大鼠灌注固定取脑,解剖取材

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大鼠灌注固定的方法

大鼠灌注固定的方法大鼠灌注固定是一种用于研究大鼠生理和药理学的常见实验方法。

它可以用于评估药物的药代动力学、药效学和毒理学，并用于研究器官功能和疾病模型。

在进行大鼠灌注固定实验之前，需要仔细准备并按照以下步骤进行操作。

1.前期准备：- 选择适合实验目的的动物品种，通常是Sprague Dawley大鼠。

-清洁并消毒手术工具、试剂和仪器。

-准备一个有固定台架和支撑物的工作台，以便于操作。

2.动物处理：-使用静脉麻醉剂如七氟烷麻醉大鼠，确保其无感知和无痛苦。

-在动物体表部位使用剃刀去除毛发，以便于手术操作。

-放置大鼠在手术台上，用皮质骨钳或其他固定工具固定体位。

3.外周血管穿刺：-在大鼠的尾静脉或股静脉使用微注射针或导管进行外周血管穿刺。

通常选择尾静脉作为血液采集和药物给予的通路。

-确保穿刺位置干燥，避免出血和感染。

4.心脏灌注固定：-使用手术剪刀或手术刀在胸部进行中线切口，暴露出心脏。

-使用心脏夹固定心脏，并通过房室瓣作为固定点固定心脏。

-使用注射器注入适量的生理盐水或磷酸盐缓冲液，从主动脉穿刺注射，确保整个循环系统都能被灌注。

-如果需要，可以在注射液中加入药物或药物浓缩液以达到特定的实验目的。

5.清洗循环系统：-使用注射器缓慢注入生理盐水或磷酸盐缓冲液，并通过主动脉灌注整个循环系统。

-可以通过下腔静脉引流口清洗肝脏和肾脏，通过上腔静脉引流口清洗心脏，确保器官内的血液和残留物被冲洗干净。

6.完成实验：-在实验完成后，停止灌注并拔除总动脉穿刺点和外周血管穿刺点的引流器。

-使用生理盐水清洁手术切口，确保干燥和消毒。

-给予大鼠恢复期，通常是放置在恢复笼中，并观察其情况。

大鼠灌注固定是一种常见的实验方法，但它需要仔细的准备和操作。

在进行实验之前，需要评估和控制许多因素，如固定时间、注射液的成分和浓度，以及动物的恢复期。

此外，需要遵守相关的伦理和法律规定，确保动物的福利和保护。

通过正确使用和解释大鼠灌注固定实验的结果，可以为人类疾病的研究和治疗提供重要的信息。

大鼠灌注取脑培训资料

大鼠灌注取脑1.用于常规HE 染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot 和PCR 。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或者其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

1.脑组织较软，且细胞成份不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE 染色后，可去除红细胞背景影响。

1) 麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或者切片.大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4% 多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24 小时。

1.多聚甲醛的配置：普通方法为：4％多聚甲醛PBS 缓冲液配法：称取40g PFA 溶于装有500mlDEPC 水的玻璃容器(烧杯或者烧瓶)中，持续加热磁力搅拌至60 ~ 65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L 的NaOH 值至7.4，使呈清澈状(滴加)，再加入约500ml PBS，充分混匀(在冰浴或者冷水浴中)，可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或者4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS ，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或者温箱密封放置2 天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。

注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。

大鼠灌注固定取脑

大鼠灌注固定取脑大鼠灌注固定取脑准备物品：37℃的温生理盐水500ml、10%的中性甲醛或4%的多聚甲醛固定液500 ml、500 ml的输液瓶2个、输液管2副、三通1个,镊子、剪刀、止血钳各2把、灌注针(将12号注射用针头的针尖掐断磨钝圆、光滑即可)1个、麻醉剂、步骤1)将两个输液瓶中分别装满生理盐水和固定液并将输液管安装在生理盐水瓶上并调整好,使管内没有气泡。

2)将动物麻醉,数分钟后,待动物前后肢放松,即可准备灌注。

3)将已麻醉的动物仰卧在解剖台上,固定四肢,用左手持镊子夹起腹部皮肤,右手持剪刀自腹部剪一小口,由此沿腹中线和胸骨剑突中线向上将皮肤剪至下颌,分离皮下组织,将皮肤翻向两侧,再沿腹中线和胸骨中线向上剪开胸骨,沿膈肌向两侧剪开,并用止血钳将胸骨和胸部的皮肤钳紧,将止血钳翻向外侧以充分暴露心脏。

小心用镊子将心包打开,滴一些生理盐水保持湿润。

4)分离出主动脉,穿一根丝线,准备结扎灌针。

5)将左心室尖用眼科剪刀剪开一小口,将灌注针插入心室并送至主动脉内,用丝线结扎牢固,使之不能退出,打调节阀,灌注生理盐水,灌注时的灌流量约20 ml/分钟。

时,剪开右心耳,使血液排出。

观察肝脏逐渐变为白色为止6)旋转三通使之对准灌注液,开始灌注固定液。

固定液进大鼠血管后,逐渐出现四肢抽动,表明灌注液进入大鼠大脑,待抽动完全停止,全身组织器官变硬后即可取材。

7)取脑：枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨，用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉，用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。

取出的脑在同样固定液中4℃再固定4-6小时。

8)保存或切片注意事项：1、将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键,也是难点。

首先准确找到主动脉,这是此步骤的要点。

可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净,用眼科镊子轻轻夹住心外膜(夹的越少越好,以免影响取材)将心脏向左上方提起,即可看清主动脉,又可使灌注针很容易地插入主动脉内。

鼠类动物的固定(固定器)和灌胃操作说明书

灌胃法
分两步操作（以大小鼠为例）：
（1）固定：（小鼠）右手抓住其尾，放在鼠笼铁纱网上，然后用左手拇指及食指沿其背向前抓住其颈部，并以左手的小拇指和掌部夹住其尾固定在手上；（大鼠）实验者应戴帆布手套，用右手将鼠尾抓住提起，放在粗糙的台面或鼠笼上，抓住鼠尾向后轻拉，左手抓紧两耳和头颈部皮肤，余下三指紧捏鼠背部皮肤，如果大鼠后肢挣扎厉害，可将鼠尾放在小指和无名指之间夹住，将整个鼠固定在左手中；
（2）灌胃：左手固定好动物以后，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力，此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。

一般灌胃针插入小鼠深度为3～4cm，大鼠或豚鼠为4～6cm。

常用灌胃量小鼠为0.2～1ml，大鼠1～4ml，豚鼠1～5ml。

图3 大小鼠的灌胃方法
鼠类动物固定方法（固定器）
以大鼠为例（固定小鼠的操作和大鼠一样）：
第一步：准备好固定器
第二步：将固定器和大鼠平放，动物很容易进入固定器
第三步：动物进入固定器以后，将后端盖上
第四步：将前端盖上，以免大鼠往前跑
第五步：将前端盖往后推，锁紧，固定动物完毕。

第六步：大鼠固定后，可进行尾静脉注射、血压测量等
注意事项：
（1）勿将动物垂直放入，否则动物会抓固定器（如下图所示）
（2）固定鼻锥时保证动物舒适，呼吸顺畅，不会大幅度移动；不能使头部向旁侧弯曲，也不能使动物身体紧贴固定器尾部窗口受到挤压；整个过程保证动物舒适、轻松。

大鼠灌注固定的方法

大、小鼠灌注固定的方法准备物品：1、灌注针（灌注用的针可以是临床上的静脉套管针，便于穿刺）2、医用输液器3、500ml输液用玻璃瓶4、血管钳5、剪刀6、生理盐水7、4%多聚甲醛（4℃）,的PB配制大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，此时注意用血管钳钝性分离心包及周围软组织以便充分暴露心脏。

左手持镊子捏住心脏，右手持套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉。

取出套管针内芯，连接生理盐水，打开输液开关，快速灌注，同时用剪刀在右心耳处剪一小口，待流出的液体无色后（约60ml即可）更换为多聚甲醛。

多聚甲醛灌注速度为先快后慢，快速灌注50ml后放慢速度，缓慢滴注维持即可，每只大鼠约需100ml。

如果多聚甲醛灌注充分，则动物四肢和全身肌肉会不停抽动。

如此灌注约需1小时时间。

充分暴露升主动脉套管针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉1、暴露心脏时要小心，速度要快，但不可损伤心脏及大血管，如果出现血液凝固或大血管损伤，灌流将失败。

2、最好是剖开右心室，但是因为暴露的问题，有误剪到左心室的可能。

相对来说，剪开右心耳更为方便。

我们就是这样做的。

3、灌流的效果：PBS或NS灌流时，血流丰富的脏器如肝脾肾等的颜色会迅速转为灰白，此为灌流正常。

另外，大鼠耳尖，口唇，四肢掌部也会变苍白。

4、PBS或NS灌流需缓慢而持续，防止血液血管内凝固。

有条件的话可加点肝素。

5、先主动脉插管，再右心耳放血，这样插管容易些。

先剪右心耳的话，心脏会瘪下去的。

小鼠灌注固定方法：采用水合氯醛麻醉后剪开胸腔，动作要快，经左心室插入头皮针连接的20mL注射器（头皮针磨钝，从与身体纵轴成45°角的方向进针，针尖插入升主动脉内，可以看见，动作要轻柔），同时剪开右心耳，推入20mL 生理盐水。

推完以后迅速换4 ℃多聚甲醛20 mL，灌完以后取材基本就可以了。

大鼠灌注固定取脑

优点：可用单人用注射器直接完成，不用输液管架，而且平均每只仅需5～10ml固定液，时间也仅为5～10min。
注意事项:1)开胸时不要伤到心脏 2)心脏穿刺最好用留置针,软,不宜穿通室间隔,见血即退针芯.插针部位是心尖部,方向向中线.3)生理盐水冲血管,到右心耳流出无色液体.4)多基甲醛固定成功的表现是SD鼠四肢抽搐.5)先断头再一步一步取脑6)根据你实验设计,需要切片的部位,有重点的取,常见的体表标志是前囟和外耳道.7)去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉.
5 灌流：缓慢灌注PBS 10ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛，多聚甲醛的灌流也同PBS。
6 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。
7 取脑：分离除去后颈部肌肉，用弯镊小心取出脑组织。
8 后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。
3.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的生理盐水，一瓶底部开口，倒出盐水，倒置灌入多聚甲醛，悬挂，输液器链接，远端结一个三通后到一个输液器粗针头端
2. 经心脏行灌注固定：麻醉，剪开胸廓，见到搏动的心脏，心尖插入灌注针头，止血钳固定，剪开右心耳，开放静脉血，首先快速滴入生理盐水100－200ml，再注入4%多聚甲醛300-350ml固定液
大鼠灌注固定取脑科研实验
具体方法：
1. 配好4％多聚甲醛PBS缓冲液，配法：称取40g PFA溶于装有500ml DEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH直至7.0，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

老鼠灌注取脑

3. 用 4%多聚甲醛固定但保存了 2 周才做石蜡切片，不知对免疫组化
有无影响？
答：固定时间过长蛋白多肽链都交连在一起了,抗原性就很弱了，很可能没有阳性结果,抗原修复时一般的修复很难把抗原性恢复. 可能会有影响，但不会太大。固定时间长，抗原修复时间也要长一些。 4.灌注多长时间？灌注液多少？
看了很多经验，每个人的灌注液用量都不一样，灌注速度也能没有很清楚的说法，灌注时间也不确定。我的总结为，还是看灌注成功的标志。现将看到的比较详细的处理方法列出。灌注速度，大家比较公认的是先快后慢。
灌注压过小,不利于灌注液在组织中的灌流,灌注压过大,会造成毛细血管和器官组织的损害,不利于组织切片的观察。一般灌注生理盐水时灌注压在 20 伏左右,快速灌流多聚甲醛时一般在 10 伏左右,待大鼠四肢出现明显抽搐后,再缓慢灌流多聚甲醛 30 min,灌注压一般在 5 伏左右。
大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程： 1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片. 具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛 XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定 24 小时。 Tips： 1.多聚甲醛的配置：
简便方法：先配好 PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置 2 天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。 2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。 3.10％水合氯醛按 4mL/100g 的剂量腹腔注射麻醉动物。 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。 5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入 100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。 6.继续用 4%多聚甲醛灌流 250ml 固定。 7.后固定：灌流后的脑组织置于 4％PFA 置 4 度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。补充：还有一种省时省剂的方法。夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约 100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用 100ml 以下即可。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。

灌注取脑

大鼠灌注取脑流程一、麻醉10%水合氯醛（0.4ml/100g）腹腔注射二、开胸1、沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉。

2、用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏。

三、穿刺将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键，也是难点。

1、首先准确找到主动脉，这是此步骤的要点。

可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净，用眼科镊子轻轻夹住心外膜（夹的越少越好，以免影响取材）将心脏向左上方提起（剪开心包壁层的前壁，暴露升主动脉和肺动脉干的根部）。

2、穿刺之前要用适当大小的血管钳夹住心室以固定心脏，但不要夹得过紧，要让心腔内留有一定的间隙。

用小剪刀在心尖处先剪开一个小口，再插入穿刺针。

3、插入时动作要慢，针尖方向不要偏向右侧，以免刺入右心房，如果感到有阻力，则将针退后、调整方向重新进针，直到进入主动脉，灌注针进入主动脉后可在心脏的上方看到其位置，灌注针进入主动脉的长度最好为3~5毫米，然后用丝线扎紧。

4、灌注针插入成功后，用小剪刀剪开右心耳。

四、灌注1、用量（夹闭腹主动脉）4℃生理盐水（50-100ml/只），4℃的4%多聚甲醛（50-100ml/只）2、速度先快后慢，共用30分钟左右3、成功标志生理盐水：右心耳流出液体血色较浅基本澄清，肺脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。

多聚甲醛：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。

五、取脑1、枕骨大孔处用剪刀横断，小心地于枕骨大孔斜插入剪刀剪开顶骨。

2、用止血钳掰断两边地顶骨，注意嗅球上地顶骨也要仔细去掉。

3、用剪刀于一侧剪断视神经并探到颅底，就可以将整块的脑组织翘起。

六、保存取出的整个脑组织块再置于4%多聚甲醛4℃保存。

大鼠灌注取脑培训资料

大鼠灌注取脑大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。

大鼠灌注取脑

大鼠灌注取脑用途：1。

用于常规HE染色，免疫组化分析.2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3。

不可用于western blot和PCR.4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法.多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留,脑组织是较易软化的组织之一,血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后,取脑操作时,可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP）：流程：1)麻醉2）开胸3）心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5）4％多基甲醛固定6)取脑7）保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上，置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃）XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，后再灌注冰冻（4℃)4％多聚甲醛XmL,断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液.用1.0mol/L的NaOH 值至7。

4,使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法:先配好PBS，称好相应的多聚甲醛,37℃水浴或温箱密封放置2天,就能全溶。

若是很急,55℃水浴一天，期间不时震荡。

注意，4％的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质，避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。

大鼠冰冻切片操作方法

大鼠冰冻切片操作方法
【操作步骤】（含溶液配置）
1．小鼠的灌注固定：动物经麻醉后开胸暴露心脏，经左心室先快速灌注生理盐水(50mL左右)至流出液变清亮，然后换4％多聚甲醛继续灌注大约100ml至组织变硬。

2．取材：小心剥离脑组织，置广口瓶中用4％多聚甲醛后固定12～24h。

3．脱水：将标本移入30%蔗糖溶液（用4％多聚甲醛配制），4℃放置至组织块沉底
4．将少量包埋剂OCT滴加到标本台，放入恒冷箱切片机内至变白，然后取出快速将表面用单面刀片修平。

5．用安全刀片将标本底部修平后迅速粘附于标本台，然后置入-24℃恒冷箱切片机的冷冻台。

待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min。

6．调好切片厚度后开始切片。

如果是采用漂片，切片厚度一般20～30μm，切好的片子可以连续收集也可以每隔5～6片收集一片，移入含4％多聚甲醛的6孔板、24孔板或别的容器。

如果是准备做贴片，片厚一般10μm；可以连续裱片，也可以每隔5片或10片裱一片，贴好后放切片盒，50度左右烤片1小时使其贴牢.
7．将切好的片子放4℃保存备用。

注意事项：
1.做室旁核的话可以将脑袋反过来，在腹侧面，大概切掉视交叉前和下丘脑之后的部分、只保留中间部分然后连续切片就可以了。

如果是漂片，室旁核的部分切不了很多；如果贴片那切出来的要多一点。

做免疫组化的话漂片就可以了。

2.液氮或低温冰箱里的冻存必须要有防冻液，否则必然切片会碎掉。

大鼠灌注取脑

大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定.3.不可用于western blot和PCR。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理:心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象，是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变,从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量.必要性：1。

脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一,血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在,HE染色后,可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程（SOP）:流程：1)麻醉2)开胸3）心脏左心室穿针，剪开右心耳4）生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上，置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏，经左心室插入灌流针并固定，切开右心耳，先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃）XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清，后再灌注冰冻（4℃）4%多聚甲醛XmL,断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips:1。

多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法:称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L的NaOH 值至7.4，使呈清亮状（滴加)，再加入约500ml PBS，充分混匀(在冰浴或冷水浴中）,可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml,室温或4℃保存备用。

简便方法:先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶.若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡.注意，4％的多聚甲醛需临用前配制，配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。

大鼠灌注取脑

大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2。

冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR.4。

如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时,不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果.原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象，是脑组织切片观察的常用方法.多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性:1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一,血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤.3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响.大鼠灌注取脑标准操作规程（SOP):流程：1)麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4）生理盐水冲水 5)4％多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片。

具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上，置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏，经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳，先灌注冰冻无菌生理盐水（4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃）4％多聚甲醛XmL，断头取脑，多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips:1。

多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶)中，持续加热磁力搅拌至60～65℃,使成乳白色悬液。

用1。

0mol/L的NaOH 值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS,充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml,室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急,55℃水浴一天,期间不时震荡。

[医学]大鼠灌注固定取脑,解剖取材

• 2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。
• 3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。
• 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用止血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯 • 剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断 • 膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏， • 直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。
• 5.关于生理盐水的温度的选择，有人认为因为是快速冲刷血管里的血液，低温造成血管收缩，灌注的效果反而没有室温的好。但是用低温的认为，低温有利于组织完整。
• 6.灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。
• 7.去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉。
省时省剂的方法
夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白即可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。
灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬
从小脑处将脑组织向上推起，用小剪刀剪断脑神经
注意事项 • 1.多聚甲醛气味刺激，配置时做好自我保护。 • 2.暴露心脏这一步骤，容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑
突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸”，人工气胸后，肺萎缩，胸腔里的空间增大，提拉剑突后，不容易损伤肺、心及肝脏，出血少。
生理盐水冲洗
4%多基甲醛固定
取脑
保存或切片.
具体过程
大鼠经深度麻醉后胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

灌注取脑实验报告

一、实验目的1. 掌握动物解剖技术，熟悉小鼠心脏灌流及取脑的方法。

2. 了解脑组织在生理学、病理学等研究中的重要性。

3. 提高实验操作技能，培养严谨的科学态度。

二、实验原理灌注取脑实验是研究脑组织生理、生化及病理变化的重要方法。

通过心脏灌流，将生理盐水或特定试剂注入动物体内，达到清除脑组织中的血液、细胞等杂质，便于后续实验研究。

本实验采用小鼠作为实验动物，通过心脏灌流及取脑，获取脑组织样本。

三、实验材料1. 实验动物：成年小鼠2. 仪器：解剖显微镜、手术器械、灌流装置、剪刀、镊子、注射器、注射针、泡沫板、生理盐水、固定液等3. 药品：戊巴比妥钠、肾上腺素、生理盐水、固定液等四、实验步骤1. 麻醉：将小鼠放入戊巴比妥钠溶液中，待小鼠失去意识后，立即用针头固定在泡沫板上。

2. 解剖：扯起小鼠胸部皮肤，用剪刀剪开胸部肌肉，暴露心脏。

3. 心脏灌流：用注射针连接灌流装置，将生理盐水注入小鼠心脏，使血液流向脑部。

4. 取脑：待生理盐水灌流完成后，将小鼠头部朝下，用剪刀剪开颅骨，暴露脑组织。

5. 固定：将脑组织取出，放入固定液中固定，以便后续实验研究。

6. 清洗：将固定好的脑组织用生理盐水清洗，去除杂质。

7. 标本保存：将清洗后的脑组织放入装有固定液的容器中，密封保存。

五、实验结果与分析1. 实验结果：通过心脏灌流及取脑，成功获取了小鼠脑组织样本。

2. 结果分析：本次实验操作规范，脑组织样本质量良好，为后续实验研究提供了有力支持。

六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免损伤脑组织。

2. 灌流速度不宜过快，以免损伤脑组织。

3. 固定液的选择对脑组织样本质量有重要影响，应选用合适的固定液。

4. 实验过程中，应注意动物福利，尽量避免动物痛苦。

七、实验总结本次实验成功进行了小鼠心脏灌流及取脑操作，掌握了动物解剖技术，为后续实验研究奠定了基础。

在实验过程中，我们应注重操作规范，确保实验结果的准确性。

同时，本次实验也使我们认识到动物福利的重要性，为今后实验研究提供了有益经验。

大鼠灌注取脑之欧阳学创编

大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2.冰冻切片可以不做脑组织固定。

3.不可用于western blot和PCR。

4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。

2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1)麻醉2)开胸3)心脏左心室穿针,剪开右心耳4)生理盐水冲水5)4%多基甲醛固定6)取脑7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA 溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L 的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。

注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。

大鼠灌注取脑

大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。

2。

冰冻切片可以不做脑组织固定。

3。

不可用于western blot和PCR。

4。

如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时,不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。

原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。

多聚甲醛使组织蛋白发生交联,以保持蛋白的原位和表面结构不变,从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。

必要性：1。

脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固.2。

经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。

3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。

大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP）：流程：1)麻醉2）开胸3）心脏左心室穿针，剪开右心耳4)生理盐水冲水5）4％多基甲醛固定6）取脑7）保存或切片。

具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定，切开右心耳，先灌注冰冻无菌生理盐水（4℃）XmL,直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻（4℃）4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。

Tips：1。

多聚甲醛的配置:一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器(烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。

用1.0mol/L的NaOH 值至7.4,使呈清亮状（滴加),再加入约500ml PBS,充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。

简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。

若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡.注意，4％的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质，避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。