农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用

中国稻米 2007 年第 3 期
GFP , 因其独特的荧光特性 , 也可用于筛选 。水稻不同 亚种对筛选压敏感度不一样 。籼稻品种的筛选以 G418 150～200 mg/ L 、Hyg 30～40 mg/ L ,Basta l0～20 mg/ L 的 浓度范围为宜 , 而粳稻品种则以 G418 200～250 mg/ L、 Hyg 40～50 mg/ L、Basta 20～30 mg/ L 的浓度范围为宜 。 [26 ]
在外植体的选择上 , Smith 和 Hood [5 ] 认为 , 用农杆 菌转化单子叶植物 , 应选择处于适宜生理状态的那些 组织 ,其特点是 :能够产生 vir 基因活化分子 ;内源激素
收稿日期 :2007 - 01 - 18
潘素君等 :农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用
浓度适宜 ;农杆菌比较容易附着于细胞壁上 ;细胞分裂 旺盛 ,DNA 大量合成 ,有利于 T- DNA 的摄入和整合 。 愈伤组织培养细胞是获得转基因水稻的最好来源 , 处 于胚胎发育阶段的愈伤组织是有效转化的重要因素 。 这些愈伤组织能从成熟胚或未成熟胚 、幼穗 、苗尖 、茎 尖 、盾片 、花粉中获得 , 长期培养不会显著影响转化效 率。 2. 3 水稻基因型
专论与综述
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农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用
潘素君 1 ,2 戴良英 1 ,2 刘雄伦 2 王国梁 2 ,3
(1 湖南农业大学生物安全科技学院 ,湖南 长沙 410128 ; 2 湖南农业大学水稻基因组学实验室 ,湖南 长沙 410128 ; 3 美国俄亥俄州立大学植物生理实验室 ,美国 俄亥俄州 43210)
启动子的种类与靶细胞中基因的表达水平密切相 关 。水稻基因转化中所使用的启动子主要有 :CaMV35S 启动子 、Nos 启动子 、Actl 启动子 、果蝇 copia 启动子 、章 鱼碱 2′启动子 、章鱼碱 l′启动子 、玉米醇溶蛋白 4 启动 子 、玉米 Achl 启动子 、Mas 启动子 、p Emu 启动子 、Actin 启动子 、Ubiquitin 启动子 、玉米 Ubil 启动子等 。章鱼碱 2′启动子的表达强度是 CaMV35S 启动子的 3 - 4 倍 , Actl 启动子的表达强度是 CaMV35S 启动子的 100 倍 。 并且 , CaMV35S 启动子在禾谷类作物中的表达强度比 在双子叶植物中低 100 倍 [23 ]。p Emu 启动子 、Actin 启动 子 、Ubiquitin 启动子等比 CaMV35S 启动子更有效促进 单子叶植物中外源基因的表达 [25 ]。
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基 因 , 根据其在植物体内的瞬间表达可快速检测转化系 统的有效性和外源基因在受体内的表达情况 。报告基 因必须具有两大特点 : 一是表达产物及产物的类似功 能在未转化的植物细胞内并不存在 ;二是便于检测 。目 前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基 因 。主要有β - 葡萄糖苷酸酶基因 ( gus 基因) 、氯霉素p) 等 。其中β - 葡萄糖苷酸酶基因在植物细胞中产生葡 萄糖苷酶 , 这种酶在一定的条件下与 X - gal 底物发生 作用 ,产生蓝色沉淀反应 。其操作简便 ,易于检测 ,是目 前植物转化研究中应用最广泛 、最有效的一个报告基 因。 2. 7 启动子
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编码 PPT乙酰转移酶 ( PAT) , PAT催化乙酰辅酶 A 的 乙酰基转移到膦丝菌素 ( Phosphinothricin , PPT) 的氨基 上 , 形成乙酰 PPT而使 PPT失活 , 对广谱除草剂 basta 的 活 性 组 分 PPT 及 除 草 剂 Herbiace 的 活 性 组 分 bialaphos 均有抗性 。bar 基因在水稻转化中广泛使用 [20 - 22 ]。新霉素磷酸转移酶基因编码产物对某些氨基葡 萄糖苷 (aminoglycosid) 类抗生素如卡那霉素 、新霉素 、 G418 等具有抗性 , 可以利用这些抗生素作为选择剂 。 但对水稻而言 , G418 的选择效果较好 [23 ]。 2. 6 报告基因
在植物的遗传转化中 , 选择标记基因对受体组织 和植株进行筛选 。其原理是选择标记基因的产物对选 择剂产生抗性 , 转化细胞在一定选择压下 , 能正常生 长 、发育 、分化 , 而未转化的细胞则因对选择压不具有 抗性其生长发育受阻或死亡 , 从而将阳性植株筛选出 来 。目前水稻中常用的选择标记基因主要有三类 :潮霉 素磷酸转移酶基因 ( hpt 基因) 、新霉素磷酸转移酶基因 ( npt 基因) 和除草剂抗性基因 ( bar 基因) 。hpt 基因的 表达产物可通过酶促磷酸化作用而使潮霉素 ( Hygromycin , Hyg) 失活 ,从而产生抗性 。在农杆菌转化 中 , hpt 基因一直作为有效的标记基因 [16 - 19 ]。bar 基因
优化组织和共培养条件是水稻转化成败的一个关 键因素 。基本培养基有 MS、N 6、NB 和 CC。NB 适合粳稻 愈伤组织的诱导 , 粳稻的愈伤组织诱导 、继代 、分化成 苗等都已成为一般实验室的常规操作 , 许多粳稻品种 已经成为细胞遗传操作的模式植物 。NB 对籼稻的愈伤 组织诱导优于 N 6 ,CC 培养基诱导情况较差 [15 ]。培养基 的 p H 值也是一个重要的因素 ,低 p H 值有利于诱导 vir 基因的表达 , 因此农杆菌在侵染和与愈伤组织共培养 时应处于较低的 p H 值条件下 , 一般为 5. 2。共培养时 间的长短影响到农杆菌的吸附 T- DNA 的转移 。时间 太短 , 附着农杆菌数量少 , T- DNA 转移过程无法完 成 , 而时间太长 , 农杆菌繁殖过多 , 影响转化受体细胞 分裂和再生 。对水稻而言 , 较适宜共培养时间为 2 - 3 天 [16 ]。 2. 5 选择标记基因
尽管利用农杆菌介导转化水稻 3 个亚种粳稻 、籼 稻和爪哇稻都获得了成功 [1 , 6 , 7 ] , 但不同亚种对农杆菌 的敏感度不同 , 相同亚种中不同的品种转化率也存在 很大差异 。农杆菌介导粳稻的转化率一般在 30 %左 右 ,高的可达 64. 6 %和 80 %以上 [8 ,9 ]。虽然近年来农杆 菌转化在籼稻方面取得了可喜的进展 , [10 - 13 ] 但籼稻转 化率仍偏低 ,多数不超过 10 % 。 [14 ] 2. 4 培养基和共培养
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VirD1 和 VirD2 共同作用 , 由 T- DNA 右边界开始 向左边界切割产生一条 T- DNA 链 ( T- 链) , T- 链 5′ 末端与 VirD2 结合 , 其余部分与 VirE2 结合 , 组成 T复合体 。T- 复合体被转移到农杆菌外 ,通过植物细胞 壁上由 VirB 蛋白组成的通道进入到植物细胞内 。VirD2 和 VirE2 上的核定位信号 (NLS) 被转运蛋白识别 , 经过 主动运输过程通过核孔进入细胞核内 , 转入细胞核的 T- DNA 以单拷贝或多拷贝的形式整合到植物染色体 上。
摘 要 : 农杆菌作为一种天然的遗传转化系统 , 在水稻基因工程中倍受重视 。本文概述了农杆菌介导转化水稻 的原理 、影响因素 、遗传改良上的应用及存在的问题 。
关键词 :农杆菌转化系统 ;原理 ;影响因素 ;遗传改良
水稻是全世界最重要的粮食作物之一 , 其栽培面 积和总产量仅次于小麦 。水稻不仅作为食品支持 26 亿 人的生命 , 还是禾谷类作物中开展分子生物学研究的 “模式植物”。随着分子生物学和分子遗传理论的迅速 发展 ,利用遗传工程手段 ,有目的地将外源基因或 DNA 构建导入水稻基因组 ,通过外源基因的直接表达 ,或通 过内源基因表达的调控 ,获得抗病 、抗虫 、抗逆 、高产优 质的优良品种已成为水稻育种的重要手段 。农杆菌介 导法因其简单易行 、转化率高 、可导入较为完整的基 因 、整合位点稳定 、拷贝数低 、外源基因表达比较稳定 而在水稻的遗传转化中得到广泛应用 。
1 农杆菌介导的遗传转化原理
农杆菌转化系统是一种天然的基因转化系统 , 转 化植物细胞的农杆菌有两类 , 即根癌农杆菌和发根农 杆菌 。根癌农杆菌所含质粒是 Ti 质粒 , 发根农杆菌所 含质粒是 Ri 质粒 。在水稻转化中 ,常用的是 Ti 质粒 。 Ti 质粒上含有可转移 DNA( T- DNA) 区 、结合区 (Con) 、 复制起始区 (Ori) 和毒性区 (Vir) 。其中与冠瘿瘤生成有 关的是 Vir 区和 T- DNA 区 。T- DNA 区左右边界各有 25bp 的重复序列 , 左边界缺失仍可致瘤 , 而右边界缺 失则不能致瘤 。两个边界之间是生长素和细胞分裂素 合成基因以及冠瘿碱合成基因 。Vir 区为 30bp , VirA、 VirB 、VirC、VirD、VirE、Vir G、VirH 等七个操纵子 24 个基 因起共调控作用 。当植物受到伤害时 ,将分泌一些酚类 化合物 , 这些酚类化合物一方面通过染色体基因的介 导促使农杆菌向植物受伤的部位移动并附着于植物细 胞表面 。另一方面 VirA 作为受体蛋白接受酚类诱导 物 , 自身磷酸化并激活 Vir G 蛋白 , Vir G 蛋白是一种 DNA 转录活化因子 , 被激活后可以特异性结合到其它 Vir 基因启动子区上游的 Vir 盒 (Vir box) 的序列 , 启动 这些基因的转录 。
3 转化体的筛选和转基因植株的鉴定
筛选是转化过程的重要部分 。为鉴定受体细胞是 否转化了外源基因 , 应该使外源基因与筛选标记共同 转化受体 。选择标记一般表现为对化学试剂的抗性 ,如 抗生素或除草剂 , 可抑制不同细胞的功能 。标记基因
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潘素君等 :农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用
2 农杆菌介导转化水稻的影响因素
2. 1 菌株和载体 选取合适的农杆菌菌株和高效的载体系统对转化
至关重要 。目前 ,用于水稻转化的农杆菌菌株较为普遍 的有 A281、A656、LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1。 Hiei [1 ] 等用菌株 LBA4404、EHA101 与载体 p IG121Hm、 p TOK233 做 试 验 , 发 现 在 Tsukinohikari 培 养 基 中 LBA4404(p TOK233) 比 LBA4404 (p IG121Hm) 和 EHA101 (p IG121Hm) 介导转化效果要好 , 在 Koshihikari 培养基 中 LBA4404(pl G121Hm) 最有效 , EHA101(p TOK233) 对 水稻的转化频率最低 。LBA4404(p TOK233) 对爪哇稻转 化频率较高 。比较 LBA4404、EHA105、AGL1 这三种农杆 菌菌株对水稻愈伤组织的转化能力 , EHA105 的转化效 果最好 , LBA4404 次之 , AGL - 1 最差 [2 ,3 ]。李双成 将 [4 ] EHA105 和 AGL1 的菌液按体积 2 ∶1 混合用于共转化 , 表明两者对转化具有协同作用 。 2. 2 转化受体