜培养基上进行分离。

常用的培养基有湿润的富氧培养基、富营养的富氧培养基和缺氧培养基等。

分离后的单菌落需要进行纯化，并保存在液氮中以备后续研究使用。

2. 固氮活性的初步筛选固氮菌的固氮活性是其最重要的特征之一，因此，筛选过程中需要对菌株的固氮活性进行初步评估。

常用的初筛方法有亚硝酸盐还原试验、酰胺酶检测以及利用净化的空气中含有不同浓度的15N氮气等。

亚硝酸盐还原试验是一种常用的固氮活性评估方法，通过观察固氮菌在含有亚硝酸盐的培养基上的颜色变化来判断其活性。

酰胺酶检测法则是通过检测固氮菌产生的酰胺酶的活性来评估固氮菌的能力。

15N标记法则是通过在含15N氮气中培养固氮菌，然后测定培养基中15N的含量来判断固氮活性。

3. 生理生化特征的分析除了固氮活性外，固氮菌的其他生理生化特征也是筛选的重要指标。

例如，耐盐性、耐酸碱性、温度适应性等都可以通过一系列培养实验以及相应的生化特征检测方法进行评估。

这些特征能够帮助筛选出适应不同环境的固氮菌菌株。

二、固氮菌菌剂的鉴定方法1. DNA指纹图谱分析DNA指纹图谱分析是一种常用的固氮菌菌剂鉴定方法。

通过扩增固氮菌DNA 片段，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用DNA染色剂染色观察DNA迁移的条带，生成固氮菌的DNA指纹图谱。

植物固氮菌的筛选及其在植物生长中的应用

植物固氮菌的筛选及其在植物生长中的应用氮素是植物生长所必需的基本元素之一，而固氮菌通过将空气中的氮固定为植物可以利用的氮化合物来补充土壤中的氮素。

固氮菌对促进植物生长和提高农作物产量具有重要作用。

因此，筛选高效的固氮菌并将其应用于植物生长已成为一个重要的研究方向。

一、固氮菌的筛选固氮菌根据其在植物生长中的功效不同，分为根瘤菌和非根瘤菌两类。

根瘤菌是一种厚壳杆菌科的细菌，在植物根部形成根瘤，这些根瘤中的菌株可以固氮。

而非根瘤菌则不会形成根瘤，但是可以通过其他方式固氮。

目前，固氮菌的筛选主要有两种方法，一种是传统的分离菌株法，另一种则是利用分子生物学技术进行筛选。

1. 分离菌株传统的分离菌株法主要通过对土壤和根瘤样品进行分离培养，筛选出理想的菌株。

这种方法需要将样品进行处理分离，培养后观察菌株是否具有固氮能力，具体流程比较繁琐。

不过，传统方法培养的菌株数量多，种类齐全，对于固氮菌科研工作者来说还是一种有效的筛选方式。

2. 分子生物学技术近年来，利用分子生物学技术进行固氮菌筛选的方法越来越受到关注。

这一筛选方法通过鉴定特异的突变位点或代表着固氮菌分解氮的基因，可以更准确地分析有效的固氮菌。

同时，分子生物学技术还可以快速识别任何一个菌株、鉴别其类型和相关性能。

这种高效的筛选方法为植物生长提供了更加有力的支持。

二、固氮菌的应用使用固氮菌作为化肥替代品来促进植物生长，这已经成为一种越来越受人们欢迎的方法。

1. 固氮菌与植物生长固氮菌可以与植物进行共生，增加植物对氮素的吸收能力，促进植物生长。

在无菌栽培环境下，经过添加固氮菌的处理与对照组相比，无论是产品质量还是生长速度都有明显提升。

例如，油菜籽铁状的根系上往往会生长一些类似小突起的结构，这些突起就是由固氮菌引起的。

这些突起是由大量的 Rhizobium 繁殖形成的。

2. 固氮菌在农业上的应用固氮菌在农业方面有着广泛的应用，可以提高农作物的产量，并改善土壤环境。

一株除臭固氮菌的筛选一株除臭固氮菌的筛选、鉴定鉴定及发酵条件优化

一株除臭固氮菌的筛选一株除臭固氮菌的筛选、鉴定鉴定及发酵条件优化李英;刘秀雨;李王强;丁文涛;李贞景;路来风;郭庆彬;康继;王昌禄;朴杨柠菥【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2024(45)12【摘要】为提高食品加工原料质量、降低环境污染,从自然界分离筛选出一株能有效减少鸡粪臭味及氮素流失的菌株JFN-1。

通过形态学特征、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定,JFN-1为假肠杆菌(Empedobacter falseni)。

通过液态发酵得出:JFN-1菌株在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶作用下,可以提高硝态氮、减少铵态氮含量以及减少氮类物质分解为氨气,从而减少氮素损失。

通过单因素和正交优化试验,得到JFN-1菌株增殖培养基组成为可溶性淀粉8 g/L、牛肉膏20 g/L、硫酸镁4 g/L、氯化钠5 g/L,30℃培养20 h发酵液OD600可达到3.14,相比未优化培养基提高12.91倍,总氮含量提高2.14倍。

通过固态发酵条件优化,得到JFN-1菌株固定氮素含量最多的固态发酵基质为菌糠15 g、麸皮15 g、豆粕1 g、糠醛渣2 g、硫酸铵0.165 g,在此条件下,总氮量提高196.42%。

【总页数】9页(P172-180)【作者】李英;刘秀雨;李王强;丁文涛;李贞景;路来风;郭庆彬;康继;王昌禄;朴杨柠菥【作者单位】天津科技大学食品科学与工程学院;食品营养与安全国家重点实验室;天津科技大学生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.一株产 PHB 固氮菌的筛选和初步鉴定2.一株具有ACC脱氨酶活性固氮菌的筛选与鉴定3.一株固氮菌的筛选、鉴定及混菌发酵制备复合型菌糠菌肥的研究4.一株自生固氮菌的筛选、鉴定及生长条件优化5.一株除臭细菌的筛选及鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

自生固氮菌微生物的筛选与生物学特征的研究1

自生固氮菌微生物的筛选与生物学特征的研究引言氮元素是农作物生长必不可少的一种元素，而它作为农肥的主要成分之一，能提高农作物产量，使作物在贫瘠的土壤上也能获得丰硕的成果。

然而，工业固氮的成功使得人们忽略了原本更加天然的固氮方式-使用固氮菌。

在全球人口呈现爆炸上升趋势的同时，人们需要。

农业生产提供大量的粮食以满足温饱，这就导致工业固氮产业的蓬勃发展。

但谁也没想到大量使用氮肥正威胁着人类赖以生存的地球环境：高浓度的氮氧化物是产生颗粒物和地面大气臭氧的重要原因。

红潮等的多次出现，杀死数以万计的鱼类，都是由于许多农作土壤也呈氮肥饱和趋势，多余的活性氮肥都被排进湖海之中，最终导致富营养化。

为了达到科学而且环保的目的，只有利用固氮生物进行绿色氮肥的生产，这样不仅可以节省生产氮肥的成本而且还不会造成活性氮流失事实上，许多试验都证明在某些环境状态下，接种的固氮菌对植物田有很大的帮助作用，这是由于固氮菌能在常温常压条件下，通过其体内固氮酶的作用，把空气中的氮固定下来形成氨，进一步变成植物可利用的氨素，从而让土壤中固定的氮元素增加，本实验主要是对自生固氮菌的筛选以及其生物学特征的研究。

1.材料和方法1.1无氮培养基（富集培养）配方：葡萄糖10克磷酸二氢钾0.2克硫酸镁0.2克硫酸钙0.2克氯化钠0.2克碳酸钙 5.0克琼脂20克蒸馏水1000mL PH 6,5—7..0瓦克斯曼77号培养基（分离培养）葡萄糖10克磷酸二氢钾0.5克MgSO4.7H2O 0.2克1%MnSO4.4H2O溶液2滴1%FeCl3溶液2滴蒸馏水1000mL 琼脂20克PH 7.0—7.21.2自生固氮菌的生态分布1.2.1土样采集：选定肥沃菜园土采集土样时，先铲去1-4厘米的部分，去5-10厘米深层土样，记录采集土样的时间地点和日期，带回实验室备用。

1.2.2土样备用：将采集的土样放入28摄氏度恒温箱中，不仅可以活化菌，而且还可以干燥土壤，便于土样播撒。

固氮菌实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 理解固氮菌的基本概念及其在自然界中的作用。

2. 学习固氮菌的分离和纯化方法。

3. 掌握观察和鉴定固氮菌的形态特征。

4. 分析固氮菌对植物生长的影响。

二、实验原理固氮菌是一类能够将大气中的氮气还原为氨或其他含氮化合物的微生物。

这些微生物在自然界中对于氮循环起着至关重要的作用，能够提高土壤肥力，促进植物生长。

本实验通过分离和纯化土壤中的固氮菌，研究其对植物生长的影响。

三、实验材料与仪器材料：1. 土壤样品2. 培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）3. pH试纸4. 紫外灯5. 显微镜6. 实验记录表仪器：1. 灭菌锅2. 灭菌器3. 研钵4. 移液枪5. 培养皿6. 离心机7. 烧杯四、实验步骤1. 土壤样品采集与处理- 在采样地点采集土壤样品，避免带入植物残体和有机物。

- 将采集的土壤样品放入灭菌的烧杯中，加入适量无菌水，搅拌均匀。

2. 土壤浸提液制备- 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，置于摇床上振荡30分钟。

- 取上清液，用pH试纸测定其pH值。

3. 涂布分离- 将浸提液用无菌水稀释至适当浓度。

- 取适量稀释液，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上。

- 在紫外灯下照射30分钟，以杀死杂菌。

4. 分离纯化- 观察培养基上的菌落，挑选单菌落进行纯化。

- 将单菌落接种于新的牛肉膏蛋白胨培养基上，重复上述步骤，直至获得纯化的固氮菌。

5. 形态特征观察- 将纯化的固氮菌进行显微镜观察，记录其形态、大小、颜色等特征。

6. 固氮能力鉴定- 将纯化的固氮菌接种于无氮培养基上，培养一段时间后，观察植物生长情况。

- 与未接种固氮菌的对照组进行比较，判断固氮菌对植物生长的影响。

五、实验结果与分析1. 通过涂布分离和纯化，成功分离出纯化的固氮菌。

2. 观察到固氮菌呈杆状，大小约为0.5～1.0μm，革兰氏染色为阴性。

3. 固氮菌在无氮培养基上生长良好，表明其具有固氮能力。

4. 与对照组相比，接种固氮菌的植物生长更为旺盛，叶片颜色鲜绿，说明固氮菌对植物生长具有促进作用。

生物固氮研究报告

生物固氮研究报告生物固氮是指某些微生物能够将大气中的氮气(N2)转化为植物能够利用的氨。

这个过程被称为固氮。

固氮的能力对土壤肥力和植物生长起着重要的作用。

为了研究生物固氮的机制和影响因素，我们进行了以下实验。

实验一：固氮菌种筛选我们从不同的环境中采集土壤样品，分离出固氮菌进行筛选。

首先，我们制备了含有氮源缺失的培养基，在无氧条件下进行培养。

通过测定培养基中的氨含量，我们筛选出了具有较高固氮能力的菌株。

这些菌株在进一步的实验中被用于固氮机制研究。

实验二：酶活性测定我们测定了固氮菌在不同条件下的酶活性。

为了测定固氮酶的活性，我们制备了含有固氮酶底物的反应体系。

通过测定反应体系中氨的生成速率，我们可以确定固氮酶的活性。

我们同时测定了不同固氮菌株的酶活性，以比较它们之间的差异。

实验三：影响因素分析我们研究了不同因素对于生物固氮的影响。

首先，我们调节了培养基pH值，观察了固氮菌生长和固氮能力的变化。

其次，我们改变了培养温度，探究其对固氮菌固氮能力的影响。

最后，我们添加了不同浓度的氮源，研究其对固氮菌的生长和固氮能力的影响。

实验结果显示，我们筛选出的固氮菌株具有较高的固氮能力。

在酶活性测定中，我们发现不同菌株之间存在明显的酶活性差异。

在影响因素分析中，我们发现培养基pH值、培养温度和氮源浓度对固氮菌的生长和固氮能力都有显著影响。

低pH值和适宜的培养温度能够促进固氮菌的生长和固氮能力。

适度的氮源浓度也可以提高固氮菌的固氮能力。

综上所述，生物固氮是一种重要的氮循环过程，对土壤肥力和植物生长起着重要作用。

我们通过筛选固氮菌株、测定酶活性和分析影响因素等实验，研究了生物固氮的机制和影响因素，为进一步理解和应用生物固氮提供了基础。

固氮菌筛选及鉴定

固氮菌筛选及鉴定实验原理农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。

将用表土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。

在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。

用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。

目的要求1．初步学会从土壤中分离自生固氮菌的方法。

2．初步学会制作临时涂片的方法。

材料用具农田的表层土壤(土壤溶液的pH不低于6.5)。

无菌研钵，无菌玻璃棒，接种环，天平，存放有载玻片的酒精缸，盖玻片，显微镜，酒精灯，火柴，镊子，恒温箱，量筒，玻璃铅笔。

灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，结晶紫染液，无菌水。

方法步骤一、接种1．接种前，将灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，放在37℃的恒温箱中一两天。

随后，选取培养基上没有生长任何微生物的培养皿供实验用。

2．取10g土壤，放在无菌研钵中，注入5mL无菌水，并用无菌玻璃棒搅拌均匀，备用。

3．将接种环放在酒精灯的火焰上灭菌。

略微打开培养皿盖，将接种环放在培养基边缘处冷却。

然后，用接种环蘸取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上，共点接15～20处(注意：接种时手和衣袖不要碰到火焰，以免烧伤)。

4．接种后，轻轻地盖上培养皿盖，将培养皿放在实验桌上，并在顶盖上写明实验内容、接种人的姓名和接种日期。

二、培养将接过种的培养皿放入恒温箱内，在28～30℃的温度下培养3～4d。

三、观察3～4d后，取出培养皿，仔细观察培养基上稀泥浆周围长出的培养物——黏液。

黏液初为无色透明，以后为乳白色，最后变成褐色，表明含有自生固氮菌。

四、镜检1．制作临时涂片(1)用镊子从存放载玻片的酒精缸中夹取一片载玻片，将载玻片放在酒精灯火焰的上方缓缓烘烤，以便除去上面的酒精。

将载玻片放在实验桌上，待载玻片冷却后，在载玻片的中央滴一滴无菌水。

(2)在火焰旁，按照接种的要求，用灭过菌的接种环从培养基上挑取少许黏液，将黏液涂在载玻片上的水滴中，加1滴结晶紫染液，混合均匀，染色1min。

(3)另取一片载玻片作推片。

固氮菌、解磷菌的分离筛选

精品固氮菌、解磷菌的分离筛选一、目的要求:1、掌握选择培养基的筛选原理。

2、掌握固氮菌、解磷菌的分离方法。

3、学习平板划线分离法。

二、实验原理：选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理化学抗性而设计的培养基，利用这种培养基可以将所需的微生物从混杂的微生物中分离出来。

固氮菌可以利用空气中的氮作为氮源进行自身代谢，根据这一原理可以利用无氮培养基将固氮菌从混合菌中分离出来。

解磷菌可以在含有难溶性磷酸盐或有机磷的固体培养基产生溶磷圈，根据这一特性可以分离出解磷菌。

同样，可以根据解钾菌的生理特性选择合适的培养基将其分离出来。

在本实验中，分离固氮菌我们采用阿须贝氏( Ashby ) 培养基，分离解磷菌采用无机磷培养基。

选择培养基的配方如下Ashby 培养基：磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2 g硫酸镁(MgS04 7H2O) 0.2 g氯化钠(NaCI) 0.2 g碳酸钙(CaC03) 5.0 g甘露醇(C6H14O6) 10.0 g硫酸钙(CaSO4 2H2O) 0.1 g精品18.0 g1000 mL6.8 〜7.0 10.0 g 0.5 g 0.3 g 0.3 g 0.3 g 0.03 g0.03 g10 g 18 g 1000 ml无机磷培养基、无菌水、土壤样品(自带) 2、仪器及其它用具：培养皿、玻璃棒、烧杯、量筒、天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超净工作台、接种环、酒精灯、 PH 试纸等。

四、方法步骤 :培养基的配制1、根据要求，配置好三种培养基，115 C 条件下高压灭菌25min琼脂蒸馏水 pH 无机磷培养基：葡萄糖(NH ?)?SO?NaClKClMgSO ??7H ?OFeSO??7H ?OMnSO ?? 4H?O Ca?(PO?)?琼脂蒸馏水三、实验材料 : 1、试剂及样品： Ashby 培养基、精品2、将灭菌后的培养基在超净工作台倒平板，备用。

样品处理3、在离心管中，将自带土壤样品按5g 土样\10ml无菌水的比例溶解，土壤样品要充分溶解，使土壤中的微生物全部溶解在无菌水中。

辣椒叶际固氮菌分离筛选及抑菌活性

黑龙江农业科学２０２３(５):６２Ｇ６６H e i l o n g j i a n g A gr i c u l t u r a l S c i e n c e s h t t p ://h l j n y k x ．h a a s e p．c n D O I :１０．１１９４２/j．i s s n １００２Ｇ２７６７．２０２３．０５．００６２幸翀,王淑珍,王龙,等．辣椒叶际固氮菌分离筛选及抑菌活性[J ]．黑龙江农业科学,２０２３(５):６２Ｇ６６．辣椒叶际固氮菌分离筛选及抑菌活性幸㊀翀１,王淑珍２,王㊀龙２,郭青云２(１．赣南医学院医学信息工程学院,江西赣州３４１０００;２．赣南师范大学生命科学学院,江西赣州３４１０００)摘要:为后续研制叶面微生物菌肥提供优良固氮菌种,以辣椒为研究对象,利用选择性培养基分离㊁筛选辣椒叶际固氮细菌,测定其固氮能力和植物病原菌的拮抗能力并对性能优良的菌株进行１６S r D N A 分子生物学鉴定.研究表明,从辣椒叶际共分离得到２株具有高效固氮性能的自生固氮菌L J Ｇ１和L J Ｇ２,分别鉴定为不动杆菌(A c i n e t o b a c t e r s p ．)和根瘤菌(R h i z o b i u m s p．),固氮酶活性分别达９３．２６和１０２．２３U L －１.两株菌具有广谱抗真菌活性和耐酸碱能力,对油菜菌核病菌㊁番茄灰霉病菌和棉花立枯病菌抑制效果可达５０％以上.因此,辣椒叶际固氮菌L J Ｇ１和L J Ｇ２是具有固氮和生防作用的多功能细菌,可为进一步研发优良的叶际固氮菌肥提供微生物资源.关键词:辣椒;叶际固氮菌;分离筛选;培养特性;抑菌收稿日期:２０２２Ｇ１２Ｇ０９基金项目:国家自然科学基金(３２１６０３１４).第一作者:幸翀(１９７０－),男,硕士,副教授,从事生物检测相关研究.E Ｇm a i l :１１２１６８４１２２＠q q．c o m .通信作者:郭青云(１９７９－),女,博士,副教授,从事生物防治和昆虫Ｇ微生物互作研究.E Ｇm a i l :q i n g yu n ６１２＠１６３．c o m .㊀㊀氮素是植物生长过程中需求量最大的营养元素,也是农业生产的重要限制因子[１].目前,农作物对氮素的需求主要依赖于化肥的施用,全球性能源缺乏使化学氮肥的生产成本逐年增加,而多年连续施用化肥会造成土壤板结㊁肥力下降等弊端,因此固氮微生物肥料的研究与应用日益受到重视[１Ｇ２].筛选高效㊁抗病固氮微生物菌种是微生物菌肥生产应用的基础[２Ｇ４].植物叶际存在大量的固氮微生物,能固定空气中的氮气为植物生长提供氮素,还可拮抗植物病原菌提高植物的抗病能力[３Ｇ６].叶际固氮菌具有非专一性,且不易受化肥的影响,具有巨大的应用潜力.大量研究证实叶际固氮菌具有促进作物增产增质的效果,如在玉米叶面喷施固氮菌肥,可增产３０％~３７％,与施用化肥相当,还可产生抗菌物质,降低玉米大㊁小斑病的发病率,间接促进作物生长发育[２].将多粘类芽孢杆菌微生物肥料喷施于茶树叶面,可显著提高茶叶产量和品质[７].植物叶际固氮菌大多为细菌,目前已分离出固氮菌属(A z o t o b a c t e r )㊁气杆菌属(A e r o b a e t e r )㊁拜氏固氮菌属(B e i j e r i n e k i a )㊁黄杆菌属(F l a v o b a e t e r i u m )㊁假单胞杆菌属(P s e u d o m o n a s )㊁分枝杆菌属(M ye o b a e t e r i u m )㊁克氏杆菌属(K l e b s i e l l a )㊁螺菌属(S p i r i l l u m )等[３Ｇ５].固氮菌被广泛用于生物肥中,在取代氮肥的施用上具有广阔前景,但目前固氮菌肥的研究主要集中于土壤基肥,对叶面固氮菌肥研究较少.且植物叶际固氮菌的分离主要集中在小麦㊁玉米㊁大豆㊁茄子㊁西红柿等农作物上,对辣椒叶际固氮菌报道相对较少[２Ｇ６].本研究对辣椒叶际固氮菌进行分离,筛选出具有高效固氮和抗植物病害的功能菌,可为开发叶面生物菌肥提供菌种资源.１㊀材料与方法１．１㊀材料供试辣椒于２０２１年９月采自赣南师范大学周边农民自种蔬菜园,每个样品随机选取５株植株的地上叶片,所取叶片位于新叶与老叶之间,避免沾染泥土引起试验误差,将采集到的叶片混合放入无菌培养皿中,２４h 内对叶片进行处理.供试病原菌为棉花立枯病菌(R h i z o c t o n i as o l a n i )㊁棉花枯萎病菌(F u s a r i u mo x y s po r u m )㊁番茄灰霉病菌(B o t r yt i s c i n e r e a )㊁油菜菌核病菌(S c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m L i b )㊁苹果轮纹病菌(B o t r y o s ph a e r i a d o t h i d e a )㊁葡萄炭疽病菌(C o l Ｇl e t o t Ｇr i c h u m g l o e o s p o r i o i d e s )㊁稻瘟病菌(M a gＧn a p o r t h e o r y z a e ),均由赣南师范大学袁小勇老师实验室提供.１．２㊀方法１．２．１㊀辣椒叶际固氮菌分离筛选㊀将取回的新鲜叶片用自来水冲洗叶面,然后用无菌水漂洗２６Copyright ©博看网. All Rights Reserved.５期㊀㊀幸㊀翀等:辣椒叶际固氮菌分离筛选及抑菌活性㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀１次,置于装有１００m L无菌磷酸缓冲液(p H７．０,含０．１％T w e e n)的锥形瓶中,保证溶液完全浸没叶片,２５ħ２００r m i n－１摇床震荡３０m i n,超声波４０k H z超声５m i n,用镊子取出叶片,将其余的溶液转移至５０m L离心管中,然后以１００００r m i n－１离心１０m i n,倒掉上清,收集得到沉淀菌体.吸取１００μL稀释液平板涂布法均匀接种到固体A s h b y无氮培养基上,２８ħ培养５d.根据菌落形态选择长势较好㊁生长速度较快的不同菌落划线纯化数次,直至出现有规则的单菌落.１．２．２㊀菌株１６Sr D N A和n i f H基因的P C R扩增㊀将筛选获得的固氮菌接种于L B液体培养基中,于２８ħ,２００r m i n－１的摇床中过夜培养,收集菌体,用天根细菌基因组D N A提取试剂盒进行基因组D N A提取,以细菌１６Sr D N A全序列通用引物２７F/１４９２R[８]和固氮基因n i f H特定的引物P o l F/P o l R[９]分别进行P C R扩增,用１％琼脂糖凝胶电泳进行验证.扩增的P C R产物送至北京擎科生物有限公司测序,使用N C B I数据库进行序列比对,利用M E G A７．０软件采用最大似然(M L)算法构建系统发育树.１．２．３㊀固氮酶活性测定㊀挑取单菌落至L B液体培养基中２８ħ,２００r m i n－１振摇培养至O D 值约为０．６,以１％接种量转接至A s h b y无氮液体培养基中,分别于２４,４８,７２和９６h取样,采用微生物固氮酶(N I T S)E L I S A试剂盒(上海羽朵生物科技有限公司)进行固氮酶活性测定,３次重复.１．２．４㊀菌株培养特性研究㊀p H:取等量的细菌培养液接种于p H为５．０,６．０,７．０,８．０和９．０的L B液体培养基中,置于２８ħ下１８０r m i n－１恒温振荡培养箱中培养４８h.测定菌液O D６００的平均值,确定菌株的最适生长p H,３次重复.N a C l浓度:取等量细菌培养液接种到含N a C l 质量分数为０％㊁１％㊁２％㊁３％和４％的L B液体培养基中,置于２８ħ下１８０r m i n－１恒温振荡培养箱中培养４８h,测定其O D６００的平均值,３次重复,确定菌株的耐盐性.碳源:配制分别由麦芽糖㊁葡萄糖㊁淀粉和蔗糖代替L B培养基中的碳源(酵母膏)的液体培养基,取等量细菌培养液接种于上述培养基中,置于２８ħ下１８０r m i n－１恒温振荡培养箱中培养４８h,分别测定不同碳源下菌液O D６００,３次重复.１．２．５㊀固氮菌对植物病原真菌的抑制活性㊀采用平板对峙法[１０]研究固氮菌对植物病原真菌的抑制活性.将病原菌菌饼接种于P D A琼脂平板(d＝８．５c m)中央,在距离菌饼两侧３c m处划线接种菌株,将接种后的培养皿在２８ħ恒温培养箱中倒置培养５d,同时接种只含有病原真菌的P D A琼脂平板作为对照.菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径－对峙板菌落直径)/对照菌落直径ˑ１００１．２．６㊀数据分析㊀采用O r i g i n２０２１和S P S S２０．０软件对试验数据进行统计分析和图表处理,运用M E G A７．０软件构建系统发育树.２㊀结果与分析２．１㊀固氮菌的分离及鉴定从辣椒叶际分离得到２株能在A s h b y无氮培养基上生长较快的菌株,编号为L JＧ１和L JＧ２.经过５代的分离纯化后,菌株L JＧ１菌落为白色,边缘整齐;菌株L JＧ２菌落为圆形半透明,边缘整齐,表面湿润,在１００倍光学显微镜下观察均为棒杆状(图１).通过扩增固氮酶基因n i f H进行复筛,２株菌均能扩增得到固氮酶基因,片段大小约为３６０b p左右,与预期结果一致(图２),说明２株细菌均具有固氮能力.图１㊀菌株L JＧ１和L JＧ２显微镜下的细胞形态３６Copyright©博看网. All Rights Reserved.㊀㊀㊀㊀㊀黑㊀龙㊀江㊀农㊀业㊀科㊀学５期M．D L２０００M a r k e r;１．阴性对照;２．菌株L JＧ１;３．菌株L JＧ２.图２㊀n i f H基因P C R扩增图２．２㊀菌株１６S r D N A序列P C R扩增及系统发育分析分别以２株叶际固氮菌的总D N A为模板,采用１６S r D N A通用引物２７F和１４９２R进行P C R扩增,得到大小约为１５００b p左右的基因片段,测序后序列提交至G e n B a n k数据库,登记号为O N７７８５６３．１和O N７７８５６４．１.在数据库中进行B L A S T比对发现菌株L JＧ１和不动杆菌A c i n e t o b a c t e r s p．L C４８４７９２．１亲缘关系最近,聚为一支,序列相似度大于９９％,因此将其命名为A c i n e t o b a c t e r s p．(图３A);菌株L JＧ２和根瘤菌R h i z o b i u m s p．M F４５８８７３．１,亲缘关系最近,聚为一支,序列相似度为大于９９％,将其命名为R h i z o b i u m s p．(图３B).图３㊀基于１６S r D N A序列的固氮菌L JＧ１(A)和L JＧ２(B)菌株的系统发育进化树２．３㊀辣椒叶际固氮菌的固氮酶活性固氮酶活性是评价固氮菌性能的重要指标.菌株L JＧ１和L JＧ２均有较高的固氮能力,菌株L JＧ２的固氮能力优于L JＧ１.在A s h b y无氮液体培养基中,菌株L JＧ１在培养４８h时固氮酶活性最高,达到９３．２６U L－１,随着培养时间的增加,固氮酶活性呈下降趋势.菌株L JＧ２固氮酶活性随着培养时间的增加而升高,在培养７２h达到最大值,为１０２．２３U L－１,之后随着培养时间的延长,固氮酶活性变化不大(图４).图４㊀菌株L JＧ１和L JＧ２固氮酶活性２．４㊀辣椒叶际固氮菌的培养特性两株菌在初始p H为５．０~９．０的培养条件下均能生长,说明辣椒叶际分离得到的固氮菌具有较强的适应能力,其中菌株L JＧ１的最适p H为８．０,L JＧ２的最适p H为７．０(图５A).菌株L JＧ１在０％~４％N a C l浓度下均能生长,具有较广的盐度适应性.N a C l浓度对菌株L JＧ２的生长影响显著,菌株的生长速率随N a C l 浓度的增大而减小,在N a C l浓度为０％和１％时吸光值O D６００相当,达到最大值２．５２,浓度为４％时菌株L JＧ２几乎不生长,吸光值仅为０．１５,说明该菌株对盐度敏感(图５B).碳源对菌株生长的影响差异显著.菌株L JＧ１对各碳源均能利用,其中以麦芽糖和蔗糖为碳源时生长较差.碳源对菌株L JＧ２的生长影响较大,当酵母粉被各碳源替代后生长量仅大约为L B培养基的２５％,说明该菌株的碳源谱较窄(图５C).２．５㊀固氮菌对植物病原真菌的抑制活性辣椒叶际固氮菌L JＧ１和L JＧ２对多种植物病原菌具有较好的抑制活性.其中菌株L JＧ１对油菜菌核病菌的抑制效果最好,其抑制率达到７０５９％,其次是番茄灰霉病菌(６２．５１％)和棉花立枯病菌(５２．５５％),对苹果轮纹病菌抑制率最低,仅为１８．７５％,对其他供试病原菌的抑制活性均在２０％以上,具有广谱抗真菌活性.菌株L JＧ２对番茄灰霉病菌和棉花立枯病菌抑制率可达５０％以上,对苹果轮纹病菌无抑制活性,总体抑菌活性低于菌株L JＧ１.与对照组相比,各试验组的抑菌圈边界清晰,抑菌圈周围菌丝生长缓慢.４６Copyright©博看网. All Rights Reserved.５期㊀㊀幸㊀翀等:辣椒叶际固氮菌分离筛选及抑菌活性㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀A．p H对菌株生长的影响;B．N a C l浓度对菌株生长的影响;C．碳源对菌株生长的影响.图５㊀p H、N a C l浓度和碳源对固氮菌株L JＧ１和L JＧ２生长的影响注:不同小写字母表示不同处理间在P＜０．０５水平差异显著.表１㊀固氮菌株L JＧ１和L JＧ２对不同植物病原真菌的抑制率供试菌株抑制率/％L JＧ１L JＧ２棉花枯萎病菌２０．１８ʃ２．１２２１．１１ʃ３．７５葡萄炭疽病菌４２．８６ʃ４．３３３８．０５ʃ４．３１苹果轮纹病菌１８．７５ʃ２．１７Ｇ番茄灰霉病菌６２．５１ʃ６．１２５５．７８ʃ６．１８油菜菌核病菌７０．５９ʃ７．８８３５．２９ʃ３．４３棉花立枯病菌５２．５５ʃ４．９７５０．４３ʃ４．６５稻瘟病菌２７．７８ʃ３．２１３５．９３ʃ２．２６㊀㊀注: Ｇ表示无抑制性.３㊀讨论植物叶际营养物质丰富,存在大量固氮微生物,目前已从多种植物叶际分离出多种高效固氮微生物用于农业生物菌肥[３Ｇ６].如大豆喷施叶面固氮菌的增产率可达１３％以上,玉米在苗期和孕穗期喷施叶际固氮菌可增产１０％以上[６].自生固氮菌因其不与植物形成宿主关系且适应能力强,具有增加农作物产量以及绿色环保等优点,已成为２１世纪新型肥料发展的重要方向之一.本研究从辣椒叶际分离到２株自生固氮菌L JＧ１和L JＧ２,经１６S r D N A序列比对分别鉴定为不动杆菌(A c i n e t o b a c t e r s p．)和根瘤菌(R h i z o b i u m s p．),且具有高固氮酶活性,分别达９３．２６和１０２．２３U L－１.其中不动杆菌有解钾㊁解磷和固氮作用的多功能促生特性,已被大量分离研究[１１Ｇ１２].根瘤菌作为广泛分布于土壤中一类固氮微生物,不但可以与豆科植物共生,也可以作为植物内生菌存在于非豆科植物体内,而且还可以在土壤中长期以腐生菌的状态存在,目前根瘤菌作为生物菌肥已被开发利用.此外,已有文献报道,根瘤菌可在植物内部进行迁移,定殖于植物内部,并通过气孔进入叶际表面,成为叶际附生微生物[１３Ｇ１４].罗娜等[１５]从湖南省各地分离的辣椒内生固氮菌中鉴定为根瘤菌,本研究也从辣椒叶际分离出具高效固氮能力的附生根瘤菌.在碳源的利用方面,本研究分离的不动杆菌L JＧ１基本与同属细菌利用情况相似,在淀粉为碳源或者无氮条件下都能生长良好,能耐受高浓度的盐类,因此可在生产应用中简化培养条件并降低生产成本;而根瘤菌L JＧ２对碳源和盐度适应范围较窄,具体的发酵条件有待进一步优化.两株菌都能够在p H５．０~９．０的环境下生长,与一般的在酸性或碱性环境下难以生存的菌株形成差异,在菌肥应用中能更好适用于不同酸碱度施用环境,因此有望开发为微生物菌肥更广泛地应用在农业生产中.生防能力是评价微生物功能的一个重要方面.本研究分离不动杆菌(L JＧ１)根瘤菌(L JＧ２)具有广谱抗植物真菌病害作用,与已有的研究报道基本一致[１１Ｇ１４].蔺经等[１１Ｇ１２]从樟树中分离的鲍曼不动杆菌,抑制了梨黑斑病㊁轮纹病和炭疽病等真菌性病害,起到了较好的防治作用.大量研究报道根瘤菌在多种病原真菌有一定的抑制作用,能够诱导作物产生系统抗病性,王媛媛等[１３]５６Copyright©博看网. All Rights Reserved.㊀㊀㊀㊀㊀黑㊀龙㊀江㊀农㊀业㊀科㊀学５期从大豆根瘤中分离的费氏中华根瘤菌对大豆胞囊线虫和大豆根腐病菌等多种植物病害具有抑制作用.因此,本研究从辣椒叶际筛选的２株叶际固氮菌不仅具有固氮功能,还有拮抗病原真菌生防能力,具有作为叶际固氮生物肥料优良菌种的光明前景,可高效地应用于固氮菌剂中进行资源化利用.４㊀结论从辣椒叶际筛选到２株固氮菌L J Ｇ１和L J Ｇ２,经１６S r D N A 基因比对结果和形态特征鉴定为不动杆菌(A c i n e t o b a c t e r s p ．)和根瘤菌(R h i z o b i u m s p ．).两株菌具有固氮酶活性高,对油菜菌核病菌㊁番茄灰霉病菌和棉花立枯病菌等多种植物真菌病害均有抑菌作用,有望进一步研发优良的叶面固氮微生物肥料.参考文献:[１]㊀仝倩倩,祝英,崔得领,等．我国微生物肥料发展现状及在蔬菜生产中的应用[J ]．中国土壤与肥料,２０２２(４):２５９Ｇ２６６．[２]㊀G I R I S ,P A T IB R．Ac o m p a r a t i v es t u d y o n p h y l l o s ph e r e n i t r o g e n f i x a t i o nb y n e w l y i s o l a t e d C o r yn e b a c t e r i u m s p ．&F l a v o b a c t e r i u m s p．a n dt h e i r p o t e n t i a l i t i e sa sb i o f e r t i l i z e r [J ]．A c t aM i c r o b i o l o g i c a e t I m m u n o l o g i c aH u n ga r i c a ,２００４,５１(１/２):４７Ｇ５６．[３]㊀V O R H O L TJ A．M i c r o b i a l l i f ei nt h e p h y l l o s p h e r e [J ]．N a t u r eR e v i e w sM i c r o b i o l o g y,２０１２,１０(１２):８２８Ｇ８４０．[４]㊀潘建刚,呼庆,齐鸿雁,等．叶际微生物研究进展[J ]．生态学报,２０１１,３１(２):５８３Ｇ５９２．[５]㊀沙小玲,梁胜贤,庄绪亮,等．植物叶际固氮菌研究进展[J ]．微生物学通报,２０１７,４４(１０):２４４３Ｇ２４５１．[６]㊀刘荣昌,李凤汀．植物叶际固氮与农业生产[J ]．微生物学杂志,１９８５,５(１):５６Ｇ５９．[７]㊀MA D H A I Y A N M ,A L E X T H H ,N G O H S T ,e ta l ．L e a f Ｇr e s i d i n g m e t h y l o b a c t e r i u m s p e c i e sf i x n i t r o ge n a n d p r o m o t eb i o m a s sa n ds e e d p r o d u c t i o ni n J a t r o ph ac u r c a s [J ]．B i o t e c h n o l o g y f o rB i o f u e l s ,２０１５,８:２２２[８]㊀李瑞芳,赵玉峰,薛雯雯,等．一株芽孢杆菌１６Sr R N A 的基因序列测定和系统进化分析[J ]．广东农业科学,２０１１,３８(３):１２１Ｇ１２２．[９]㊀R O S C H C ,M E R G E LA ,B O T H E H．B i o d i v e r s i t y o f d e n i t r i f y i n g a n dd i n i t r o g e n Ｇf i x i n g ba c t e r i ai n a n a c i df o r e s ts o i l [J ]．A p p l i e dE n v i r o n m e n t a lM i c r ob i o l o g y,２００２,６８:３８１８Ｇ３８２９．[１０]㊀王家和．烟草根病拮抗真菌的分离与筛选[J ]．中国生物防治,１９９８,１４(１):２９Ｇ３２．[１１]㊀蔺经,杨青松,李晓刚．一株不动杆菌次生代谢活性产物的抑菌作用及对果树病害的防治效果[J ]．江西农业学报,２０１０,２２(１０):７８Ｇ７９．[１２]㊀蔺经,杨青松,李晓刚,等．鲍曼菌素对梨轮纹病病菌的毒力及其药效评价[J ]．湖南农业大学学报(自然科学版),２０１１,３７(１):５２Ｇ５４．[１３]㊀王媛媛,段玉玺,陈立杰．拮抗性根瘤菌对大豆根部病原物的影响研究[J ]．植物病理学报,２００８(６):６０７Ｇ６１２．[１４]㊀余涵霞,梁浩林,王子轩,等．薇甘菊根际可培养固氮菌和氨化细菌的分离鉴定与促生作用[J ]．微生物学报,２０２２,６２(５):１８５１Ｇ１８６３．[１５]㊀罗娜,肖海兰,鲁颂,等．辣椒内生固氮菌的分离鉴定与多样性分析[J ]．作物杂志,２０１４(６):５２Ｇ５６．I s o l a t i o na n dS c r e e n i n g o fN i t r o g e n ＧF i x i n g Ba c t e r i a f r o mL e a v e s o fP e p p e r a n dA n t i f u n g a lA c t i v i t yX I N GC h o n g １,W A N GS h u z h e n ２,W A N GL o n g ２,G U O Q i n g yu n ２(１．S c h o o lo f M e d i c a la n dI n f o r m a t i o n E n g i n e e r i n g ,G a n n a n M e d i c a lU n i v e r s i t y,G a n z h o u３４１０００,C h i n a ;２．C o l l e g e o fL i f eS c i e n c e s ,G a n n a nN o r m a lU n i v e r s i t y,G a n z h o u３４１０００,C h i n a )A b s t r a c t :I n o r d e r t o p r o v i d e e x c e l l e n t n i t r o g e n Ｇf i x i n g b a c t e r i a s t r a i n s f o r t h e s u b s e q u e n t d e v e l o pm e n t o f b i o f e r t i l i z e r ,t h e l e a v e s o f p e p p e rw e r e t a k e na s t h e r e s e a r c ho b je c t a n d t h e s e l e c t i v e i n c u b a t i o n c u l t u r em e d i u m w a s u s e d t o s e p a r a t e a n d s c r e e n p h y l l o s p h e r en i t r o g e n Ｇf i x i ng b a c t e r i a ,a n dd e t e r m i n e th ei r a b i l i t y t oNf i x a t i o n ,a n t a g o n i s t i c a b i l i t y a g a i n s t p l a n t p a t h o g e n i c ．T h es p e c i e so f s t r a i n sw e r e i d e n t i f i e db a s e do n m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d t h e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so f p a r t i a l１６Sr D N A s e q u e n c e ．T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt w on i t r o g e n Ｇf i x i n g s t r a i n s o fL J Ｇ１(A c i n e t o b a c t e r s p ．)a n dL J Ｇ２(R h i z o b i u m s p ．)w e r e i s o l a t e df r o mt h e l e a v e so f p e p pe ra n dt h e n i t r o g e n a s e a c t i v i t y w a s９３．２６a n d１０２．２３U L －１,r e s p e c t i v e l y ．T h e t w os t r a i n sh a db r o a d Ｇs p e c t r u ma n t if u n ga l a c t i v i t y a n d a c i d Ｇa l k a l i r e s i s t a n c e ,a n d t h e i n h ib i t o r y e f f ec t s a g a i n s t S c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m ,B o t r y t i s c i n e r e a ,R h i z o c t o n i a s o l a n i w e r em o r e t h a n５０％．T h e p h y l l o s p h e r en i t r o g e n Ｇf i x i n g s t r a i n sL J Ｇ１a n dL J Ｇ２h a dn i t r o ge nf i x a t i o na n db i o c o n t r o l f u n c t i o n s ,w h i c hc o u l d p r o v i d e m i c r o b i a l r e s o u r c e sf o rd e v e l o p m e n to f p h y l l o s p h e r e n i t r og e n Ｇf i x i n g ba c t e r i a f e r t i l i z e r ．K e yw o r d s :p e p p e r ;p h y l l o s p h e r en i t r o g e n Ｇf i x i n g b a c t e r i a ;i s o l a t i o na n ds c r e e n i n g ;c u l t u r ec o n d i t i o n s ;a n t i f u n g a l a c t i v i t y６６Copyright ©博看网. 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大豆秸的固氮菌分离鉴定及其促进作用

大豆秸的固氮菌分离鉴定及其促进作用植物固氮是农业生产中一种重要的氮素来源，而大豆是农业上最重要的豆科作物之一。

在大豆的生长过程中，土壤中氮素的供应是至关重要的，但是传统的氮肥施用会造成土壤的环境污染和健康风险。

因此，研究土壤中的固氮菌是一种可持续的替代方法，有助于提高大豆的产量和品质，并减少环境污染。

固氮菌是一种能够将大气中的氮气转化为植物可利用的形式的微生物。

这些微生物通过共生作用在根际形成能固氮的固氮结瘤，并为植物提供氮素。

因此，从大豆秸中分离和鉴定具有固氮菌功能的微生物，对于增加土壤中的固氮菌数量以及提高大豆的固氮能力非常重要。

首先，为了分离和筛选出具有固氮功能的菌株，我们可以将大豆秸放入适当的培养基中，利用选殖方法进行菌株筛选。

培养基的配方可以包含低氮条件下的碳源和能够促进菌株生长的其他营养物质。

通过这种方法，我们可以从大豆秸中分离出一系列菌株。

接下来，我们需要对这些分离出的菌株进行鉴定。

鉴定可以包括形态学观察、生理生化特性检测以及分子生物学方法。

形态学观察可以包括菌株的菌落形态、细胞形态和孢子形态等方面。

生理生化特性检测可以包括菌株的酶活性、代谢产物等的检测。

分子生物学方法可以通过PCR扩增16S rRNA基因，然后进行序列分析，以确定菌株的系统发育位置。

通过对分离出的固氮菌进行鉴定，我们可以获得这些菌株的具体分类信息，并了解它们在系统进化中的关系。

此外，我们还可以评估菌株的固氮能力，通过固氮酶活性的测定、硝酸盐还原能力的测定等方法来评价菌株的固氮能力。

固氮菌的应用可以通过固氮结瘤作用促进大豆的生长和发育。

首先，在大豆根际形成的固氮结瘤中，固氮菌通过将大气中的氮气转化为植物可利用的氨来供应植物的氮素需求。

这种固氮结瘤作用可以提高大豆的氮素利用效率，降低对氮肥的依赖，并减少氮肥施用造成的土壤污染。

另外，固氮菌还能够促进大豆的根系生长和发育。

固氮结瘤的过程中，固氮菌释放出一些生长调节物质，例如生长素和激素样物质，可以促进大豆的根系生长和发育。

一株产 PHB 固氮菌的筛选和初步鉴定

一株产 PHB 固氮菌的筛选和初步鉴定李贵正;涂国全;刘纪臣;李新柱【摘要】Eight nitrogen -fixing bacteria were isolated from the activated sludge from sewage farm of Kingenta by enriching culture and isolating in Ashby medium.Three strains producing PHB were obtained by Suda black staining.Strain N1 was regarded as the best one by the PHBdiameter,content of PHB account for cell dry weight and the colony growth rate.Strain N1 was preliminary identified as Azotobacter chroococcum.%经 Ashby 培养基富集培养及平板分离，从金正大污水处理厂的活性污泥中分离到8株自生固氮菌。

经苏丹黑染色初筛获得3株产 PHB 菌株。

以菌株产生的 PHB 颗粒大小、PHB 占细胞干重的含量及菌落生长速度为指标，获得最佳菌株 N1。

通过《伯杰氏细菌学鉴定手册》第九版初步鉴定此菌株为圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）。

【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】3页(P49-51)【关键词】固氮菌;PHB;初筛;复筛;圆褐固氮菌【作者】李贵正;涂国全;刘纪臣;李新柱【作者单位】金正大生态工程集团股份有限公司，山东临沭 276700;江西农业大学生物科学和工程学院，江西南昌 330045;金正大生态工程集团股份有限公司，山东临沭 276700;金正大生态工程集团股份有限公司，山东临沭 276700【正文语种】中文【中图分类】Q939.11+3随着人们环保意识的日益提高，研究可降解塑料成了当务之急，寻找可降解的替代品势在必行。