点突变的检查方法 - 上海交通大学

• 直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型 DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异 源杂合双链DNA在其错配处会形成突起，在非 变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链 DNA不同的迁移率。 • HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作 用，二者结合使用，可使突变检出率提高近 100%。
突变体富集PCR (mutant-enriched PCR)
Baidu Nhomakorabea
化学切割错配法(Chemical cleavage of mismatch，CCM)
• 基本原理：
• 将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片 段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合 的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或 哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割， 经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。
等位基因特异性寡核苷酸分析法 (allele-specific oligonucleotide ASO)
第九章 点突变的检查方法
基因突变的检测方法
• 目前几乎所有的基因突变检测的分子诊 断技术都是建立在PCR的基础上，由 PCR衍生出的新方法不断出现，自动化 程度越来越高，分析时间大大缩短，分 析结果的准确性也有了很大提高。
PCR-SSCP法 单链构像多态性 (single-strand conformational polymorphism, SSCP) • 基本原理： • 单链DNA在中性条件下会形成二级结 构，这种二级结构依赖于其碱基组成， 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA和RNA分子依其碱基序列不同而形 成不同构象，一个碱基的改变将影响其 构象而导致其在凝胶上移动速度改变， 不同的二级结构而出现不同的迁移象。
• 利用癌基因或抑癌基因某个编码子部位 存在已知的限制性内切酶位点，用连续 二次的巢式PCR来扩增包括存在酶位点 编码子的DNA片段，在两次扩增反应之 间用相应的内切酶消化扩增的DNA片 段，野生型因被酶切而不能进入第二次 PCR扩增，而突变型则能完整进入第二 次PCR扩增并得到产物的富集。
变性梯度凝胶电泳法 (denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)
• 该法不能测定突变的准确位点，还需通 过序列分析来确定。对于大于200bp的片 段，用其DNA分子来做SSCP会提高其灵 敏度。 • 该法简单快速，被广泛用于未知基因突 变的检测。由于该法的简便快速，特别 适合大样本基因突变研究的筛选工作。
杂合双链分析法 (heterodulex analgsis, HA)
• 设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其 中包含了发生突变的部位，以此为探 针，与固定在膜上的经PCR扩增的样品 DNA杂交。 • 可以选用各种突变类型的寡核苷酸探 针，同时以野生型探针为对照，如出现 阳性杂交带，则表示样品中存在与该 ASO探针相应的点突变。
• 双链DNA在变性梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝胶中 自上而下所含变性剂浓度线性增长，DNA片段进行到 变性剂某一浓度，与DNA变性温度一致的凝胶位置 时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，但解链的 DNA链中有一个碱基改变时，会在不同时间解链，则 因影响电泳速度变化的程度而被分离。
• 在DGGE基础上，又发展了用温度梯度代替化学 变性剂的TGGE法(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)。 • 由于DGGE和TGGE是利用温度和梯度凝胶迁移 率来检测，均需专用的电泳装置。