自生固氮菌微生物的筛选与生物学特征的研究1

自生固氮菌微生物的筛选与生物学特征的研究

引言

氮元素是农作物生长必不可少的一种元素，而它作为农肥的主要成分之一，能提高农作物产量，使作物在贫瘠的土壤上也能获得丰硕的成果。然而，工业固氮的成功使得人们忽略了原本更加天然的固氮方式-使用固氮菌。在全球人口呈现爆炸上升趋势的同时，人们需要。农业生产提供大量的粮食以满足温饱，这就导致工业固氮产业的蓬勃发展。但谁也没想到大量使用氮肥正威胁着人类赖以生存的地球环境：高浓度的氮氧化物是产生颗粒物和地面大气臭氧的重要原因。红潮等的多次出现，杀死数以万计的鱼类，都是由于许多农作土壤也呈氮肥饱和趋势，多余的活性氮肥都被排进湖海之中，最终导致富营养化。

为了达到科学而且环保的目的，只有利用固氮生物进行绿色氮肥的生产，这样不仅可以节省生产氮肥的成本而且还不会造成活性氮流失事实上，许多试验都证明在某些环境状态下，接种的固氮菌对植物田有很大的帮助作用，这是由于固氮菌能在常温常压条件下，通过其体内固氮酶的作用，把空气中的氮固定下来形成氨，进一步变成植物可利用的氨素，从而让土壤中固定的氮元素增加，本实验主要是对自生固氮菌的筛选以及其生物学特征的研究。

1.材料和方法

1.1无氮培养基（富集培养）配方：

葡萄糖10克磷酸二氢钾0.2克硫酸镁0.2克

硫酸钙0.2克氯化钠0.2克碳酸钙 5.0克

琼脂20克蒸馏水1000mL PH 6,5—7..0

瓦克斯曼77号培养基（分离培养）

葡萄糖10克磷酸二氢钾0.5克MgSO4.7H2O 0.2克

1%MnSO4.4H2O溶液2滴1%FeCl3溶液2滴

蒸馏水1000mL 琼脂20克PH 7.0—7.2

1.2自生固氮菌的生态分布

1.2.1土样采集：选定肥沃菜园土采集土样时，先铲去1-4厘米的部分，去5-10厘米深层土样，记录采集土样的时间地点和日期，带回实验室备用。

1.2.2土样备用：将采集的土样放入28摄氏度恒温箱中，不仅可以活化菌，而且还可以干燥土壤，便于土样播撒。

1.2.3自生固氮菌的分离：配制无氮培养基，并将其进行灭菌，冷却至适当温度，倒入灭过菌的培养基中，待凝后地面朝上备用（防止水汽污染）.

将恒温箱中的土样取出，将欲分离的土样均匀地撒在无菌的无氮培养基平板上，每块平板分别撒0.25克，共撒三块平板。在培养基上表明土样号，分离日期，将培养皿倒置。放入28—30摄氏度下培养4-7天。

1.2.4当土粒周围长出浑浊，半透明的胶状菌落时，对菌落特征进行观察，计数和编号。

1.3自生固氮菌的纯化：

1.3.1将融化的改良瓦克斯曼77号培养基倒入无菌平板中，凝固后将平板放入65~70摄氏度的烤箱中烘烤15~20min，以除去平板表面的水分。将土样或加富后的土粒样品用无菌水分别稀释至0.1，0.001，0.0001稀释度，并将各稀释度的菌落0.1mL加在平板上，用无菌刮铲涂匀后，放在28~30摄氏度恒温箱中培养7天，经过一周后长出的菌落既为好气性自生固氮菌。

1.3.2挑菌培养并保存

挑取纯化的菌落转接到适当的培养基斜面上置于28~30摄氏度下培养好后，放入冰箱中保存备用。

1.4固氮菌的鉴定

1.4.1自生固氮菌的鉴定

1.4.1菌落特征观察

将待鉴定菌株活化后，取少量菌体在无氮培养基平板表面划线，使生长出单个菌落来。28-30摄氏度培养四天，观察菌落颜色，形状，大小，透明度和粘度，边缘和隆起形状，表面光滑程度以及是否产生非水溶性色素。

1.4.2革兰氏染色与菌体形态的观察

以划线培养处于对数生长期的培养物涂片，干燥后用火焰固定，先用结晶紫染色1min，水洗。再用碘液媒染1min,水洗，再用95%的乙醇脱色30秒，水洗，最后用番红或沙黄复染2min.,水洗，晾干。用显微镜观察菌体形态和革兰氏染色反应性。

1.4.3鞭毛染色

采用硝酸银染色法。

1.4.4荚膜染色

采用湿墨水法。挑取该类型菌落的少量菌体与载玻片的一滴黑色墨水相混合后，加盖玻片放入显微镜下检验。

1.4.5过氧化氢酶的测定

用接种环取一环菌体涂抹于已滴有5%过氧化氢的玻片上，观察如有气泡产生则为接触酶阳性，否则为接触酶阴性。

1.5固氮酶活性的测定

分离所得到的菌还应测定其固氮酶的活性，才能肯定其最后是否为固氮菌。

固氮菌是多功能的氧化还原酶，除了还原N2以外，还能还原多种类型的底物，如乙炔，氰化物，叠氮化物，氢离子等。

1.5.1反应机制：微生物能够在常温常压下固氮是靠固氮酶的催化分子氮还原成氨，如测得反应后氨的含量高，则固氮酶的活性大。

1.5.2测定方法：

1.用乙炔还原法测定其固氮酶活性。

2. 凯氏定氮法测定固氮酶的活性。

2结果与分析

2.1自生固氮菌的测定

通过菌种鉴定，发现三种固氮菌，现分别命名为a,b,c.分别划线分离纯化，观察并测定其理化实验鉴定，结果如下表1：

鉴定项目 a b c

菌落特征观察单个菌落，白色扁平，

边缘不整齐，干燥有

皱，生长良好。单个菌落圆形，半透

明，乳白色，表面湿

润光滑，中间凸起，

粘稠状，边缘较整齐，

培养至后期，菌落呈

黑褐色。

单个菌落圆形，白色

湿润，边缘不整齐，

菌落大，生长良好。

革兰氏染色阴性（在显微镜下，

菌体细胞多为卵圆形

大小为 2.3-3.4×

2.0-

3.4um(常亮亮相

连成“8”字型)，或

不规则成堆）。

阴性阴性

鞭毛染色无鞭毛，不能运动有鞭毛，能运动有鞭毛，能运动

荚膜染色用显微镜观察，可以

看到其周围呈现明亮

的透明圈即荚膜。用显微镜观察，可以

看到其周围呈现明亮

的透明圈即荚膜。

用显微镜观察，可以

看到其周围呈现明亮

的透明圈即荚膜。

过氧化氢酶测定立即产生气泡，接触

酶阳性。立即产生气泡，接触

酶阳性。

立即产生气泡，接触

酶阳性。

自生固氮菌的富集培养（图为后期，有的菌落呈现胶状，黑褐色）