稀释培养和稀释平板测数法

稀释培养测数法

一、实验目的

通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。

二、实验原理

最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。

MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。

如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；

稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8

重复数 5 5 5 5 5 5

出现生长的管数 5 5 5 4 1 0

根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌数＝17×100 000 = 17×105。即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。

在确定数量指标时，不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可将此数加到前面相邻的第三位数上即可。

如某一微生物生理群稀释培养记录为：

稀释度 lO-1 10-2 10-3 lO-4 10-5 10-6

重复数 4 4 4 4 4 4

出现生长的管数 4 4 3 2 1 0

以上情况，可将最后一个数字加到前一个数字上，即数量指标为“433”，查表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30×102个。按照重复次数的不同，最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表。

应用MPN计数，应注意两点，一是菌液稀释度的选择要合适，其原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。对土壤样品而言，分析每个生理群的微生物需5—7个连续稀释液分别接种，微生物类群不同，其起始稀释度不同(见附表1)；二是每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般2—5个重复，个别也有采用2个重复的，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确。不同的重复次数应按其相应的最大或然数表计算结果。

若要求出土样中每克干土所含的活菌数，则要将前述两例中所得的每毫升菌数除以干土在土样中所占的质量分数（烘干后的土样质量／原始土样的质量）。

计算式为：

三、实验器材

1. 土壤样品：肥沃菜园土

2. 培养基：阿须贝（Ashby）无氮培养液(附录三、15)22管(每管装5ml，加1cm×4.5cm滤纸l 条)

3. 器材：90ml无菌水（装入250 ml三角瓶中，并装有15—20个玻璃珠）、9ml无菌水、lml 刻度无菌吸管、试管架、记号笔。

四、实验方法

1．称取10克土样，放入90ml无菌水中，振荡20min，让菌充分分散，然后按十倍稀释法将供试土样制成10-1—10-6的土壤稀释液。

2．将22支装有Ashby无氮培养液的试管按纵4横5的方阵排列于试管架上，第一纵列的4支试管上标以10-2，第二纵列的4支试管上标以10-3……第五纵列的4支管上际以10-6（即采用5个稀释度，4个重复），另外2支试管留作对照。

3．用lml无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6的土壤稀释液各lml放入编号10-6的4支试管中，再吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的4支试管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀释液各lml放入各自对应编号的试管中。对照管不加稀释液。

3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。

四、实验方法

1．样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）。

图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养

用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-7、10-8、10-9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10-4、10-5、10-6稀释度，测定放线菌数量时，采用l0-3、10-4、10-5稀释度，测定真菌数量时，采用10-2、10-3、10-4稀释度。

2．平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。

（1）混合平板培养法将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2)，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。