固氮菌筛选
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3、菌株复筛--固氮酶活性的测定
将筛选纯化出的菌株接入已灭菌的装有70~80mlAshby无氮液体培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床上，以120rpm的震荡速度在37℃下振荡培养2~3天，然后各取20ml培养的菌液分别注入已灭菌的带反口胶塞的250ml注射瓶，把反口胶塞塞紧，抽出10ml空气，再注入10ml高纯乙炔，封好瓶塞，置于摇床上26℃振荡培养1h，而后抽取600ul气体测定C2H2、C2H4的组成情况。以注射了高纯乙炔但未加菌液的注射瓶做对照。从气相色谱仪显示屏的C2H4 峰值判断有无C2H4的产生。按下列公式计算固氮酶活性：
4、固氮菌菌种的鉴定
形态学鉴定：将筛选出来的具有固氮能力的菌株在琼脂平板上培养，观察细菌菌落生长特性，主要是其菌落形状、大小、颜色、透明度、边缘特性、隆起程度等，并做详细记录。同时用接种环挑取单菌落上的细菌进行革兰氏染色和芽孢染色，镜检，记录结果。如有条件可用透射电镜观察细菌细胞大小、形状、鞭毛、有无孢囊、有无荚膜，初步确定科属。
生理生化鉴定：对筛选的菌株通过各种生化特性试验和糖发酵实验等鉴定到种。
分子生物学鉴定：提取解磷菌的基因组DNA并对其核糖体的16SrRNA保守型序列进行PCR扩增，PCR扩增产物切胶回收、克隆、测序并用DNAStar分析软件将其序列与GenBank中近缘种序列进行同源性比对。
5、固氮菌的扩大培养
四川超益环保科技有限公司
式中，hx为样品C2H4峰面积，hs为标准C2H4峰值，C为标准C2H4 浓度(nmol•mlL−1)， V 为试管体积(mL)，常数为标准C2H4 在测试时的体积(mL)，t为样品培养时间(h)，N为产生的C2H4 浓度[即固氮酶活性，nmol(C2H4)•h−1•mL−1]。将不同菌株固氮酶活性比较，筛选出活性最高的菌株。
技术中心
2013年8月14
3、ACCC55培养基
药剂
质量/g
蔗糖
10Baidu Nhomakorabea
NaCI
0.2
CaCO3
1
KH2PO4·3H2O
0.5
MgSO4·7H2O
0.2
调节pH到7.0--7.2,加蒸馏水定容到1 000 mL，用于自生固氮菌的筛选、驯化。
上述ACCC55液体培养基中加人琼脂粉15~20 g定容到1000ml，成为ACCC55固体培养基，用于斜面保藏及平板培养。
三、自生固氮菌筛选方法
1、土壤样品的生物富集
分别取保存的土样各5g，放入250 mL锥形瓶中，加95mL无菌水和玻璃珠，150r/min，28℃振荡30 min，制备成母液。
2、菌株初筛
采用梯度稀释法，将母液稀释至10-7-10-1倍，并分别用微量移液枪取0.2 mL接种于Ashby无氮固体培养基平板中，涂布均匀，待接种液被培养基吸收后，倒置培养于对应温度的恒温恒湿培养箱中，28℃培养5d。当培养基上长出菌落时，对菌落进行观察和记录。将培养基上形成的单菌落分离出来在该培养基上连续转6代，今儿纯化筛选出固氮活性较高的固氮菌菌株。将该菌株接种到斜面培养基上，在28℃培养2d后4℃保藏备用。全部操作均在无菌条件下进行。
药剂
质量/g
甘露醇
10
NaCI
0.2
CaCO3
5
KH2PO4
0.2
MgSO4·7H2O
0.2
CaSO4·2H2O
0.1
调节pH到7.0--7.2,加蒸馏水定容到1 000 mL，用于自生固氮菌的筛选、驯化。
上述Ashby无氮液体培养基中加人琼脂粉15~20 g定容到1000ml，成为Ashby无氮固体培养基，用于斜面保藏及平板培养。
二、培养基配制
1、牛肉膏蛋白胨液体培养基
药剂
质量/g
牛肉膏
5
蛋白胨
10
NaCI
5
调节pH到7.0--7.2,加蒸馏水定容到1 000 mL，用于解磷菌的培养。
上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中加人琼脂粉15~20 g定容到1000ml，成为牛肉膏蛋白胨固体培养基，用于斜面保藏及平板培养。
2、Ashby无氮液体培养基
土壤中自生固氮菌
四川超益环保科技有限公司
成都市具鑫机械制造有限公司
2013年8月14日
土壤中自生固氮菌的筛选、培养、驯化、扩种和保存
一、样品采集
选取豆科植物、水果、块茎植物、油料作物等有代表性的植物根系土壤，确定采样地点。按对角交叉（五点法）取样：用灭菌工具先除去地表枯枝落叶，再铲除1cm左右表层土，以避免地面微生物与土样混杂；用烧灼过的勺（铲）取土样约200～300g，装于灭菌容器内，并注意保留适当空间，混合后，标明采样地点、栽种作物、深度、日期。
将筛选纯化出的菌株接入已灭菌的装有70~80mlAshby无氮液体培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床上，以120rpm的震荡速度在37℃下振荡培养2~3天，然后各取20ml培养的菌液分别注入已灭菌的带反口胶塞的250ml注射瓶，把反口胶塞塞紧，抽出10ml空气，再注入10ml高纯乙炔，封好瓶塞，置于摇床上26℃振荡培养1h，而后抽取600ul气体测定C2H2、C2H4的组成情况。以注射了高纯乙炔但未加菌液的注射瓶做对照。从气相色谱仪显示屏的C2H4 峰值判断有无C2H4的产生。按下列公式计算固氮酶活性：
4、固氮菌菌种的鉴定
形态学鉴定：将筛选出来的具有固氮能力的菌株在琼脂平板上培养，观察细菌菌落生长特性，主要是其菌落形状、大小、颜色、透明度、边缘特性、隆起程度等，并做详细记录。同时用接种环挑取单菌落上的细菌进行革兰氏染色和芽孢染色，镜检，记录结果。如有条件可用透射电镜观察细菌细胞大小、形状、鞭毛、有无孢囊、有无荚膜，初步确定科属。
生理生化鉴定：对筛选的菌株通过各种生化特性试验和糖发酵实验等鉴定到种。
分子生物学鉴定：提取解磷菌的基因组DNA并对其核糖体的16SrRNA保守型序列进行PCR扩增，PCR扩增产物切胶回收、克隆、测序并用DNAStar分析软件将其序列与GenBank中近缘种序列进行同源性比对。
5、固氮菌的扩大培养
四川超益环保科技有限公司
式中，hx为样品C2H4峰面积，hs为标准C2H4峰值，C为标准C2H4 浓度(nmol•mlL−1)， V 为试管体积(mL)，常数为标准C2H4 在测试时的体积(mL)，t为样品培养时间(h)，N为产生的C2H4 浓度[即固氮酶活性，nmol(C2H4)•h−1•mL−1]。将不同菌株固氮酶活性比较，筛选出活性最高的菌株。
技术中心
2013年8月14
3、ACCC55培养基
药剂
质量/g
蔗糖
10Baidu Nhomakorabea
NaCI
0.2
CaCO3
1
KH2PO4·3H2O
0.5
MgSO4·7H2O
0.2
调节pH到7.0--7.2,加蒸馏水定容到1 000 mL，用于自生固氮菌的筛选、驯化。
上述ACCC55液体培养基中加人琼脂粉15~20 g定容到1000ml，成为ACCC55固体培养基，用于斜面保藏及平板培养。
三、自生固氮菌筛选方法
1、土壤样品的生物富集
分别取保存的土样各5g，放入250 mL锥形瓶中，加95mL无菌水和玻璃珠，150r/min，28℃振荡30 min，制备成母液。
2、菌株初筛
采用梯度稀释法，将母液稀释至10-7-10-1倍，并分别用微量移液枪取0.2 mL接种于Ashby无氮固体培养基平板中，涂布均匀，待接种液被培养基吸收后，倒置培养于对应温度的恒温恒湿培养箱中，28℃培养5d。当培养基上长出菌落时，对菌落进行观察和记录。将培养基上形成的单菌落分离出来在该培养基上连续转6代，今儿纯化筛选出固氮活性较高的固氮菌菌株。将该菌株接种到斜面培养基上，在28℃培养2d后4℃保藏备用。全部操作均在无菌条件下进行。
药剂
质量/g
甘露醇
10
NaCI
0.2
CaCO3
5
KH2PO4
0.2
MgSO4·7H2O
0.2
CaSO4·2H2O
0.1
调节pH到7.0--7.2,加蒸馏水定容到1 000 mL，用于自生固氮菌的筛选、驯化。
上述Ashby无氮液体培养基中加人琼脂粉15~20 g定容到1000ml，成为Ashby无氮固体培养基，用于斜面保藏及平板培养。
二、培养基配制
1、牛肉膏蛋白胨液体培养基
药剂
质量/g
牛肉膏
5
蛋白胨
10
NaCI
5
调节pH到7.0--7.2,加蒸馏水定容到1 000 mL，用于解磷菌的培养。
上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中加人琼脂粉15~20 g定容到1000ml，成为牛肉膏蛋白胨固体培养基，用于斜面保藏及平板培养。
2、Ashby无氮液体培养基
土壤中自生固氮菌
四川超益环保科技有限公司
成都市具鑫机械制造有限公司
2013年8月14日
土壤中自生固氮菌的筛选、培养、驯化、扩种和保存
一、样品采集
选取豆科植物、水果、块茎植物、油料作物等有代表性的植物根系土壤，确定采样地点。按对角交叉（五点法）取样：用灭菌工具先除去地表枯枝落叶，再铲除1cm左右表层土，以避免地面微生物与土样混杂；用烧灼过的勺（铲）取土样约200～300g，装于灭菌容器内，并注意保留适当空间，混合后，标明采样地点、栽种作物、深度、日期。