耐盐碱自生固氮菌的分离与纯化实验论文

耐盐碱自生固氮菌的分离纯化

1428宿舍全体成员

（延安大学生命科学学院，陕西延安716000）

摘要：采用改良的无氮培养基，从盐碱化土壤中分离出了3株具有耐盐碱能力的固氮菌，编号为：HY-4，MZ-1，JB-2。通过对固氮菌的形态观察鉴定，初步判断为固氮菌。探讨了HY-4，MZ-1，JB-2对酸碱度、渗透压浓度的适应性，结果表明了3株菌具有一定的耐盐碱能力。[1]

关键词：固氮菌；盐碱土；分离纯化；OD600值。

前言：近年来，化肥对农业生产的负面影响及对环境的污染日益引起人们的关注，生物肥料的研究应用在我国兴起。由于固氮菌能固定大气中的氮气，提高土壤的氮含量，因而接种固氮菌能促进盐碱环境下植物的生长，所以固氮菌成为了一个研究新宠。我国部分地区存在盐碱地，是一个很好的耐碱固氮菌资源库，若能将其中的耐盐碱固氮菌作用植物，在一定程度上就能实现促进植物生长，达到改良盐碱地的目的。本研究的目的是采用改良的无氮培养基从土壤中分离筛选出具有一定耐盐碱性自生固氮能力的细菌，研究酸碱度、渗透压对其生长情况的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试样品和培养基

土样于2011年5月份从陕西省靖边西草滩，米脂官庄村金泰氯碱厂，安康汉阴采集盐碱化的土壤。采样深度为5~15cm

牛肉蛋白胨培养基

Ashby无氮培养基[2]：甘露醇10g、KH2PO40.2g、NaCl0.2g、CaSO4·2H2O0.2g、MgSO40.2g、蒸馏水1000ml、PH=7

根据土壤盐碱度分析数据改良Ashby选择无氮培养基[3]

1.1.2试剂

甘露醇

KH2PO4（天津市化学试剂三厂）

CaSO4（分子实验室提供）

MgSO4（重庆北培化学试剂厂）

1.1.3仪器

高压灭菌锅(LS-350L型立式压力蒸气灭菌器江阴滨江医疗设备厂)

培养箱(DNP-9052型上海精宏实验设备有限公司)

摇床(ZJS-1320型科大创新股份有限公司中佳分公司)紫外可见分光光度计(ＵＶＭＩＮＩ－１２４０苏制１０５０００１１１号)

PH计(上海康仪)

1.2方法

1.2.1土壤分析[4]

将三个地方的土样分别称取6g，分别放入盛有60ml无菌水的3个三角瓶中，并置于170r/min，30℃的摇床中，一天后取出，制得样品土壤浸出液，并用PH计测出样品土壤中的酸碱度。

1.2.2自生固氮菌的分离纯化

将已置好的样品土壤浑浊液，分别在试管中进行浓度梯度稀释。选取三个稀释度

（10-4~10-6）的稀释液0.1ml涂布于Ashby无氮固体培养基上，每个浓度重复3皿。把已涂好的培养皿放入30℃的培养箱内恒温培养3~5天后，挑取生长较大及不同形态菌落纯化数次，直到有规则单菌落出现，将单菌落转至斜面培养基，直至菌落长起，置于4℃冰箱保存，备用。

1.2.3耐盐碱固氮菌的筛选

将已保存的各菌株接种到150ml装有60ml无氮液体培养基的三角瓶中，30℃，170r/min，培养四天后，再接种到150ml装有60ml改良后的无氮液体选择培养基中，30℃，170r/min扩大培养，摇瓶培养5天后，测定菌液的OD600值，筛选出具有一定耐盐碱性的菌株。以上每个步骤均设3个重复和1个空白对照。

1.2.4菌株的鉴定

将筛选出的具有一定耐盐碱能力的菌株分别接种到Ashby无氮培养基平板上，30℃倒置培养5天，观察其菌落形态特征。利用革兰氏染色镜检观察菌体形态。

1.2.5渗透压对耐盐碱固氮菌生长影响的探究

根据土壤分析结果把JB-2，MZ-1，HY-4的Ashby无氮液体培养基的PH分别固定为

9.00，8.00，7.00，将NaCl浓度设为0.5%，1%，2%，3%，4%，5%，同样将3株菌

的菌悬液2ml接入其中，置于30℃，170r/min的摇床培养1天，测定其OD600值。设置3个重复和1个空白对照。

1.2.6酸碱度对耐盐碱固氮菌生长影响的探究

把Ashby无氮液体培养基的起始PH值设定在6.5,7.5,8.5,9.5,10.5,11共6个水平，NaCl 浓度为2%，将3株菌的菌悬液接入2ml装有液体培养基的摇瓶中，置于30℃，170r/min 的摇床培养一天，测定其OD600值。并设置3个重复和1个对照。

2结果与分析

2.1土壤分析结果

通过对样品土壤的简单分析，知道了3个地方土样中大概的酸度。如下表一：

表一样品土壤酸度

样品PH值

靖边9.20

米脂8.30

汉阴7.94

依据土壤分析后的数据，可为选择培养基，配置不同PH和盐度的培养基提供一定的依据。

2.2自生固氮菌株的分离纯化的结果

利用无氮培养基平板，从供试的3个地方的土壤样品中分离出了具潜在固氮能力的，菌落形态不同的9株菌。

3个地区的样品中，汉阴样品土壤中的固氮细菌数量和种类比较多，菌落类型数量约为5个，靖边、米脂土壤中固氮细菌数量和种类较少，且二者数量差异不大，菌落类型数量在2~5个。

2.3耐盐碱固氮菌的分离纯化结果

将9种菌株在加有高盐和高碱的无氮液体选择培养基中连续培养后，测得OD600值。结果表明，其中3株菌（HY-4，MZ-1，JB-2）的OD600值分别为：0.463，0.471，0.492.

它们为长势较好的优势菌，具有一定的耐盐碱能力。

2.4菌株的鉴定结果

在Ashby无氮固体培养基上，HY-4菌株的菌落呈圆形，不透明，湿润粘稠状；MZ-1菌株的菌落呈小圆形，不透明；JB-2菌株的菌落呈煎蛋形，中间为乳白色，四周透明。

染色表明，3株菌都为革兰氏阴性菌，短杆状，单生对生皆有，成对的菌体呈“∞”排

列。

3株菌经过其形态上简单、粗糙的鉴定，可初步判断为自生固氮菌，且具有一定的耐盐

碱能力。

2.5渗透压对耐盐碱固氮菌生长影响

为了考察固氮菌对渗透压的适应能力，我们测定了3株菌在不同NaCl浓度下，菌生长

的OD600值。

表二：不同的NaCl浓度下菌生长的OD600值

样品PH0.5%1%2%3%4%5% HY-47.000.6590.6620.6890.3870.1760.127 MB-18.000.6610.6740.7160.3940.1820.128 JB-29.000.6650.6760.7340.4830.2730.228

3株菌具有相似的变化趋势，当NaCl浓度为2%时，菌生长的OD600值最大；当NaCl

浓度达到4%时，菌生长的OD600值低于0.3；而当NaCl浓度在0.5%~3%时，菌生长的

OD600值保持在0.3~0.8之间，表现出一定的嗜盐性。

在一般的盐碱地0~15cm深土壤含盐量在0.5%~4%之间，即使是在重度盐碱化区的表层

土中，含盐量只在1%~10%之间。[5]

因此，如果不考虑土壤其它因素的影响，3株菌都能适应一定的盐碱土环境。

2.6酸碱度对菌生长的影响

HY-4，MZ-1，JB-2的生长情况在不同初始PH值条件下的变化情况如下表三及图1所示。

表三不同PH下菌生长的OD600值

样品PH=6.5PH=7.5PH=8.5PH=9.5PH=10.5PH=11

HY-40.2420.4190.6870.5700.4630.304

MZ-10.2720.4240.7190.5850.4700.347

JB-20.2830.4320.7390.5970.4950.433

图1不同PH下菌生长的OD600值折线图

从总体变化来看，3株菌在PH=8.5时OD600值最大，在PH处于7.5~11之间时都可生长

较好，OD600值在0.3~0.8之间，且变化不是特别明显，这说明菌对酸碱度，尤其是碱度

具有比较好的适应性。

其中JB-2的OD600值比HY-4，MZ-1的OD600值大，说明它在碱性环境下生长比其它2

株菌相对较好。

3讨论